一种水果蔬菜中对苯基苯酚高效液相色谱法快速测定方法与流程

1.本发明属于食品检测领域，具体涉及一种水果蔬菜中对苯基苯酚高效液相色谱法快速测定方法。


背景技术：

2.对苯基苯酚（p-phenylphenol，4-pp），又称4-苯基苯酚，具有致癌和内分泌干扰作用，是重要的有机化工原料及中间体，广泛应用于染料、防腐杀菌剂、农药、涂料等领域。对苯基苯酚与其异构体邻苯基苯酚（2-pp）一样有杀菌作用，被用于果蔬的防霉和杀菌，采用喷雾法在收获后的柑桔上使用可使腐烂降至最低限度，保持新鲜和较好的成色。邻苯基苯酚为中毒农药（口服小鼠半数致死量（ld50）为1050 mg/kg，而对苯基苯酚为高毒物质，其腹腔小鼠半数致死量（ld50）为150 mg/kg。此外，对苯基苯酚具有一定的生物毒性，对肝肾、神经等系统产生毒性，给人们的身体带来巨大的危害。gb 2760-2011规定对苯基苯酚残留量不大于12 mg/kg，考虑其无食品工艺必要性，gb 2760-2014删除了对苯基苯酚和邻苯基苯酚两种防腐剂。邻苯基苯酚作为杀菌剂在gb 2763-2019和日本肯定列表均有相关规定，而对对苯基苯酚没有相关规定，农业行业标准 ny/t 392-2013《绿色食品食品添加剂使用准则》要求不应使用对苯基苯酚和邻苯基苯酚两种防腐剂。《食品安全法》规定，禁止生产经营用非食品原料生产的食品或者添加食品添加剂以外的化学物质和其他可能危害人体健康物质的食品，生产经营的食品中不得添加药品，因此对苯基苯酚不能在食品任何环节合法使用。但是有文献报道在柑橘中检出对苯基苯酚高达14.7 mg/kg，可见对苯基苯酚存在被用于蔬菜水果防腐的问题。目前果蔬中对苯基苯酚的检测尚无方法标准，使得对苯基苯酚处于无监管的状态，存在较高的食品安全风险。
3.目前研究主要集中于对果蔬中邻苯基苯酚的检测，水果蔬菜中对苯基苯酚残留量有少量报道。目前检测方法主要有高效液相色谱法，气相色谱法-质谱法。高效液相色谱法具有普及率高、定量准确、灵敏度高、兼容性好等特点，是食品检测中常用的检测手段。相对于气相色谱法，高效液相色谱法优势在较低温度下能将对苯基苯酚与各种干扰物分离开，获得高灵敏度、高准确度和低检出限。果蔬中农药残留类化合物常见前处理技术有液液萃取法、固相萃取法、quechers方法等。quechers方法作为农药残留检测较为成熟的前处理方法，其主流提取体系主要有aoac体系和欧盟en体系，根据目标物和基质特点选择不同的提取体系。与quechers方法提取原理相同的盐析辅助液液微萃取，是指在液液微萃取均相乳浊液体系(水/分散剂/萃取剂)中加入无机盐(如nacl)，由于目标物在有机相和水相中的分配系数不同，盐的加入增加了水相的离子强度，降低目标物在水中的溶解度，增大目标物在有机相中的分配系数，目标物被提取富集到有机相，从而提高提取效率。该前处理技术已经广泛应用于蔬菜和水果等基质中农药残留的检测。


技术实现要素：

4.鉴于对苯基苯酚存在同分异构体，需要在色谱上实现完全分离才能准确定性定
量。针对目标物特殊的性质，优化色谱和前处理条件，在色谱上实现对苯基苯酚与邻苯基苯酚、间苯基苯酚（3-pp）的完全分离。本发明基于盐析辅助均相液液萃取前处理方法，利用高效液相色谱二极管阵列串联荧光检测器，建立一种水果蔬菜中对苯基苯酚高效液相色谱法快速检测方法。该方法快速简单、准确性好、重现性高，适用于蔬菜水果中对苯基苯酚的快速检测，为保障农产品质量安全提供技术参考。
5.本发明的目的在于提供一种水果蔬菜中对苯基苯酚高效液相色谱法快速测定方法。该方法能够实现对苯基苯酚、间苯基苯酚、邻苯基苯酚三种异构体的有效分离，利用二极管阵列串联荧光的方法提高定性准确性和灵敏度，避免在检测中假阳性的出现，能用于大批量蔬菜水果中非法添加对苯基苯酚及其同分异构体的含量检测。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：一种水果蔬菜中对苯基苯酚高效液相色谱法快速测定方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）样品前处理：称取均质后的样品，加入氯化钠和乙腈，涡旋混匀，超声提取，离心后取上层清液过滤膜，待上机；（2）制备标准工作溶液：准确称取10 mg对苯基苯酚标准品于，用甲醇溶解，并定容至刻度，配制得到1 mg/ml的标准物质储备液，冷藏（4～8℃）保存。移取适量储备液，用甲醇逐级稀释，得到需要的工作溶液。
7.（3）样品分析检测：将待测液用高效液相色谱仪进行检测。
8.（4） 结果处理：将待测液经高效液相色谱-二极管阵列串联荧光检测器检测，获得对苯基苯酚的色谱图，以保留时间和特征光谱吸收进行定性分析，以色谱图的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，根据质量浓度与色谱峰面积响应绘制标准曲线和计算回归方程，计算对苯基苯酚的浓度。
9.进一步的，步骤（1）具体为：称取均质后的样品10 g（0.01g）于50 ml离心管中，加入2 g氯化钠，20 ml乙腈，涡旋混匀1min，超声提取10 min，以5000 r/min 离心3min，取上层清液过0.22μm的有机相微孔滤膜，待上机。其中，所述的盐析辅助均相液液萃取的提取溶剂为乙腈。所述的盐析辅助均相液液萃取的提取盐体系为氯化钠-乙腈。
10.优选地，色谱分离柱为混合型五氟苯基色谱柱ace excel 3 c
18-pfp（150 mm
ꢀ×ꢀ
4.6 mm，5μm），流动相为a水，b甲醇。流速为0.8 ml/min；柱温为35℃；进样体积为10 μl。
11.梯度洗脱程序见表：
优选地，检测器为二极管阵列串联荧光检测器，二极管阵列检测波长258 nm，荧光激发波长258 nm，发射波长350 nm。
12.本发明建立了一种水果蔬菜中对苯基苯酚高效液相色谱法快速测定方法。样品经乙腈提取，氯化钠盐析分层，以混合五氟苯基柱为色谱分离柱，甲醇-水为流动相梯度洗脱，二极管阵列检测器串联荧光检测器，外标法定量。结果表明，二极管阵列和荧光检测器两种方法分别在0.05～100 ug/ml，0.01～5 ug/ml范围内线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.999，检出限分别为0.03 mg/kg和0.01 mg/kg，定量限分别为0.1 mg/kg和0.02 mg/kg。在三个空白添加浓度水平（loq、2loq和10loq）下，平均回收率在82.28～109.33%范围内，相对标准偏差（rsd）为2.40～5.72%。本发明可以实现对苯基苯酚、邻苯基苯酚和间苯基苯酚的完全分离，克服了假阳性的可能性，提高了定性定量能力。该方法前处理简便、准确度好，重现性好，适用于蔬菜水果中对苯基苯酚残留的快速测定。
13.有益效果本发明首次建立了适用于水果蔬菜中对苯基苯酚的基于盐析辅助均相液液萃取的高效液相色谱-二极管阵列串联荧光检测器测定方法。本发明实现对苯基苯酚、邻苯基苯酚和间苯基苯酚的完全分离，克服了假阳性的可能性，提高了定性定量能力。本发明利用二极管阵列串联荧光检测器测定方法，提高了定性能力和灵敏度，方法线性范围宽，可以满足不同实验室配置需求。本发明方法简单，检测效率高，且检测成本大大降低。本发明对保障农产品中非法添加对苯基苯酚及其同分异构体的检测均具有重要意义。
附图说明
14.图1 pfp色谱柱对三种同分异构体分离效果色谱图(10 ug/ml)。
15.图2普通c18色谱柱分离效果色谱图比较 (4-pp 单标和三种同分异构体混标10 ng/ml)。
16.图3不同提取试剂对对苯基苯酚的回收率影响。
17.图4不同提取溶液色谱图干扰比较（0.1 mg/kg, a乙腈，b乙酸乙酯）。
18.图5对苯基苯酚标准溶液色谱图、空白苹果色谱图、苹果样品加标色谱图。
具体实施方式
19.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
20.实施例11实验部分1.1材料与试剂对苯基苯酚标准品、邻苯基苯酚标准品、间苯基苯酚标准品，纯度≥99%，德国dr.ehrenstorfer gmbh公司；xbridge c
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色谱柱（150 mm
×
4.6 mm，3.5
ꢀµ
m）美国waters公司），atlantis t3色谱柱（250 mm
ꢀ×ꢀ
4.6 mm，5μm）美国waters公司；inertsil ods-c
18
色谱柱（250 mm
ꢀ×ꢀ
4.6 mm，5μm）岛津公司；ace excel 3 c
18-pfp（150 mm
ꢀ×ꢀ
4.6 mm，5μm）；甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯（色谱纯），德国merck公司，纯度》99.9%。氯化钠，乙酸铵，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，磷酸，硫酸镁，乙酸钠，柠檬酸氢二钠、柠檬酸钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。实验用水果、蔬菜样品均为市售。
21.仪器与设备waters 2695高效液相色谱仪(配备waters 2998二极管阵列检测器)，美国waters公司；ab204-s型电子天平，瑞士mettler toledo公司；sb-800dtd型超声波清洗器，中国宁波新芝生物科技股份有限公司；3-18k型冷冻离心机，德国sigma公司；milli-q超纯水制备器，美国millipore公司；涡旋混合器，德国ika公司。
22.标准溶液的配制准确称取10 mg（精确至0.01 mg）对苯基苯酚标准品于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，配制得到1 mg/ml的标准物质储备液，冷藏（4～8℃）保存。移取适量储备液，用甲醇逐级稀释，得到需要的工作溶液。
23.样品前处理称取均质后的样品10 g（0.01g）于50 ml离心管中，加入2 g氯化钠，20 ml乙腈，涡旋混匀1min，超声提取10 min，以5000 r/min 离心3min，取上层清液过0.22μm的有机相微孔滤膜，待上机。
24.仪器条件色谱柱：ace excel 3 c
18-pfp（150 mm
ꢀ×ꢀ
4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇b：水a，梯度洗脱，洗脱程序见表1。流速为0.8 ml/min；柱温为35℃；进样体积为10 μl，pda检测波长258 nm，荧光激发波长258 nm，发射波长350 nm。
25.表1梯度洗脱程序
2结果与讨论2.1 仪器条件优化2.1.1色谱柱的选择本实验分别比较三种不同品牌的常规c
18
色谱柱（xbridge c
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、atlantis t3、inertsil ods-c
18
）柱和五氟苯基色谱柱c
18-pfp对对苯基苯酚及其同分异构体的保留行为和分离能力。实验发现在常规c
18
色谱柱上三种同分异构体完全不能分离，严重影响非法添加物对苯基苯酚的定性定量。而c
18-pfp对对苯基苯酚的保留性、灵敏度表现出明显优势，由于pfp色谱柱表面键合着五氟苯基，有较强的几何尺寸和立体形状选择性，选择合适流动相，通过适当的梯度洗脱，可以有效将对苯基苯酚、间苯基苯酚和邻苯基苯酚结构相似的位置异构体分离开来，得到较好的分离效果和色谱峰形。故本实验最后选择c
18-pfp作为分离色谱柱。
26.2.1.2 检测波长的选择用二极管阵列检测器对标准溶液分别进行波长扫描，对苯基苯酚标准品在 258 nm 波长处有较大吸收，因此选择 258 nm 作为pda检测器的检测波长及荧光检测器的激发波长。通过对发射波长进行扫描，发现在350 nm处吸收强度最大，将350 nm作为对苯基苯酚的发射波长。
27.2.1.3 流动相的选择分别对甲醇-水、甲醇-乙酸铵（20 mmol/l）缓冲液、甲醇-磷酸水(0.1%)、甲醇 20mmol/l磷酸缓冲盐(ph=8)四种流动相体系进行考察，结果表明在c18-pfp色谱柱上这几种流动相的分离效果无大的差别，甲醇-水为流动相即可通过梯度洗脱程序选择和优化，较好地完成三种同分异构体分离和较好的保留。由于邻苯基苯酚的邻位容易与氢离子形成氢键等化学作用力，极性最大，出峰时间最早，而对苯基苯酚的极性相对最小，出峰时间最晚。
28.前处理条件优化2.2.1提取溶液的优化对苯基苯酚水溶性差，易溶于醇、酮、醚等有机溶剂，本实验以白菜和苹果样品为例，分别比较乙腈、正己烷、乙酸乙酯、乙醚几种提取溶剂对对苯基苯酚的提取效率。实验结果发现，非极性溶剂正己烷和乙醚对苯基苯酚提取效率差，回收率在50～70%之间，且乙醚提取液在目标物保留时间附近有干扰。乙腈和乙酸乙酯对目标物提取效果较好，提取效率
均在90%以上，但乙酸乙酯提取液不清澈，在色谱目标峰处存在干扰，影响准确定量，且乙酸乙酯不能直接进入反相液相系统。乙腈提取效率最好且共提取干扰少，溶剂不易挥发，考虑后续盐析操作及绿色环保因素，本方法选择乙腈作为提取试剂。
29.2.2.2提取盐体系的选择本实验主要比较常用的几种提取盐：氯化钠-乙腈(盐析辅助均相液液萃取)，6g无水硫酸镁-1.5g乙酸钠-乙腈(quechers-aoac提取包)、4g无水硫酸镁-1g氯化钠、0.5g柠檬酸氢二钠、1g柠檬酸钠-乙腈(quechers-en提取包)。实验结果表明，与quechers经典的两种提取体系相比，氯化钠-乙腈体系提取效率较好差别不大。主要原因可能是对于对苯基苯酚其分子性较离子性强，受溶液ph影响小，在加入氯化钠后乙腈与样品溶液分层良好，目标物进入乙腈层，提取效率较好。综合考虑，最终选择盐析辅助均相液液萃取提取体系。
30.2.2.3净化方式的选择蔬菜、水果等食品的基质复杂，干扰杂质多，因此在仪器分析前需要对果蔬样品进行必要的净化处理，降低基体带来的干扰以及对仪器的损害，也从而提升方法的灵敏度、准确度。本实验选择基质较为复杂的韭菜和橙子基质为例，比较不净化、分散固相萃取净化包1（50 mg psa, 50 mg c
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，10 mg gcb，150 mg mgso4）和分散固相萃取净化包1净化包2（150 mg psa, 150 mg c
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，900 mg mgso4）对不同水果蔬菜样品中对苯基苯酚的净化效果。实验结果发现，经盐析辅助均相液液萃取提取体系后复杂蔬菜水果基质的共提取物在目标峰处无干扰，回收率及色谱干扰同两种净化包差别不大。因此本实验不采用分散固相萃取等净化步骤，即盐析辅助均相液液萃取提取后不净化，不仅节约成本，还提高检测效率。
31.2.2.4浓缩过程的考察浓缩是前处理中常见的实验环节，有提高分析灵敏度或更改溶剂等作用。氮吹浓缩是常用的浓缩方式，但此过程可能会存在目标物损失的现象。分别选取对苯基苯酚的标准溶液、试剂加标溶液和苹果样品加标溶液进行氮吹浓缩考察，比较相同温度和不同温度下目标物氮吹前后响应值的变化。在温度40℃下的氮吹后，试剂标样的响应值降低15%，试剂加标的响应值降低10%以上，样品加标的响应降低更多，损失接近35%。降低温度至30℃后目标物仍存在损失问题。推测原因可能是小分子低极性的对苯基苯酚容易在氮吹过程中目标物发生变化或者损失。因此本实验不采用氮吹浓缩步骤。
32.2.2.5目标物稳定性考察配制1.00 mg/ml标准储备液，冷藏（4～8℃）保存。分别于3d，5d、7d、14d和21d移取1ml稀释至100 ug/ml上机测定，已稀释当天新配制的标准溶液为基准测算储备液的浓度，不同天数后对苯基苯酚含量占储备液配制当天含量的百分比。两周甚至一个月内稳定性几乎没有变化，半年时间过后，对苯基苯酚的响应值提高，考虑可能由于甲醇具有挥发性，部分甲醇挥发导致溶质浓度偏高些，但最高也在5%以内。在综合来看，对苯基苯酚在冷藏储存条件下比较稳定。
33.方法学考察2.3.1 检出限和线性范围在优化好的色谱条件下对质量浓度为 0.02 μg/ml，0.05 μg/ml，0.1 μg/ml，0.5 μg/ml，1 μg/ml，5 μg/ml，10 μg/ml，50 μg/ml，100 μg/ml的标准溶液进行测定，以峰面积为纵坐标（y），质量浓度(x, μg/ml)为横坐标，根据质量浓度与色谱峰面积响应绘制标准曲
线和计算回归方程及其相关系数。结果表明：高效液相色谱二极管阵列和荧光两种检测器的线性方程、及相关系数（r2）及检出限、定量限见表2，这两种检测器在各自的线性范围内线性良好，r2＞0.999。采用空白基质加标的方法，以信噪比s/n=10得到目标物的定量限(loq)为0.1 mg/kg和0.02 mg/kg，以信噪比s/n=3得到目标物的检出限(lod)为0.03 mg/kg和0.01 mg/kg。相同浓度的对苯基苯酚，其荧光信号响应比紫外高150多倍，使用荧光检测器的灵敏度更高，检出限更低。
34.表2 紫外和荧光检测器的线性方程、相关系数、检出限和定量限2.3.2 方法回收率和精密度选取苹果和白菜样品基质，分别加入一定量的对苯基苯酚标准溶液，添加量分别为方法定量限、2倍定量限和10倍定量限，每个水平平行测定6次，考察高效液相色谱分别在二极管阵列和荧光检测器测定的加标回收率和精密度，结果见如表3所示。pda检测中对苯基苯酚的加标回收率为82.28%～109.33%，相对标准偏差（rsd）为2.60%～5.72%；荧光检测中对苯基苯酚的加标回收率为85.51%～107.71%，相对标准偏差（rsd）为2.40%～5.22%，结果表明这两种检测器方法的回收率和精密度均满足要求。
35.表3苹果和白菜样品中对苯基苯酚的加标回收率和精密度
2.3.3方法特异性为考察方法的特异性,分别用空白样品、空白样品加标和对苯基苯酚标准溶液，在相同的前处理和色谱条件下。对苯基苯酚出峰位置没有明显的干扰，鉴于对苯基苯酚存在同分异构体，需要在色谱上实现完全分离才能准确定性定量，因此我们针对这一特殊的性质，进而考察了对苯基苯酚的同分异构体邻苯基苯酚和间苯基苯酚对对苯基苯酚的干扰情况，在本实验建立的仪器方法和前处理条件下，这三者均能够有效的分离开来。因此，该方法的特异性较好，能够有效避免复杂样品中假阳性问题。
36.实际样品测定应用本实验建立的方法对市售的苹果、梨、香蕉、黄瓜、白菜、菠菜、韭菜及橙子等50批次水果蔬菜样品进行测定，未发现对苯基苯酚阳性样品。
37.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。