一种测定特殊医学配方食品中20种游离氨基酸和L-羟脯氨酸的方法与流程

一种测定特殊医学配方食品中20种游离氨基酸和l-羟脯氨酸的方法
技术领域
1.本发明涉及一种测定特殊医学配方食品中20种游离氨基酸和l-羟脯氨酸的方法，属于食品检测技术领域。


背景技术：

2.医用食品是为满足进食受限、消化吸收障碍、代谢紊乱或特定疾病状态人群对营养素或膳食的特殊需求，专门加工配制而成的配方食品。氨基酸作为合成蛋白质的重要原料，因其分子量小、易吸收常成为特医食品首选的营养添加剂，如若摄入不当，会影响人体的正常生命代谢，甚至导致各种疾病的发生。gb 29922-2013《食品安全国家标准 特殊医学用途配方食品通则》规定了21种可用于特殊医学配方食品中的氨基酸，l-羟脯氨酸被列入卫生部公布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第二批）》。相关报道称，特殊医学用途配方食品中不应当随意添加氨基酸，特定人群对氨基酸种类及含量的摄入量必须严格控制。
3.目前，关于氨基酸的检测标准有gb 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》和sn/t 3929-2014 《出口食品中l-羟脯氨酸的测定 液相色谱-质谱/质谱法》，其中gb 5009.124-2016中分析目标物仅限16种，未能覆盖gb 29922-2013附录b中规定的胱氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和谷氨酰胺。sn/t 3929-2014检测范围并不包括特殊医学配方食品。国内外文献报道的氨基酸检测对象大多为生物样品或普通食品，对特殊医学配方食品鲜有报道。由于特殊医学配方食品种类繁多、与普通食品基质差别较大，使得常规食品中检测氨基酸的检测手段在医用食品领域难以直接应用。因此，建立医用食品中通量检测氨基酸的方法十分必要。
4.调研文献发现，现有检测氨基酸的方法有茚三酮柱后衍生-氨基酸分析仪检测、衍生化反应-液相色谱仪检测和液相色谱-串联质谱法等，氨基酸分析仪检测目标物局限性强，仪器专用，实验室普及率低；液相色谱-质谱仪器本身价格昂贵，常采用的消除基质效应方式-同位素内标法也进一步提高了检测成本。普通液相色谱法检测氨基酸的手段应用较为普遍，但也存在缺陷，如使用5 μm色谱柱，柱效低，分析时间长；流动相采用n，n二甲基甲酰胺、三乙胺或者磷酸盐，对环境、色谱柱、仪器均不友好等。
5.基于氨基酸本身没有紫外吸收，需经过衍生化反应引入生色基团。相关文献中用于柱前衍生的试剂有6-氨基喹啉-n-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（aqc）、邻苯二甲醛（opa）、异硫氰苯酯（pitc）、fmoc-cl、丹磺酰氯（dansyl-cl)、dnfb等。其中，aqc与氨基酸反应快，副产物少，但是衍生试剂价格昂贵；opa 衍生产物在室温不稳定，分解率高；pitc衍生氨基酸过程复杂，需要去除多余的试剂，且痕量的pitc会缩短分析柱的寿命； fmoc-cl形成的衍生产物需萃取，且与组氨酸形成衍生物不稳定，影响定量；丹磺酰氯（dansyl-cl)反应速度慢，衍生产物不稳定，易生成多级衍生物；dnfb衍生技术虽然已有文献或资料报道，但也存在衍生时间长等缺陷。
6.本研究针对gb 29922-2013规定的可用于特殊医学配方食品中的氨基酸(色氨酸
除外，因其具发色基团，可用紫外检测器直接测定)和非法添加l-羟脯氨酸，建立了dnfb衍生特殊医学配方食品中游离氨基酸的检测方法，覆盖了gb 5009.124-2016中规定的16种氨基酸，还包括目前没有检测标准的谷氨酰胺、鸟氨酸、瓜氨酸和l-羟脯氨酸。深入探究色谱分离因子，挖掘影响定量的敏感因素，发展分离dnp肽的绿色色谱条件；详细考察提取条件，优化衍生反应关键控制点，缩短前处理周期，实现21种氨基酸的精准检测。方法为医用食品中氨基酸的通量检测奠定了基础，为医用食品行业的质量控制及政府监管提供技术支持。


技术实现要素：

7.本文建立特殊医学配方食品中21种氨基酸的检测方法。发展分离dnp肽的绿色色谱条件，考察柱温、流动相、色谱柱等分离因子，考察一级、二级氨基酸光谱图，实现21种氨基酸的准确定量。考察提取方式和衍生条件，缩短检验周期，提高检测效率。方法具有衍生产物稳定、衍生效率高、检测成本低、准确度高、重现性好、绿色无污染等优势，为特殊医学配方食品中氨基酸的通量检测奠定基础，为特医产业的健康发展提供技术保障。
8.为了解决上述问题，本发明提供一种测定特殊医学配方食品中20种游离氨基酸和l-羟脯氨酸的方法。
9.本发明是通过以下技术方案实现的：一种测定特殊医学配方食品中20种游离氨基酸和l-羟脯氨酸的方法，包括以下步骤：（1）提取：称取均匀样品0.2g于50 ml聚丙烯具塞离心管中，加入25 ml3.5%磺基水杨酸溶液，涡旋1 min，超声15 min，8000 r/min离心5 min，取上清液待衍生；（2）衍生：分别取标准溶液和样品提取液200μl至15ml离心管，加入衍生缓冲液200μl，混匀后加入400μl1%dnfb衍生试剂，混匀后放入 60℃水浴振荡暗反应10min，取出放至室温，加入平衡缓冲液3ml，过0.22μm滤膜后供高效液相色谱-pda检测器测定。
10.进一步地，高效液相色谱的条件为：色谱柱：acquity uplc hss t3色谱柱，2.1 mm
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100 mm，1.8 μm；流动相: a-50%乙腈水和b
‑ꢀ
ph5.0的50 mmol/l甲酸铵溶液；检测波长：190~600 nm；流速：0.3 ml/min；柱温：55℃；进样量：3
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l。
11.进一步地，所述梯度洗脱程序: a 0～6 min：12%～18%，6～13min：18%～50%，13～28min：50%～65%，28.1~33min：100%保持，33.1min～40：12%保持。
12.进一步地， 比较pda检测器采集的特征吸收波长。例如一级氨基酸衍生产物光谱图最大吸收集中在360
±
3nm处，而二级氨基酸（脯氨酸、l-羟脯氨酸）的最大吸收在385nm。
13.有益效果本文采用超高效液相色谱法，首次使用对环境友好的乙腈水-甲酸铵流动相分离dnp肽，简化了配制流动相的复杂过程，降低了检测成本；流动相可挥发，绿色环保、有助于延长仪器和色谱柱使用寿命。使用1.8μm小粒径色谱柱，柱效高，分析速度快；使用低流速流动相，降低消耗。优化柱温、流动相比例等色谱条件，定量准确，抗干扰能力强。特征紫外吸收波长，辅助定性伯氨基和仲氨基。针对现有dnfb衍生缺陷，优化衍生试剂的用量、衍生时间等衍生反应的关键控制点，缩短前处理周期、提高检测效率。方法为医用食品中氨基酸的通量检测奠定基础，给政府及相关部门监管提供技术支持。
附图说明
14.图1衍生试剂用量的考察；图2 t3柱分离23种氨基酸色谱图（色谱峰按顺序分别为1.天冬氨酸，2.谷氨酸，3.l-羟脯氨酸，4.丝氨酸，5.谷氨酰胺，6.甘氨酸，7.瓜氨酸，8.精氨酸，9.苏氨酸，10.脯氨酸，11.丙氨酸，12.缬氨酸，13.蛋氨酸，14.胱氨酸，15.异亮氨酸，16.亮氨酸，17.组氨酸，18.苯丙氨酸，19.鸟氨酸，20.赖氨酸，21.酪氨酸，a、b、c为试剂峰）；图3 t3柱分离21种氨基酸色谱图（a:40%乙腈，b:60%乙腈，c:100%乙腈，色谱峰按顺序分别为1.天冬氨酸，2.谷氨酸，3.l-羟脯氨酸，4.丝氨酸，5.谷氨酰胺，6.甘氨酸，7.瓜氨酸，8.精氨酸）图4 35℃和45℃柱温条件分离21种氨基酸色谱图（6.甘氨酸，7.瓜氨酸，8.精氨酸，9.苏氨酸，10.脯氨酸，11.丙氨酸，0.干扰峰）图5氨基酸衍生产物光谱图比较；图6不同提取条件对样品提取效率的比较结果。
具体实施方式
15.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
16.实施例11实验部分仪器、试剂与材料acquity uplc超高效液相色谱仪(美国waters公司)；ab204-s型电子天平(瑞士mettler toledo公司)；sb-800dtd型超声波清洗器(中国宁波新芝生物科技股份有限公司)；3-18k型冷冻离心机(德国sigma公司)；milli-q超纯水制备器(美国millipore公司)；涡旋混合器(德国ika公司)，ptfe微孔滤膜0.45
µ
m(上海安谱科学仪器有限公司)。
17.17种氨基酸混合标准溶液(包括天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸），购自美国sigma-aldrich公司；瓜氨酸，购自北京曼哈格生物科技有限公司；鸟氨酸，购自上海安谱实验科技股份有限公司；l-羟脯氨酸，购自北京曼哈格生物科技有限公司；谷氨酰胺，购自dr.ehrenstorfer gmbh公司；acquity uplc hss t3色谱柱(2.1 mm
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100 mm，1.8 μm)、acquity uplc beh shield rp18色谱柱(2.1 mm
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100 mm，1.7 μm)、accq-tag ultra c18 色谱柱(2.1 mm
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100 mm，1.7 μm)购自美国waters公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯），购自美国fisher公司；盐酸、乙酸、氢氧化钠、甲酸铵、磺基水杨酸、亚铁氰化钾、乙酸锌、碳酸钠、磷酸二氢钾、碳酸氢钠 (均为分析纯) 购自国药集团化学试剂有限公司；2，4二硝基氟苯（dnfb）购自阿法埃莎（中国）化学有限公司；实验用样品来自市场购买。
18.1.1 标准溶液的配制1.2.1 分别称取10 mg(精确至0.01mg)瓜氨酸、鸟氨酸、l羟脯氨酸、谷氨酰胺标准物质，用0.1m盐酸溶于10 ml棕色容量瓶中，分别定容至刻度，配制成浓度均为1 mg/ml的标准储备液，0℃~ 4℃避光保存。
19.1.2.2 移取1.2.1各标准储备液1ml和17种氨基酸混合标准溶液2ml于10ml容量瓶，用水定容，逐级稀释到适当浓度得到标准工作液，0℃~ 4℃避光保存。
20.备注：17种混合标准溶液中氨基酸分子量介于75~240之间，本文统一按照200计算，即17种母液混标浓度约为500 μg/ml。
21.1.2 试剂的配制3.5%磺基水杨酸溶液：称取3.5 g 磺基水杨酸于100 ml容量瓶中，加入水100 ml溶解，混匀。
22.亚铁氰化钾溶液：称取106 g亚铁氰化钾于1000 ml，加入800 ml水溶解，定容至刻度，摇匀。
23.乙酸锌溶液：称取1.54 g乙酸锌于1000 ml，加入800 ml水溶解，定容至刻度，摇匀。
24.衍生缓冲液：称取21 g碳酸氢钠，加入470 ml水和30 ml乙腈，摇匀。
25.衍生试剂（1%dnfb）：称取1 g2，4二硝基氟苯于100 ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀。
26.平衡缓冲液：称取3.4 g磷酸二氢钾于500ml容量瓶中，加入145.5 ml氢氧化钠溶液（0.1 mol/l），用水定容至500 ml，摇匀。
27.50%乙腈水：移取500ml乙腈与1000ml容量瓶中，加入500ml水，摇匀。
28.50 mmol/l甲酸铵溶液(ph5.0)：称取3.153g甲酸铵于1l容量瓶中，加入900ml水后混匀，用甲酸调ph=5.00(
±
0.02)，定容至1l。
29.1.3 样品前处理提取：称取均匀样品0.2g（精确至0.0001 g）于50 ml聚丙烯具塞离心管中，加入25 ml3.5%磺基水杨酸溶液，涡旋1 min，超声15 min。8000 r/min离心5 min，取上清液待衍生。
30.衍生：分别取标准溶液和样品提取液200μl至15ml离心管，加入衍生缓冲液200μl，混匀后加入400μl衍生试剂（1%dnfb），混匀后放入 60℃水浴振荡暗反应10min，取出放至室温，加入平衡缓冲液3ml。过0.22μm滤膜后供高效液相色谱-pda检测器测定。
31.1.4 色谱条件色谱柱：acquity uplc hss t3色谱柱(2.1 mm
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100 mm，1.8 μm)；流动相: 50%乙腈水(a) 和50 mmol/l甲酸铵溶液(ph5.0)(b)。检测波长：190~600nm；流速：0.3 ml/min。柱温：55℃；进样量：3
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l。梯度洗脱程序(a): 0～6 min：12%～18%，6～13min：18%～50%，13～28min：50%～65%，28.1~33min：100%保持，33.1min～40：12%保持。
32.2.结果与讨论2.1衍生原理和条件2.1.1衍生原理2,4-二硝基氟苯（dnfb）只与末端氨基酸反应，脱去一份子hf，形成dnp肽。dnfb为衍生化试剂，将氨基酸在碱性条件下衍生化，生成具有紫外吸收的dnp肽。衍生过程是否充分、产生的副产物都会影响目标物的的准确定量，因此，本文对衍生条件进行详细考察及优化。
33.2.1.2 衍生条件的考察衍生试剂的用量和衍生时间直接决定dnfb衍生21种氨基酸的反应是否充分，根据
特医食品中目标氨基酸的含量范围，本着衍生剂必须过量且避免干扰定量的原则，研究选用100
ꢀµ
g/ml混合标准溶液考察衍生试剂的最佳用量，通过比较不同用量的dnfb（0.1%，0.5%、1%、2%）对目标峰响应的差异来衡量衍生效果（图4）。研究表明，随着dnfb含量的增加，目标峰响应值呈上升趋势，当dnfb含量增加至1%时，目标峰响应值不再增加，说明dnfb含量与衍生反应正相关。dnfb含量增加至2%时，衍生试剂的峰宽增大，反而影响与附近目标峰的有效分离，检测成本随之增加。综合考虑，选择1%含量的dnfb作为衍生试剂。
34.现有的衍生条件有30min、60min等恒温水浴条件，衍生时间长。为进一步研究衍生时间对衍生反应的影响，缩短衍生时间，提高衍生效率，本文选择60℃水浴振荡条件。比较不同时间（0、10、20、30min）衍生化反应，记录目标物含量的变化，结果发现衍生时间为0min时，无目标峰，衍生10、20、30min后，目标峰响应基本一致，随着时间的延长，响应无明显变化，说明衍生10min即反应完全。结果表明，水浴振荡条件下衍生10min可有效促使衍生反应充分进行。
35.2.2色谱条件的优化2.2.1色谱柱的选择衍生产物dnp肽的极性相近，色谱保留行为相似，衍生副产物易干扰目标物的准确定量，使得色谱分离难度增加。为实现21种dnp肽的有效分离，本文选用柱效高、抗压性好、粒径为1.8 μm的色谱柱。比较acquity uplc beh shield rp18、accq-tag ultra c18和acquity uplc hss t3三种色谱柱对dnp肽的分离效果发现，谷氨酰胺的衍生产物与试剂峰a在保留时间上很接近，对色谱柱的分离能力要求极高。acquity uplc beh shield rp18和accq-tag ultra c18的粒径小(1.7μm)，理论柱效高，但不能有效分离出谷氨酰胺衍生产物，谷氨酰胺衍生后，色谱峰被邻近试剂峰a覆盖，无法检测；acquity uplc hss t3属100%水性流动相兼容的c18色谱柱，专门用来保留和分离极性水溶性好的有机小分子。在t3色谱柱上谷氨酰胺衍生物保留时间位于第一试剂峰a之后（即图3中峰5），且与邻近的丝氨酸衍生物峰（即图3中峰4）有效分离，即acquity uplc hss t3色谱柱满足21种dnp肽的高效分离。
36.2.2.2流动相的选择本文研究的目标物种类多且性质接近，分离难度系数高。dnfb的衍生物可以采用乙酸钠（含n,n二甲基甲酰胺或三乙胺）或者磷酸盐缓冲溶液进行分离，但是n,n二甲基甲酰胺、三乙胺或者磷酸盐均对色谱柱和仪器有一定损伤。本文首次创新使用了乙腈水-甲酸铵挥发性流动相的分离体系，一方面简化了配制流动相的复杂过程，另一方面该试剂对环境友好也更有利于仪器或色谱柱寿命的延长。有机相-乙腈水作为强洗脱溶剂，其比例直接影响洗脱速度，进而影响化合物的分离度。当乙腈水的比例为100%时，目标峰被洗脱太快，集中分布在色谱图的前端，却不能有效分离，如图4c中峰2、3、7、8；当乙腈水的比例为40%时，洗脱速度变慢，目标物的保留时间延长，分析效率低，同时甲酸铵盐被稀释，浓度降低，目标峰分离度变差，如图2a中前端峰4、5不能有效分离。当乙腈水的比例为60%时，峰2、3、4、5被包裹在试剂峰a处（图4b），说明此条件也不适合。当乙腈水的比例为50%时(图3)，21种目标峰分离度最佳，因此实验过程中应严格控制有机相比例，本文最终选择乙腈水的比例为50%。
[0037] 2.2.3 柱温的考察
柱温通过影响流动相中的目标物和固定相的结合-分离过程，从而影响色谱行为。柱温高有利于改善色谱峰的分离度，加快分离效率，缩短分析时间，但对仪器的温度控制及灵敏度要求更高。相反，柱温低会延长目标物保留时间，降低分离效率，流动相黏度的增加也加大了泵的磨损。实验比较不同柱温（35℃、45℃、55℃）对目标物分离效果发现，图4a为35℃条件下，峰6、7、9、10均为达到有效分离，其中9与干扰峰0也未完全分离；随着柱温升高，45℃条件下（图4b）目标峰6、7和9、0分离度明显改善，但是峰10、11仍未完全分离；55℃柱温对分离效果有明显优势（图2），说明，柱温对目标峰分离度灵敏，需精准控制，本文最终选用55℃柱温条件。
[0038]
2.2.4 紫外吸收光谱的比较pda检测器全波长同时采集数据的特点，赋予了其光谱比对的功能，不同化合物具有不同的紫外吸收光谱形状以及不同吸光特性。一级或二级氨基酸是针对氨基中n的配位状态来说的，一级氨基酸的氨基为伯氨基，二级的氨基为仲氨基，如脯氨酸、羟脯氨酸。在加热条件下, 一级、二级氨基酸与dnfb反应后衍生产物的光谱图明显不同。一级氨基酸衍生产物光谱图最大吸收集中在360
±
3nm处，而二级氨基酸（脯氨酸、l-羟脯氨酸）的最大吸收在385nm左右，见图5。特征紫外吸收波长，辅助定性一级氨基酸和二级氨基酸，为后续推断更多化合物的结构与性质提供参考价值。
[0039]
2.3前处理条件考察特殊医学配方食品基质复杂，含有麦芽糊精、蛋白质、脂肪及维生素等各类小分子成分，为防止医用食品中蛋白水解为氨基酸，按配方添加的游离态氨基酸需要在沉淀蛋白前提下提取，文章基于氨基酸配方食品考察了三种前处理方式：亚铁氰化钾-乙酸锌、80%乙腈和3.5%磺基水杨酸，三种提取液均具有沉淀蛋白作用。
[0040]
实验比较发现，前两种处理方式目标氨基酸回收率低，磺基水杨酸提取效果满意。从图7可以看出，亚铁氰化钾-乙酸锌对目标物精氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、组氨酸和赖氨酸有明显吸附，回收率低于60%。推测原因是亚铁氰化钾与乙酸锌反应生成的氰亚铁酸锌沉淀挟走蛋白的同时，可能吸附了少量氨基酸； 80%乙腈提取目标物的回收率在10%~70%之间，提取效果明显差。原因可能是80%乙腈通过降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集后析出的过程中包裹了部分氨基酸；磺基水杨酸对样品中20种氨基酸和l-羟脯氨酸的提取效果好，回收率高（其中l-羟脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、瓜氨酸、鸟氨酸均未检出）。磺基水杨酸提取方式一方面通过提高离子强度，使蛋白质的溶解度降低，另一方面通过提高溶液酸度，使目标氨基酸的溶解度增加，提高回收率。综上，本实验选择3.5%磺基水杨酸作为提取溶剂。
[0041]
2.4方法学评价2.4.1 线性范围、检出限和定量限将系列标准工作溶液(2、10、20、50、100
ꢀµ
g/ml)由低到高依次测定，以每种氨基酸峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x，
µ
g/ml）为横坐标绘制标准曲线。结果显示，21种氨基酸在2～100
ꢀµ
g/ml范围内，线性回归方程及线性关系如表2所示。采用空白基质加标的方法，以信噪比s/n = 3得到目标物的检出限(lod)为5 mg/100g，以信噪比s/n = 10得到目标物的定量(loq)为10 mg/100g。
[0042]
表2 21种氨基酸线性回归方程及相关系数
2.4.2 回收率及精密度实验采取市售样品中添加2、10和50 mg/100g 3个水平的标准溶液，每个水平平行测定6次，得到方法的回收率及精密度，结果见表3。结果显示，3个水平的加标回收率为73.5%~116.1%，相对标准偏差为1.6%~9.5%。
[0043]
表3 21种氨基酸回收率与精密度结果21种氨基酸回收率与精密度结果2.4实际样品的测试运用本方法对市售氨基酸配方、深度水解配方和部分水解配方的特殊医学配方食
品中20种游离氨基酸和l-羟脯氨酸进行测定，结果显示三配方特医食品中均未检出非法添加氨基酸-l羟脯氨酸；其中氨基酸配方和深度水解配方中检出大量游离氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸；部分水解配方中未检出20种游离氨基酸。代表性样品各氨基酸含量汇总见表4。
[0044]
表4 代表性样品含量显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。