鼻咽癌相关血清标志物的检测试剂的应用的制作方法

1.本发明属于医学检验技术领域，具体涉及鼻咽癌相关血清标志物的检测试剂的应用。


背景技术：

2.鼻咽癌的主要发病因素包括遗传易感性，饮食因素和eb病毒(epstein-barrvirus,ebv)感染，其发病机制的研究包括基因的突变、代谢组学、蛋白质组学、基因组学等方面。尽管如此，目前仍然难以全面理解鼻咽癌的发生、发展，这给其治疗带来了困难。
3.一般来说，鼻咽癌的诊断还是以鼻咽镜检查为主，但是价格贵，而且对人体有伤害；鼻咽癌的进一步确诊依然需要靠组织的病理诊断，但组织的活检具有侵袭性，患者比较痛苦。同时对于隐匿性鼻咽癌或者黏膜下型鼻咽癌有可能需要多次，如此反复的组织活检必然增加患者的经济负担和心理负担，也非常不利于大规模筛查。血浆ebv dna检测在鼻咽癌早期诊断和筛查，复发和转移诊断，预后判断以及个体化治疗等方面具有较大的价值。据报道，鼻咽癌患者血浆中存在持续阳性的ebv dna，其拷贝数与肿瘤的分期相关，有效治疗后迅速下降，复发和转移时再次升高。然而eb病毒检测敏感性和特异性均不高。因此，如何寻找到有效的、高效的、特异性、无创性的鼻咽癌肿瘤标志物(bio-marker)对于提高患者的生存率至关重要。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明基于代谢组学技术，在血清中筛选出能较好区分正常人对照和早期鼻咽癌的标志物，并提供了鼻咽癌相关血清标志物的检测试剂在制备用于鼻咽癌诊断和/预后的产品中的应用，所述标志物为methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate，cas号为1971007-94-9。
5.进一步的，相对于正常健康人对照，鼻咽癌患者的血清中methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate的量升高。
6.更进一步的，利用所述试剂检测所述标志物的方法，包括以下步骤：
7.1)获得受试者的血清样本；
8.2)血清样本采用超高效液相色谱系统hilic色谱柱进行分离；
9.3)分离后的血清样本，用质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集，获得wiff格式的原始数据，原始数据经proteowizard转换成.mzxml格式，然后采用xcms软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积，得到受试者的血清样本中methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate的定量结果。
10.更进一步的，步骤1)中，血清样本在4℃环境下解冻后，取样本加入预冷的体积比为2：2：1的甲醇/乙腈/水溶液，涡旋混合，低温超声30min，-20℃静置10min，14000g，4℃离心20min，取上清真空干燥，质谱分析时加入100μl乙腈水溶液，乙腈和水的体积比为1:1，复溶，涡旋，14000g，4℃离心15min，待用。
11.更进一步的，步骤2)中，采用agilent1290infinitylc超高效液相色谱系统hilic色谱柱进行分离；柱温25℃；流速0.5ml/min；进样量2μl；流动相组成a：水 25mm乙酸铵 25mm氨水，b：乙腈；梯度洗脱程序如下：0-0.5min，95％b；0.5-7min，b从95％线性变化至65％；7-8min，b从65％线性变化至40％；8-9min，b维持在40％；9-9.1min，b从40％线性变化至95％；9.1-12min，b维持在95％；整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。
12.更进一步的，步骤3)中，采用abtripletof6600质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集，得到原始wiff格式的原始数据；样品经用agilent1290infinitylc超高效液相色谱系统分离后，用tripletof6600质谱仪进行质谱分析，分别采用电喷雾电离正离子和负离子模式进行检测，esi源设置参数如下：雾化气辅助加热气1：60，辅助加热气2：60，气帘气：30psi，离子源温度：600℃，喷雾电压
±
5500v；一级质荷比检测范围：60-1000da，二级子离子质荷比检测范围：25-1000da，一级质谱扫描累积时间：0.20s/spectra,二级质谱扫描累积时间0.05s/spectra；二级质谱采用数据依赖型采集模式获得，并且采用峰强度值筛选模式，去簇电压：
±
60v，碰撞能量：35
±
15ev，ida设置如下：动态排除同位素离子范围：4da，每次扫描采集10个碎片图谱
13.本发明的有益效果如下：
14.本发明研究首次发现，相对正常健康人对照，鼻咽癌患者的血清中methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate的量显著升高，roc分析发现该物质(auc＝1)准确度为100％，特异性为100％，能很好预测鼻咽癌的发病，该结果为鼻咽癌的早期诊断提供特异性的、迅速的、无创伤性的检测手段。
附图说明
15.图1为血清样本pca分析。
16.图2为基于随机森林(random forests)算法在训练组中5种显著差异的血清代谢物roc分析结果。
17.图3为基于随机森林(random forests)算法在测试组中血清标志物(methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate)的roc分析结果。
具体实施方式
18.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
19.基于超高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用(uhplc-q-tof ms)的代谢组学技术，我们研究了27例鼻咽癌患者和27例正常健康人群的血清及尿液样本中的代谢图谱特征(表1)。通过数据库匹配、数据标准化、计量学以及统计学分析等发现，与正常健康人群相比，鼻咽癌患者血清中181种代谢物发生显著性变化(p《0.05)，同时尿液中179种代谢组发生显著性变化(p《0.05)。接着取其交集，结果显示仅有7种代谢物在鼻咽癌患者血清和尿液中同时发生变化。按照vip》1&foldchange》1.5&p《0.05，共同筛选到6个差异代谢物，其中dibucaine两组学上下调趋势相反，另外5种代谢物(decanoyl-l-carnitine、methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate、octanoylcarnitine、
stachydrine和paraxanthine)的变化趋势是一致的。最后利用随机森林(random forests)的算法精准筛选出血清标志物(methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate)，中文名称：(1-(环己基甲基)-1h-吲哚-3-羰基)-1-缬氨酸甲酯。cas号：1971007-94-9。roc分析发现该标志物methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate的auc值为1，准确度为100％。
20.表1 27例鼻咽癌患者与27例正常健康人群基本信息
[0021][0022]
以下是对本发明的进一步描述：
[0023]
一、血清代谢组学分析
[0024]
1)血清样本在4℃环境下缓慢解冻后，取适量样本加入预冷甲醇/乙腈/水溶液(2：2：1，v/v)，涡旋混合，低温超声30min，-20℃静置10min，14000g 4℃离心20min，取上清真空干燥，质谱分析时加入100μl乙腈水溶液(乙腈：水＝1:1，v/v)复溶，涡旋，14000g 4℃离心15min，取上清液进样分析。
[0025]
2)色谱条件：样品采用agilent 1290infinity lc超高效液相色谱系统(uhplc)hilic色谱柱进行分离；柱温25℃；流速0.5ml/min；进样量2μl；流动相组成a：水 25mm乙酸铵 25mm氨水，b：乙腈；梯度洗脱程序如下：0-0.5min，95％b；0.5-7min，b从95％线性变化至65％；7-8min，b从65％线性变化至40％；8-9min，b维持在40％；9-9.1min，b从40％线性变化至95％；9.1-12min，b维持在95％；整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中插入qc样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。
[0026]
3)q-tof质谱条件：采用ab triple tof 6600质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集。样品经用agilent 1290 infinity lc超高效液相色谱系统(uhplc)分离后，用triple tof 6600质谱仪(ab sciex)进行质谱分析，分别采用电喷雾电离(esi)正离子和负离子模式进行检测。esi源设置参数如下：雾化气辅助加热气1(gas1)：60，辅助加热气2(gas2)：60，气帘气(cur)：30psi，离子源温度：600℃，喷雾电压(isvf)
±
5500v(正负两种模式)；一级质荷比检测范围：60-1000da，二级子离子质荷比检测范围：25-1000da，一级质谱扫描累积时间：0.20s/spectra,二级质谱扫描累积时间0.05s/spectra；二级质谱采用数据依赖型采集模式(ida)获得，并且采用峰强度值筛选模式，去簇电压(dp)：
±
60v(正负两种模式)，碰撞能量：35
±
15ev，ida 设置如下:动态排除同位素离子范围：4da，每次扫描采集10个碎片图谱。
[0027]
4)数据分析流程：wiff格式的原始数据经proteowizard转换成.mzxml格式，然后采用xcms软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。对xcms提取得到的数据首先进行代谢物结构鉴定、数据预处理，然后进行实验数据质量评价，最后再进行数据分析。数据分析内容包括单变量统计分析、多维统计分析、差异代谢物筛选、差异代谢物相关性分析、kegg通路分析等内容。
[0028]
结果：在所有54例血清样本中，正负离子模式合并后鉴定1230种代谢物。通过主成分分析(principal component analysis,pca)分析发现正离子模式和负离子模式下27例鼻咽癌患者血清样本与27例正常健康人群血清样本有明显的区分(图1)。进一步通过正交偏最小二乘判别分析(opls-da)发现该模型也能区分以上两组样本，以严格的vip》1和p value《0.05为筛选标准，发现鼻咽癌患者血清中有181种代谢物发生显著性变化。kegg通路富集分析结果表明这些差异代谢物显著地富集(p value《0.05)在16条通路上，具体包括aminoacyl-trna biosynthesis、biosynthesis of unsaturated fatty acids、fatty acid biosynthesis、aldosterone synthesis and secretion、glutamatergic synapse、arginine biosynthesis、ovarian steroidogenesis、long-term depression、gabaergic synapse、cholesterol metabolism、basal cell carcinoma、biosynthesis of amino acids、choline metabolism in cancer、ferroptosis、d-glutamine and d-glutamate metabolism和central carbon metabolism in cancer。
[0029]
二、尿液代谢组学分析
[0030]
尿液样本中代谢物的提取、色谱条件、q-tof质谱条件、数据分析流程与血清的相同。
[0031]
在所有54例尿液样本中，正负离子模式合并后鉴定2509种代谢物。通过主成分分析(principal component analysis,pca)分析发现正离子模式和负离子模式下27例鼻咽癌患者尿液样本与27例正常健康人群尿液样本混在一起。进一步通过正交偏最小二乘判别分析(opls-da)发现该模型能区分以上两组样本，以严格的vip》1和p value《0.05为筛选标准，发现鼻咽癌患者尿液中有179种代谢物发生显著性变化。kegg通路富集分析结果表明这些差异代谢物显著地富集(p value《0.05)在8条通路上，具体包括caffeine metabolism、citrate cycle(tca cycle)、abc transporters、glucagon signaling pathway、nicotinate and nicotinamide metabolism、central carbon metabolism in cancer、butanoate metabolism和alanine,aspartate and glutamate metabolism。
[0032]
三、预测模型的建立和评估
[0033]
结合血清和尿液代谢组学的结果发现仅有7种代谢物(表2)在鼻咽癌患者血清和尿液中同时发生显著性变化。另外一方面central carbon metabolism in cancer通路也是在鼻咽癌患者血清和尿液中同时显著性富集。按照foldchange》1.5或foldchange《0.67的筛选标准，最终表明5种代谢物在鼻咽癌患者血清和尿液中的变化趋势是一致的，具体包括：decanoyl-l-carnitine、methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate、octanoylcarnitine、stachydrine和paraxanthine。接着利用随机森林(random forests)算法发掘生物标志物，将原始所有血清样本随机分为训练组和测试组，其中训练组用于建立预测模型，验证组用于测试模型的准确性。结果表明以上5种差异的血清代谢物在训练组中的重要性从高至低依次为methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate、octanoylcarnitine、stachydrine、decanoyl-l-carnitine和paraxanthine。methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate的auc值直接为1(图2)。因此，选择methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate为唯一的血清标志物。在测试组中roc分析发现该标志物的auc值为1，准确度和特异性均为100％(图3)。
[0034]
表2在鼻咽癌患者血清和尿液中同时发生显著性变化的7种代谢物
[0035][0036]
foldchange
*
代表鼻咽癌患者组与正常健康人群组的比值。
[0037]
以上结果表明：methyl(1-(cyclohexylmethyl)-1h-indole-3-carbonyl)-l-valinate可作为早期鼻咽癌的血清诊断标志物，为鼻咽癌的早期诊断提供特异性的、迅速的、无创伤性的检测手段。
[0038]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0039]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。