一种高效清除液相色谱中多肽残留的方法及应用

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高效清除液相色谱中多肽残留的方法及应用。


背景技术：

2.蛋白质组学是以蛋白质为基本研究对象，用系统生物学的方法，研究生物体的细胞、组织的组成和变化规律的科学。经过二十来年的发展，基于质谱的蛋白质组学以其灵敏度、准确度、自动化程度高等优点已经大规模地应用于生物医药领域的研究。
3.在基于质谱的自下而上的(bottom-up)蛋白质组学中，会有少量多肽样本保留在分析系统中，这种现象被称为样本残留(carryover)。样本残留是影响高效液相色谱(hplc)、液相色谱-质谱(lc-ms)和液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)生物分析准确度和精密度的主要问题，会造成先前样本中的多肽信号在之后样本的谱图中持续出现，造成定性、定量结果的偏差，例如，检测结果中出现一些样本里原不存在的多肽信号(假阳性)；某些信号由于样本残留信号过强的原因无法被检测到(假阴性)；或某多肽持续残留，导致后续样本中其定量信号显著升高等。
4.因此，在分析样本前充分清除分析系统中的样本残留，对于提高蛋白质组学分析结果的准确性具有重要意义。目前，用于清除液相色谱-质谱分析系统中的样本残留的方法有以下几种：
5.(1)在分析样本后运行空白样本(如，水)来清除残留。这种方法是在清楚样本残留中最常用的技术，但空白样本不能完全不能有效的清除吸附性较强的或疏水性的样本残留。
6.(2)用高比例的液相色谱有机相冲洗(如80％的乙腈)。这种方法可以有效清理疏水性多肽的样本残留，但是往往需要较长时间的冲洗，不适用于高通量的样本分析。
7.(3)运用特殊化学试剂清除残留。如karl mechtler运用三氟乙醇(tfe)作为清洗剂，清除液相系统中的各部分残留。但是这种方法引入了不易去除的成分，有可能影响分析物，不适宜在样本运行间快速清除残留。
8.整体来说，目前尚没有行之有效的、可以高效清除液相中多肽样本残留的方法。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种高效清除液相色谱中多肽残留的方法，根据多肽残留的亲疏水性设定对标的合成肽序列或选择氨基酸，利用对标的合成肽序列或选择的氨基酸高效清除液相中的多肽样本残留，不会对液质联用分析系统造成损害，不会引入杂质也不影响质谱信号采集，可以兼容高通量高蛋白组分析，也不会减慢分析效率。
10.为实现以上目的，本技术方案提供一种高效清除液相色谱中多肽残留的方法，用于清除液相色谱体系中的残留多肽，包括以下步骤：
11.设计亲疏水性同于残留多肽的亲疏水性的至少一种合成肽，和/或选择亲疏水性
同于残留多肽的亲疏水性的至少一种天然氨基酸作为洗脱物质；
12.利用质谱缓冲液溶解所述洗脱物质制备得到洗脱剂；
13.所述洗脱剂进入液相色谱体系的液相中进行梯度分离和洗脱，利用共流出作用洗脱残留多肽。
14.在一些实施例中，所述合成肽和/或所述氨基酸的亲疏水性同于残留多肽的亲疏水性。也就是说，若残留多肽为亲水性，则设计亲水性的合成肽或选择亲水性的氨基酸；若残留多肽为疏水性，则设计疏水性的合成肽或选择疏水性的氨基酸，这样确保合成肽和/或氨基酸可以在液相色谱体系中取代或通过共流出作用洗脱残留多肽。
15.在本方案中，亲水性合成肽的设计思路：选择至少一种亲水性氨基酸，组合至少一种亲水性氨基酸得到亲水性合成肽。在一些情况下，亲水性合成肽也可组合至少一种亲水性氨基酸和至少一种疏水性氨基酸得到，此时确保所述亲水性合成肽依旧是亲水性。示例性的，亲水性氨基酸包括精氨酸(r)、组氨酸(h)等，疏水性氨基酸包括丙氨酸(a)等，此时形成的亲水性合成肽可以是：rrrrrr、rrrrhhhh、rra等。
16.相同的，疏水性合成肽的设计思路：选择至少一种疏水性氨基酸，组合至少一种疏水性氨基酸得到疏水性合成肽。在一些情况下，疏水性合成肽也可组合至少一种疏水性氨基酸和至少一种亲水性氨基酸得到，此时确保所述疏水性合成肽依旧是疏水性。示例性，疏水性氨基酸包括缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)等，亲水性氨基酸包括精氨酸(r)等，此时形成的疏水性合成肽可以是：vvvvv、iiiivvv、vvr等。
17.也就是说，本方案的合成肽的设计序列为：(a)x(b)y(c)z
…
,a,b,c可以是相同的氨基酸，也可以是不同亲疏水性的氨基酸，x,y,z为对应氨基酸个数。关于合成肽的制作可采用多肽固相合成法等技术。
18.当然，本方案还可直接选择亲疏水性同于残留多肽的亲疏水性的至少一种天然氨基酸作为洗脱物质。亲水性氨基酸包括：脯氨酸(p)，丝氨酸(s)、精氨酸(r)、组氨酸(h)；疏水性氨基酸包括：亮氨酸(l)；赖氨酸(k)。
19.值得一提的是，本方案可选择单一的合成肽、组合的合成肽、单一的天然氨基酸、组合的天然氨基酸或者合成肽和天然氨基酸的混合物作为洗脱物质，仅需保证洗脱物质的亲疏水性同于残留多肽的亲疏水性。
20.在“利用质谱缓冲液溶解所述洗脱物质制备得到洗脱剂”步骤中，利用有机溶剂比例高的质谱缓冲液溶解疏水性的所述洗脱物质，利用有机溶剂比例低的质谱缓冲液溶解亲水性的所述洗脱物质。
21.在本方案的实施例中，利用由98％水，2％乙腈，0.1％甲酸配比组成的质谱缓冲液溶剂亲水性的洗脱物质；利用由98％乙腈，2％水，0.1％甲酸配比组成的质谱缓冲液溶解疏水性的洗脱物质。
22.在“所述洗脱剂进入液相色谱体系的液相中进行梯度分离和洗脱”步骤中，液相色谱可采用预柱-分析柱串联模式或者分析柱模式，也可选用所述洗脱剂进入液相色谱体系的液相中进行梯度分离和洗脱。也就是说，本方案提供的洗脱剂可适用于各个类型的液相色谱体系。
23.在一些实施例中，若液相色谱为反相色谱，可以用纯水和有机溶剂作为流动相，梯度设计为低有机相至高有机相。
24.本方案提供的高效清除液相色谱中的多肽残留的应用，可采用上述任一所述的高效清除液相色谱中多肽残留的方法。
25.相较现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：
26.本方案根据多肽残留的亲疏水性设计合成肽或选择氨基酸，利用合成肽或氨基酸的共流出作用，高效地清除液相色谱多肽残留以提高实验效率，且本方案的合成肽或氨基酸和色谱中的多肽残留发生相互作用后被洗脱或者取代残留的多肽，而洗脱或取代后的物质在一定检测范围内不会被质谱检测到，进而不会产生质谱信号，确保后续不会影响其他物质的液相色谱检测。
附图说明
27.图1是本方案提供的高效清除液相色谱中多肽残留的方法的流程示意图。
28.图2是本方案的高效清除液相色谱中多肽残留的方法的可行性测试的质谱信号图。
29.图3和图4是本方案的高效清除液相色谱中多肽残留的方法的可行性测试的鉴定结果比较图。
30.图5是本方案的实施例二的可行性测试的质谱信号图。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例一可行性测试：
33.为了证明亲水性合成肽可以减少残留多肽的鉴定两并且不影响液质联用质谱信号的采集。
34.设计合成肽：亲水性的ssk，其中s指的是丝氨酸，k指的是赖氨酸；ssk的分子量为320.34，
35.洗脱剂制备：将合成肽在由98％水，2％乙腈，0.1％甲酸配置的第一质谱缓冲液中进行溶解，最终浓度为2500ng/μl。。
36.使用rslcnano液相系统和q exactive
tm hf质谱系统进行液相质谱数据采集：依次运行鼠肝多肽样本、空白样本、鼠肝多肽样本、洗脱剂,其中空白样本是98％水，2％乙腈，0.1％甲酸，空白样本和洗脱剂样本设置液相质谱体系的条件为：
37.15min液相梯度，使用的是反相亲和液相色谱，流速：0.3ul/min。0min：97％a；4min：97％a，3％b；6min：50％a，50％b；6.1min：20％a，80％b；10min：20％a，80％b；10.1min：3％a，97％b；15min：3％a，97％b。其中a为98％水，2％乙腈，0.1％甲酸；b为98％乙腈，2％水，0.1％甲酸。
38.利用一级质谱采集数据，一级质谱采集的范围为200-2000m/z，利用dia-nn软件对冲洗样本进行数据搜索，比较各样本的多肽和蛋白的鉴定量，得到结果如图2到图4。
39.图2是空白样本(blank)以及洗脱剂的质谱信号，从图中可以看出，在液相色谱的
亲水段，两个样本均存在少量信号；在液相色谱的疏水段，10-11min，两个样本均有一个强度相当的信号，而洗脱剂样本在13min较空白样本增加了一个较强的信号，推测加入洗脱剂后去除了较多的疏水性残留多肽。
40.图3是多次运行之后鉴定的多肽的统计情况，图4是多次运行鉴定的蛋白数目的统计情况。可见加入洗脱剂的样本洗脱下来了更多的残留多肽。
41.实施例二可行性测试：
42.为了证明疏水性合成肽可以减少残留多肽的鉴定两并且不影响液质联用质谱信号的采集。
43.设计合成肽：疏水性的vvk，其中v指的是缬氨酸，k指的是赖氨酸；vvk的分子量为344.45。
44.洗脱剂制备：将合成肽在由98％水，2％乙腈，0.1％甲酸配置的第一质谱缓冲液中进行溶解，最终浓度为1250ng/μl。。使用nanoelute液相系统和qexactive hf质谱系统进行液相质谱数据采集，其中液相色谱体系的检测条件同于实施一，得到谱图结果如图5。
45.图5是空白样本(blank)以及洗脱剂的质谱信号，从图中可以看出对应洗脱剂的样本在10-11min的信号相比空白样本有明显增加，推测是洗脱下来的残留多肽。
46.本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本技术相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。