基于固相萃取和比率荧光传感检测食品中组胺的方法与流程

1.本发明涉及检验检测技术领域，尤其涉及基于固相萃取和比率荧光传感检测食品中组胺的方法。


背景技术：

2.组胺是组氨酸通过组氨酸脱羧酶氧化脱羧形成的一种非挥发性杂环胺，由一个咪唑环和一个氨基通过两个碳原子连接组成。组胺天然存在于水产品、奶酪等食品原料或发酵食品中，低浓度的组胺不会造成健康危害，但是不当的储运或发酵会导致食品中组胺含量剧增，从而导致食用者产生腹泻、头痛和瘙痒等症状。因此世界各地的食品和卫生监管机构都颁布了组胺的限量标准，为适应当今食品的快速流通模式，开发便捷高效的组胺检测方法是十分必要的。
3.目前高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫法、比色法等常规检测方法已被用于对组胺的准确检测，但这些方法多依赖大型仪器，对检测人员具有较高的技术操作要求，大大限制了这些方法的应用。并且，组胺作为一种既无紫外吸收也无自发荧光的小分子物质，往往需要繁琐的样品前处理分离及衍生化或荧光标记以备检测，耗时长，成本高。
4.光学传感器具有简单灵敏、快速可靠和结果可视等优点。中华人民共和国发明专利cn110320199b公开了一种基于sers技术利用au@ag核壳纳米粒子检测鱼肉中组胺的方法，专利cn107421937b公开了一种基于石墨烯量子点的荧光共振能量转移传感器用于组胺检测，专利cn108728080b公开了一种基于花菁荧光团检测组胺的有机化合物及其应用。但是，这些发明中应用的光学材料普遍存在光漂白速率较快、易受背景荧光噪声干扰等缺点，限制了其在光学传感中的功能效果。镧系元素掺杂的上转化纳米材料是一种可将近红外光转化为可见光的反stokes发光材料，无背景干扰，激光器相对廉价，是光学传感的理想探针。随着纳米材料合成技术的发展，可通过调整稀土元素的掺杂实现荧光发射的调节，合成具有多荧光发射峰的上转换纳米材料。因此上转换纳米材料具有比率荧光检测组胺的应用潜力。


技术实现要素：

5.本发明是针对现有技术的缺陷，而提供一种简单快速、准确可靠的基于固相萃取和比率荧光传感检测食品中组胺的方法及其应用，以克服组胺现有光学检测方法存在的组件稳定性差、易受背景干扰以及传感信号强度低等困难，扩展其在食品检测领域的应用；同时使用强阴离子交换固相萃取技术，避免繁琐的衍生化或荧光标记，简化样品前处理，提高检测的选择性，不使用有毒有害的有机溶剂；由于其克服了现有方法的技术不足，利用组胺与偶氮试剂的反应产物和上转换纳米颗粒之间的荧光内滤效应，能够实现利用比率荧光信号对组胺的快速检测，满足对于食品中组胺定量检测的需求。
6.为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现，基于固相萃取和比率荧光传感检测食品中组胺的方法，包括以下步骤：
7.(1)制备亲水性上转换纳米颗粒：
8.(1-1)上转换纳米颗粒制备：采用经典的共沉淀法，将镧系元素的氯化物、油酸和1-十八烯混合，在惰性气体保护、100-250℃条件下剧烈搅拌形成稀土元素油酸盐前体，冷却至不高于60℃；加入含有naoh和nh4f的甲醇溶液，在惰性气体保护下剧烈搅拌反应10-90min，使稀土元素油酸盐前体与氟化物反应成核；除去甲醇后快速升温至250℃以上反应30-240min，使上转换纳米颗粒的晶体生长并形成荧光效率高的六方相晶体，冷却至室温，经分离、洗涤、干燥获得油酸包裹的六方相上转换纳米颗粒；
9.(1-2)上转换纳米颗粒的表面改性：将聚丙烯酸与一缩二乙二醇混合，在惰性气体保护、100-200℃条件下搅拌溶解获得透明均一的溶液，将分散有步骤(1-1)上转换纳米颗粒的有机分散液注入体系，继续升温至200-250℃，剧烈搅拌30-120min，使上转换纳米颗粒表面原有的油酸与溶液中的聚丙烯酸进行现配体交换；冷却、分离、洗涤、干燥获得亲水性上转换纳米颗粒，制得的亲水性上转换纳米颗粒分散于超纯水在0-4℃保存备用。
10.(2)固相萃取分离食品样品中的组胺：
11.取食品样品，加入三氯乙酸溶液，样品均质后调ph，离心保留上清，将上清加至活化的强阴离子交换固相萃取柱上，然后淋洗固相萃取小柱，最后将组胺洗脱并收集。该步骤避免使用有机试剂和液液萃取对组胺分离，高效环保。
12.(3)形成重氮偶联产物：
13.将偶氮试剂甲液和偶氮试剂乙液混合；再将样品溶液、亲水性上转换纳米颗粒分散液、混合的偶氮试剂和na2co3溶液混合，反应5-60min，使待测组胺与偶氮试剂充分反应产生有色的重氮偶联产物；
14.(4)比率荧光法定量检测组胺：
15.上转换纳米颗粒的荧光被重氮偶联产物吸收，由于这种荧光内滤效应，上转换纳米颗粒在近红外光激发下的部分荧光发射峰减弱，而其他荧光发射峰不受影响，产生比率荧光变化，组胺越多，比率荧光值越小，从而达到对食品中组胺快速定量检测的目的。
16.其中，所述步骤(1)中镧系元素氯化物包括ycl3、gdcl3、ybcl3、tmcl3、ndcl3、ercl3、tmcl3、hocl3或其水合物中的三种或三种以上的混合物；优选为ycl3、ybcl3、ercl3或其水合物的混合物，其中y
3
:yb
3
:er
3
的摩尔比为78:20:2；
17.所述步骤(1)中油酸与1-十八烯的体积比为1:1～5，镧系元素氯盐的总物质的量与油酸体积的比为0.05-0.5mol/l；
18.所述步骤(1)中含有naoh和nh4f的甲醇溶液中naoh浓度为0.1-1mol/l，nh4f浓度为0.1-1mol/l，且总镧系元素氯盐、naoh和nh4f的摩尔比为1:1-20:1-20；
19.所述步骤(1)中聚丙烯酸质量与一缩二乙二醇体积的比值为1-50g/l；
20.所述步骤(1)中获得的油酸包裹上转换纳米颗粒粒径小于100nm，可在甲苯、环己烷、己烷等非极性试剂中的一种或几种的混合物中稳定分散，优选环己烷作为分散剂，浓度可配制为0.1-10g/l；
21.所述步骤(2)中强阴离子交换固相萃取柱预先用甲醇、超纯水和ph不小于8的缓冲液淋洗活化，同时调整其中残留流动相的ph至与样品统一，避免组胺损失；
22.所述步骤(2)中食品样品的取样量为5-50g，三氯乙酸浓度为5-20％，食品样品的取样质量与三氯乙酸溶液体积比例为1:1～5；
23.所述步骤(2)中上柱样品液的ph不小于8，使组胺不带电而氨基酸和其他生物胺等干扰物带电；
24.所述步骤(2)中淋洗液ph不小于8，氨基酸和其他生物胺等带电干扰物不在柱上富集从而被除去；
25.所述步骤(2)中组胺洗脱液ph不大于6，使组胺带正电，洗脱组胺并收集；
26.所述步骤(2)中在固相萃取柱上，上样量为1-5ml，淋洗液量为3-12ml，洗脱液量为1-6ml；
27.所述步骤(3)中偶氮试剂甲液、乙液分别为1-10g/l的对硝基苯胺溶液和10-20g/l的亚硝酸钠溶液，两者混合比例为1:1～10，确保偶氮试剂过量使显色反应有效；
28.所述步骤(3)中na2co3溶液浓度为50-200g/l，用于调整条件至碱性确保重氮偶联产物生成，亲水性上转换纳米颗粒分散液浓度为0.1-5mg/ml，防止颗粒聚集沉淀，控制荧光信号稳定，提高检测灵敏度；
29.所述步骤(3)中待测液、na2co3溶液、亲水性上转换纳米颗粒分散液和混合的偶氮试剂体积比为1:1～5:2～4:2～6，优选比例为1:4:2:3，扩大检测线性范围，提高检测灵敏度；
30.所述步骤(4)中可采用980nm或808nm的近红外光作为激发波长，避免背景自发荧光和光散射效应，提供高信噪比，改善灵敏度，测定检测体系的荧光发射光谱，优选980nm作为激发波长；
31.所述步骤(4)中利用荧光内滤效应实现光学信号的转换和放大，可采用490-580nm范围内发射峰值与640-780nm范围内发射峰值的比值作为比率荧光信号，减少背景干扰，提高检测灵敏度，将获得的比率荧光信号值代入标准曲线可计算食品样品中组胺的含量。
32.进一步的，标准曲线：将不同浓度的组胺标准液、na2co3溶液、亲水性上转换纳米颗粒分散液和现配偶氮试剂混合，充分反应后，在980nm激光激发下检测荧光信号，随着组胺浓度的增加，490-580nm范围内信号峰强度明显减弱而640-780nm范围内荧光信号峰几乎无变化，选取比率荧光强度与组胺浓度作标准曲线。标准曲线y＝-0.0016x 0.7795，线性良好(r2＝0.9976)，组胺的检测范围为10-200mg/kg，据iupac法计算检出限达到7.34mg/kg。
33.本发明结合强阴离子交换固相萃取技术和基于上转换纳米颗粒的比率荧光传感，简化样品处理步骤，减少有机溶剂使用，降低背景干扰，增强信号变化，有效提高了组胺检测的选择性和灵敏度，显色速度快，能够实现组胺的定量检测，可作为食品中组胺的快速检测方法应用于食品安全控制。
附图说明
34.图1.本发明样品前处理及组胺检测原理图；
35.图2.本发明上转换纳米颗粒的x射线衍射(xrd)图；
36.图3.本发明亲水性上转换纳米颗粒的透射电镜(tem)图；
37.图4.本发明方法检测组胺，上转换纳米颗粒比率荧光随组胺浓度变化关系。
具体实施方式
38.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施
例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.实施例1：食品样品中组胺检测的回收率和重复性
40.(1)亲水性纳米颗粒的制备
41.(1-1)上转换纳米颗粒制备：取1mmol ycl3、ybcl3、ercl3和6ml油酸、15ml 1-十八烯混合，在氮气保护、170℃条件下剧烈搅拌20min获得透明均一的溶液，冷却至50℃；加入含有0.3g naoh和0.444g nh4f的甲醇溶液，在氮气保护下剧烈搅拌反应90min，再升温至110℃抽真空以除去体系中的甲醇，然后快速升温至300℃反应60min，冷却至室温，体系中加入无水乙醇沉淀颗粒，离心分离，用环己烷乙醇溶液清洗三次、真空干燥获得上转换纳米颗粒；
42.(1-2)亲水性上转换纳米颗粒的制备：将150mg聚丙烯酸与150ml一缩二乙二醇混合，在氮气保护、110℃条件下剧烈搅拌获得透明均一的溶液，将分散有500mg合成的上转换纳米颗粒的环己烷注入体系，继续升温至200℃，剧烈搅拌120min，冷却至室温，体系中加入乙醇沉淀颗粒，离心分离，用乙醇清洗三次，真空干燥获得亲水性上转换纳米颗粒，制得的亲水性上转换纳米颗粒分散于超纯水，于0-4℃保存备用；
43.(2)制备食品样品
44.(2-1)分别取3份质量为10g的新鲜鱼肉样品，未添加标准品的鱼肉样品中未检出组胺，加入不同浓度的组胺储备液，使其组胺含量为50,100,250,500,1000mg/kg，再各加入30ml5％三氯乙酸溶液，样品均质后调ph至8，离心保留上清；
45.(2-2)sax spe活化：取sax spe(500mg，3ml)，依次用6ml甲醇、6ml超纯水和6mlph 8缓冲液冲洗，获得活化的sax spe；
46.(2-3)sax spe分离组胺：取1ml(2-1)中获得的上清加入sax spe，然后用6ml ph 8缓冲液冲洗固相萃取小柱，除去氨基酸和其他生物胺等潜在干扰物，最后用ph 6缓冲液洗脱并收集组胺。
47.(3)偶氮试剂的配制：偶氮试剂甲液为5g/l对硝基苯胺，偶氮试剂乙液为20g/l亚硝酸钠，使用时甲液与乙液的混合比例为1:5(v/v)，现配现用；
48.(4)组胺定量检测：取0.5ml(3)获得的洗脱液与2ml 50g/lna2co3溶液、1ml 1mg/ml亲水性上转换纳米颗粒溶液和1.5ml混合的偶氮试剂混合，反应10min后，在980nm激光激发下检测荧光信号，根据标准曲线和获得的比率荧光强度i
548/664
计算组胺含量。
49.其中，标准曲线：将0.5ml不同浓度的组胺标准液(10-200mg/l)、2ml 100g/lna2co3溶液、1ml 0.5mg/ml亲水性上转换纳米颗粒溶液和1.5ml混合的偶氮试剂混合，反应10min后，在980nm激光激发下检测荧光信号，在410nm、548nm和664nm处存在荧光信号峰，随着组胺浓度的增加，410nm和548nm处信号峰强度明显减弱而664nm处荧光信号峰几乎无变化，选取比率荧光强度i
548/664
与组胺浓度作标准曲线；以上转换纳米颗粒的比率荧光i
548/664
与组胺浓度作标准曲线y＝-0.0016x 0.7795，线性良好(r2＝0.9976)，组胺的检测范围为10-200mg/kg。
50.(7)检测结果如下表所示，回收率良好，重复性好，说明本检测方法受食品中复杂物质的干扰较小，具有灵敏度高，特异性好，操作简单快捷等特点，能够实现食品样品中组
1-十八烯混合，在氮气保护、120℃条件下剧烈搅拌20min获得透明均一的溶液，冷却至40℃；加入含有0.2g naoh和0.74g nh4f的甲醇溶液，在氮气保护下剧烈搅拌反应10min，再升温至180℃抽真空以除去体系中的甲醇，然后快速升温至320℃反应30min，冷却至室温，体系中加入无水乙醇沉淀颗粒，离心分离，用环己烷乙醇溶液清洗三次、冷冻干燥获得上转换纳米颗粒；
65.(1-2)亲水性上转换纳米颗粒的制备：将200mg聚丙烯酸与50ml一缩二乙二醇混合，在氮气保护、100℃条件下剧烈搅拌获得透明均一的溶液，将分散有200mg合成的上转换纳米颗粒的甲苯注入体系，继续升温至250℃，剧烈搅拌60min，冷却至室温，体系中加入乙醇沉淀颗粒，离心分离，用乙醇清洗三次，冷冻干燥获得亲水性上转换纳米颗粒，制得的亲水性上转换纳米颗粒分散于超纯水，于0-4℃保存备用；
66.(2)处理三文鱼罐头样品
67.(2-1)食品样品处理：分别取3份质量为10g的三文鱼罐头样品，再各加入50ml 5％三氯乙酸溶液，样品均质后调ph至10，离心保留上清；
68.(2-2)sax spe活化：取sax spe(500mg，6ml)，依次用6ml甲醇、6ml超纯水和6ml ph 9缓冲液冲洗，获得活化的sax spe；
69.(2-3)sax spe分离组胺：取1ml(1)中获得的上清加入sax spe，然后用6ml ph 9缓冲液冲洗固相萃取柱，最后用ph 4缓冲液洗脱并收集组胺。
70.(3)偶氮试剂的配制：偶氮试剂甲液为10g/l对硝基苯胺，偶氮试剂乙液为20g/l亚硝酸钠，使用时甲液与乙液的混合比例为1:10(v/v)，现配现用；
71.(4)组胺定量检测：取0.5ml4.(3)获得的洗脱液与2.5ml 50g/l na2co3溶液、1ml 2mg/ml亲水性上转换纳米颗粒分散液和1ml混合的偶氮试剂混合，反应15min后，在980nm激光激发下检测荧光信号，根据标准曲线和获得的比率荧光强度i
580/780
计算三文鱼罐头样品中组胺含量为643.17
±
35.78mg/kg。
72.实施例4：基于固相萃取和比率荧光传感检测虾中组胺的方法，包括以下步骤：
73.(1)亲水性纳米颗粒的制备
74.(1-1)上转换纳米颗粒制备：取3mmol gdcl3、ybcl3·
6h2o、ercl3和6ml油酸、18ml 1-十八烯混合，在氩气保护、150℃条件下剧烈搅拌30min获得透明均一的溶液，冷却至50℃；加入含有0.8g naoh和0.7gnh4f的甲醇溶液，在氩气保护下剧烈搅拌反应30min，再升温至150℃抽真空以除去体系中的甲醇，然后快速升温至280℃反应180min，冷却至室温，体系中加入无水乙醇沉淀颗粒，离心分离，用环己烷乙醇溶液清洗三次、真空干燥获得上转换纳米颗粒；
75.(1-2)亲水性上转换纳米颗粒的制备：将500mg聚丙烯酸与10ml一缩二乙二醇混合，在氩气保护、200℃条件下剧烈搅拌获得透明均一的溶液，将分散有250mg合成的上转换纳米颗粒的环己烷注入体系，继续升温至220℃，剧烈搅拌30min，冷却至室温，体系中加入乙醇沉淀颗粒，离心分离，用乙醇清洗三次，冷冻干燥获得亲水性上转换纳米颗粒，制得的亲水性上转换纳米颗粒分散于超纯水，于0-4℃保存备用；
76.(2)处理虾样品
77.(2-1)食品样品处理：分别取5份质量为15g的不同新鲜程度的虾样品，再各加入30ml 10％三氯乙酸溶液，样品均质后调ph至8.5，离心保留上清；
78.(2-2)sax spe活化：取sax spe(500mg，3ml)，依次用6ml甲醇、6ml超纯水和6ml ph 8.5缓冲液冲洗，获得活化的sax spe；
79.(2-3)sax spe分离组胺：取1ml(1)中获得的上清加入sax spe，然后用6mlph 8.5缓冲液冲洗固相萃取柱，最后用ph 4.5缓冲液洗脱并收集组胺。
80.(3)偶氮试剂的配制：偶氮试剂甲液为5g/l对硝基苯胺，偶氮试剂乙液为10g/l亚硝酸钠，使用时甲液与乙液的混合比例为1:4(v/v)，现配现用；
81.(4)组胺定量检测：取1ml4.(3)获得的洗脱液与4ml 100g/l na2co3溶液、2ml 2.5mg/ml亲水性上转换纳米颗粒分散液和3ml混合的偶氮试剂混合，反应15min后，在880nm激光激发下检测荧光信号，根据标准曲线和获得的比率荧光强度i
550/665
计算虾样品中组胺含量为16.82
±
1.00mg/kg。
82.实施例5：基于固相萃取和比率荧光传感检测红酒中组胺的方法，包括以下步骤：
83.(1)亲水性纳米颗粒的制备
84.(1-1)上转换纳米颗粒制备：取3mmol ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o、ercl3和5ml油酸、25ml 1-十八烯混合，在氩气保护、150℃条件下剧烈搅拌20min获得透明均一的溶液，冷却至50℃；加入含有0.5g naoh和0.6g nh4f的甲醇溶液，在氩气保护下剧烈搅拌反应60min，再升温至130℃抽真空以除去体系中的甲醇，然后快速升温至310℃反应60min，冷却至室温，体系中加入无水乙醇沉淀颗粒，离心分离，用环己烷乙醇溶液清洗三次、冷冻干燥获得上转换纳米颗粒；
85.(1-2)亲水性上转换纳米颗粒的制备：将1000mg聚丙烯酸与50ml一缩二乙二醇混合，在氩气保护、150℃条件下剧烈搅拌获得透明均一的溶液，将分散有500mg合成的上转换纳米颗粒的环己烷注入体系，继续升温至225℃，剧烈搅拌60min，冷却至室温，体系中加入乙醇沉淀颗粒，离心分离，用乙醇清洗三次，真空干燥获得亲水性上转换纳米颗粒，制得的亲水性上转换纳米颗粒分散于超纯水，于0-4℃保存备用；
86.(2)处理红酒样品
87.(2-1)食品样品处理：分别取5份质量为10g的红酒样品，再各加入10ml 10％三氯乙酸溶液，样品均质后调ph至9，离心保留上清；
88.(2-2)sax spe活化：取sax spe(1000mg，6ml)，依次用6ml甲醇、6ml超纯水和6ml ph 9缓冲液冲洗，获得活化的sax spe；
89.(2-3)sax spe分离组胺：取3ml(1)中获得的上清加入sax spe，然后用6ml ph 9缓冲液冲洗固相萃取柱，最后用ph 5缓冲液洗脱并收集组胺。
90.(3)偶氮试剂的配制：偶氮试剂甲液为10g/l对硝基苯胺，偶氮试剂乙液为15g/l亚硝酸钠，使用时甲液与乙液的混合比例为1:6(v/v)，现配现用；
91.(4)组胺定量检测：取0.5ml4.(3)获得的洗脱液与1ml 100g/l na2co3溶液、2ml 1mg/ml亲水性上转换纳米颗粒分散液和1.5ml混合的偶氮试剂混合，反应30min后，在980nm激光激发下检测荧光信号，根据标准曲线和获得的比率荧光强度i
548/660
计算红酒样品中组胺含量为123.05
±
6.32mg/kg。
92.实施例6：基于固相萃取和比率荧光传感检测奶酪中组胺的方法，包括以下步骤：
93.(1)亲水性纳米颗粒的制备
94.(1-1)上转换纳米颗粒制备：取1mmol gdcl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o、ercl3·
6h2o和
10ml油酸、10ml 1-十八烯混合，在氮气保护、200℃条件下剧烈搅拌30min获得透明均一的溶液，冷却至室温；加入含有0.5gnaoh和0.74g nh4f的甲醇溶液，在氮气保护下剧烈搅拌反应90min，再升温至150℃抽真空以除去体系中的甲醇，然后快速升温至290℃反应120min，冷却至室温，体系中加入无水乙醇沉淀颗粒，离心分离，用环己烷乙醇溶液清洗三次、真空干燥获得上转换纳米颗粒；
95.(1-2)亲水性上转换纳米颗粒的制备：将300mg聚丙烯酸与10ml一缩二乙二醇混合，在氮气保护、200℃条件下剧烈搅拌获得透明均一的溶液，将分散有100mg合成的上转换纳米颗粒的甲苯注入体系，继续升温至250℃，剧烈搅拌60min，冷却至室温，体系中加入乙醇沉淀颗粒，离心分离，用乙醇清洗三次，冷冻干燥获得亲水性上转换纳米颗粒，制得的亲水性上转换纳米颗粒分散于超纯水，于0-4℃保存备用；
96.(2)处理奶酪样品
97.(2-1)食品样品处理：分别取3份质量为5g的奶酪样品，再各加入15ml 5％三氯乙酸溶液，样品均质后离心保留上清，调ph至9.5，再次离心保留上清；
98.(2-2)sax spe活化：取sax spe(2000mg，12ml)，依次用12ml甲醇、12ml超纯水和12mlph 9.5缓冲液冲洗，获得活化的sax spe；
99.(2-3)sax spe分离组胺：取5ml(1)中获得的上清加入sax spe，然后用12ml ph 9.5缓冲液冲洗固相萃取柱，最后用ph 5缓冲液洗脱并收集组胺。
100.(3)偶氮试剂的配制：偶氮试剂甲液为7.5g/l对硝基苯胺，偶氮试剂乙液为15g/l亚硝酸钠，使用时甲液与乙液的混合比例为1:10(v/v)，现配现用；
101.(4)组胺定量检测：取0.5ml4.(3)获得的洗脱液与1ml 200g/l na2co3溶液、1.5ml 5mg/ml亲水性上转换纳米颗粒分散液和2ml混合的偶氮试剂混合，反应60min后，在880nm激光激发下检测荧光信号，根据标准曲线和获得的比率荧光强度i
560/665
计算奶酪样品中组胺含量为48.43
±
2.41mg/kg。
102.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。