一种蜂蜜果蔬酵素原液及其制备方法与流程

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种蜂蜜果蔬酵素原液及其制备方法。


背景技术：

2.蜂蜜是昆虫蜜蜂从开花植物的花中采得的花蜜在蜂巢中酿制的蜜。蜜蜂从植物的花中采取含水量约为80%的花蜜或分泌物存入自己第二个胃中，在体内转化酶的作用下经过30分钟的发酵回到蜂巢中吐出，蜂巢内温度经常保持在35℃左右，经过一段时间，水分蒸发，成为水分含量少于20%的蜂蜜。
3.蜂蜜主要含多种蛋白质、维生素、酸类(主要有葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸)、矿物质(主要有铁、铜、钾、钠、镁、锰、磷、铝、铬、镍等)、糖分等诸多营养成分。其中水分占18%，葡萄糖占25.14%~41.43%，果糖占31.94%~46.05%，蔗糖占0.1%~4.21%，麦芽糖占0%~2.8%，矿物质占0.03%~0.9%；其次，蜂蜜中还含有多种酶，如蔗糖酶、淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化酶等营养成分。学者李勇主编的《中国中草药图典下》中也曾记载，蜂蜜功能主治补中、润燥、止痛、解毒。可用于脘腹虚痛，肺燥干咳，肠燥便秘；外治疮疡不敛，水火烫伤，具有极高的药用价值。然而，蜂蜜与气味的亲合力强，在敞口容器中贮存的蜂蜜，极易吸收外界异味；且蜂蜜还具有调温性，当空气中湿度大的时候，它可吸收空气中的水份，使原来粘稠的胶状液体变得稀薄；上层糖液中含水量增大，在一定的温度下，蜂蜜中的耐糖性酵母菌、醋酸菌等会把糖分解为酒精、二氧化碳，使蜂蜜中出现气泡和酒味，继之产生乙酸和水，使蜂蜜完全失去特有的香味和营养价值。
4.现有技术中，有研究人员将蜂蜜同果蔬等一起发酵制备酵素产品，但对于发酵过程中产生的甲醇处理，一直没有得到较好的处理。例如中国专利cn105146642b公开了一种用蜜源菌发酵制备果蔬蜂蜜酵素饮料的方法，其工艺特点是以果蔬为主要原料，辅以蜂蜜及水以2013年6月24日保存于武汉大学中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：cctccno：m2013283的bacillusamyloliquefaciensh47的解淀粉芽孢杆菌为发酵菌株，发酵过程分为好氧发酵和厌氧发酵两步。好氧发酵时按照果菜浆、蜂蜜、水4～6∶1～3∶5～1的比例和三种原料总重量0.01％-0.05％的蜜源菌冻干粉，保持ph＝5～8，温度20-35℃，转速220rpm。在发酵罐中通气搅拌好氧发酵7-15天。
5.再如中国专利cn103931983b公开了一种蜂蜜酵素产品及其制备方法。该发明先在蜂蜜中加入果胶酶，然后加入植物乳杆菌活化液进行第一梯式发酵，加入青春双岐乳杆菌活化液进行第二梯式发酵，加入嗜酸乳杆菌活化液进行第三梯式发酵，最后当其总酸值达到10g/l值时，密封状态保持温度25℃，窖贮120天；然后300目过滤，在600公斤压力的匀质机进行匀质后，得到蜂蜜酵素产品。所得蜂蜜酵素产品口感酸甜可口，具有增强人体免疫力、抗氧化延衰老等保健功能；但在制备过程中加入了果胶酶，使得其发酵后极易产生甲醇，即使甲醇含量在限定范围内，仍对人体健康有潜在危害。
6.基于上述问题，本发明提供了一种蜂蜜果蔬酵素原液及其制备方法。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种蜂蜜果蔬酵素原液及其制备方法。本发明通过对蜂蜜果蔬进行发酵，所得酵素原液对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均较敏感，能很好地抑制杂菌生长，有效提高蜂蜜保存效果的同时，还将降低了其糖份含量、提升了其营养价值，本发明蜂蜜果蔬酵素还含有许多的益生酶类物质，其中含有sod、蛋白酶、脂肪酶氨基酸等；同时，采用本发明的制备方法，能够显著降低发酵过程中产生的甲醇含量，大大降低了对人体的危害。
8.本发明的技术方案是：一种蜂蜜果蔬酵素原液制备方法，包括以下制备步骤：步骤s1：将水果洗净、去核、切碎，并进行杀菌处理；步骤s2：往步骤s1所得的水果中加入等质量的蜂蜜，搅拌均匀再加入纯净水，浸泡20-40min，得水果蜂蜜混合物；再添加生物硒搅拌均匀，在通co2的条件下静置30-45天进行厌氧发酵，得果蔬蜂蜜酵素液ⅰ；步骤s3：将步骤s2所得的果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的ph值调为7.0，然后加入蜜源菌，并进行好氧发酵；随后保持温度为27-29℃、调节ph为4.5-5.5并加入复合发酵菌粉，持续搅拌，继续厌氧发酵8-12天，得果蔬蜂蜜酵素液ⅱ；步骤s4：对步骤s3所得的果蔬蜂蜜酵素液ⅱ，进行总酸值测定，当总酸值达到8-9g/l值时，进行密封状态保持温度28-30℃，窖贮45-55天；随后过滤，得到果蔬蜂蜜酵素原液。
9.进一步地，所述步骤s2中生物硒的添加量为水果蜂蜜混合物的1-3wt％。
10.进一步地，所述步骤s3中蜜源菌的添加量为果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的0.5-2wt％；蜜源菌为保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心的地衣芽胞杆菌株，其编号：cicc10037。
11.进一步地，所述步骤s3中加入蜜源菌后进行好氧发酵的过程为：在27-32℃的温度下好氧发酵35-45天，发酵过程中每隔3-5h进行搅拌。
12.进一步地，所述步骤s3中的复合发酵菌粉的添加量为果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的10-15wt％；进一步地，所述复合发酵菌粉由甲基营养菌、大豆肽粉和桃胶提取物按重量比1：10-25：5-10组成；进一步地，所述步骤s3中的甲基营养菌为保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心的巴斯德毕赤酵母菌株，其编号：cicc32806。
13.进一步地，所述复合发酵菌粉由甲基营养菌、大豆肽粉和桃胶提取物按重量比1：18：6组成。
14.进一步地，所述生物硒是植物乳杆菌植物亚种菌株在无菌条件下接种于培养基中培养得到的。所述植物乳杆菌植物亚种菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其编号：cicc22703。
15.进一步地，所述培养基成分：酪蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、1.0g吐温80、2.0gk2hpo4、0.2gmgso4•
7h2o、0.05gmnso4•
h2o、20.0gcaco3、亚硒酸钠0.5g、维生素e1.2g、琼脂15.0g、蒸馏水1.0l；所述培养条件为ph6.8，37℃。
16.而且，本发明还提供了一种上述的制备方法制备得到的蜂蜜果蔬酵素原液。
17.硒是人体必需的微量元素，研究发现硒有诸多生理功能，如提高机体免疫力、抗氧化、延缓衰老及拮抗某些有毒元素等。生物体内的硒都来源于蔬菜、水果等，而这些天然食物中的硒含量普遍比较低，一般不足0.01μg/kg，很难满足中国营养学会1988年推荐的成人硒日摄入量50μg的要求。经研究表明，生物硒制剂能有效提高硒的生物可利用率，其生理活性比无机硒（亚硒酸钠）高约100倍，同时对人体具有较低的毒性、较好的安全性和稳定性。
18.本发明通过微生物转化法获得生物硒——培养富硒植物乳杆菌植物亚种菌株，能为人们提高安全、稳定的微量元素。研究过程中，发明人发现在培养基中添加一定量的维生素e，可以显著的提高植物乳杆菌植物亚种菌株的富硒量，推测可能的原因是植物乳杆菌植物亚种菌株细胞膜上的多不饱和脂肪酸易受自由基的攻击，从而发生脂质过氧化反应，而维生素e可以给脂类的自由基结合并与游离的电子发生作用，抑制自由基，使脂质过氧化链式反应中断，最终保护了细胞膜的完整性和稳定性，并增强了细胞膜的流动性，使得通过主动运输方式从胞外物质逆浓度梯度进入细胞内的硒含量增加，从而显著提高了硒的胞内富集量。
19.另外，在现有技术中，通常采用高温或是加入果胶酶的形式，对发酵原料进行果胶去除。但是采用高温破坏植物细胞结构以及果胶质时，不耐高温的营养物质同样受到破坏，发酵原料的营养价值受损；采用果胶酶去除时，后期发酵过程中会产生大量的甲醇，存在健康隐患。
20.而本发明中通过对控制发酵过程中的发酵条件，并且选择了不同的菌种对果蔬蜂蜜分别进行了无氧发酵和好氧发酵，在试验过程中发现将大豆肽粉、桃胶提取物和甲基营养菌按比例将进行混合，加入果蔬蜂蜜酵素液中，可提高甲基营养菌耐渗透压能力，进而提升其活性，因此可显著减少甲醇的含量。同时还不会破坏发酵原料的营养物质。
21.与现有技术相比，本发明提供的一种蜂蜜果蔬酵素原液及其制备方法，具有以下优势：（1）本发明制备的蜂蜜果蔬酵素原液中的甲醇含量均低于40mg/l；同时本发明所得的蜂蜜果蔬酵素原液对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均较敏感，能很好地抑制杂菌生长，有效的提高蜂蜜保存效果。
22.（2）本发明通过对蜂蜜进行发酵，有效降低糖份含量的同时，还含有许多的益生酶类物质，其中包括sod、蛋白酶、脂肪酶氨基酸等，有效增强了人体免疫力、抗氧化延衰老、修复受损细胞防止癌变等保健功能；此外，本发明所得的蜂蜜果蔬酵素原液还含有大量的益生活性菌，具有增加人体益生菌群，排毒通肠的功效。
具体实施方式
23.以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的保护范围之内。
24.其中，植物乳杆菌植物亚种菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其编号：cicc22703；巴斯德毕赤酵母菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其编号：cicc32806；地衣芽胞杆菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其编号：cicc10037；大豆分离蛋白购自江苏久顺生物科技有限公司，货号为：064964；大豆肽粉购自
江苏久顺生物科技有限公司，货号为：06；桃胶提取物购自陕西固本源生物科技有限公司，货号为：gby262。
25.本发明所用的其余试剂均为常用试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。
26.实施例1生物硒的制备方法将活化的5.0g植物乳杆菌植物亚种菌株粉（保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，其编号：cicc22703）在无菌条件下接种于培养基中，静止培养24h，得生物硒。其中，培养条件为ph6.8，37℃；培养基成分：酪蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、1.0gtween80、2.0gk2hpo4、0.2gmgso4•
7h2o、0.05gmnso4•
h2o、20.0gcaco3、硒0.5g、琼脂15.0g、蒸馏水1.0l。
27.以下实施例所采用的生物硒皆由实施例1所述的制备方法制备而得。
28.实施例2一种蜂蜜果蔬酵素原液制备方法步骤s1：将新鲜水果洗净后冷风吹干，随后将水果在无菌环境下去核、切碎，最后进行紫外线照射杀菌处理；步骤s2：往步骤s1所得的水果中加入等质量的蜂蜜，搅拌均匀再加入纯净水，浸泡20min，得水果蜂蜜混合物；再添加生物硒搅拌均匀，在通co2的条件下静置30天进行厌氧发酵，得果蔬蜂蜜酵素液ⅰ；所述生物硒的添加量为水果蜂蜜混合物的1wt％；步骤s3：将步骤s2所得的果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的ph值调为7.0，然后加入地衣芽胞杆菌株，并在27℃的温度下好氧发酵35天，发酵过程中每隔3h进行搅拌；随后升温至28℃，调节ph为5.0并加入复合发酵菌粉，持续搅拌，继续厌氧发酵10天，得果蔬蜂蜜酵素液ⅱ；所述地衣芽胞杆菌株的添加量为果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的0.5wt％；所述复合发酵菌粉的添加量为果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的10wt％，其中复合发酵菌粉是巴斯德毕赤酵母菌株、大豆肽粉和桃胶提取物按重量比为1：10：5的混合物；步骤s4：对步骤s3所得的果蔬蜂蜜酵素液ⅱ，进行总酸值测定，当总酸值达到8g/l值时，进行密封状态保持温度28℃，窖贮50天；随后200目过滤，得到果蔬蜂蜜酵素原液。
29.实施例3一种蜂蜜果蔬酵素原液制备方法步骤s1：将新鲜水果洗净后冷风吹干，随后将水果在无菌环境下去核、切碎，最后进行紫外线照射杀菌处理；步骤s2：往步骤s1所得的水果中加入等质量的蜂蜜，搅拌均匀再加入纯净水，浸泡40min，得水果蜂蜜混合物；再添加生物硒搅拌均匀，在通co2的条件下静置45天进行厌氧发酵，得果蔬蜂蜜酵素液ⅰ；所述生物硒的添加量为水果蜂蜜混合物的3wt％；步骤s3：将步骤s2所得的果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的ph值调为7.0，然后加入地衣芽胞杆菌株，并在32℃的温度下好氧发酵45天，发酵过程中每隔5h进行搅拌；随后降温至28℃，调节ph为5.0并加入复合发酵菌粉，持续搅拌，继续厌氧发酵10天，得果蔬蜂蜜酵素液ⅱ；所述地衣芽胞杆菌株的添加量为果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的2wt％；所述复合发酵菌粉的添加量为果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的15wt％，其中复合发酵菌粉是巴斯德毕赤酵母菌株、大豆肽粉和桃胶提取物按重量比为1：25：10的混合物；步骤s4：对步骤s3所得的果蔬蜂蜜酵素液ⅱ，进行总酸值测定，当总酸值达到8g/l值时，进行密封状态保持温度30℃，窖贮50天；随后200目过滤，得到果蔬蜂蜜酵素原液。
30.实施例4一种蜂蜜果蔬酵素原液制备方法
步骤s1：将新鲜水果洗净后冷风吹干，随后将水果在无菌环境下去核、切碎，最后进行紫外线照射杀菌处理；步骤s2：往步骤s1所得的水果中加入等质量的蜂蜜，搅拌均匀再加入纯净水，浸泡30min，得水果蜂蜜混合物；再添加生物硒搅拌均匀，在通co2的条件下静置40天进行厌氧发酵，得果蔬蜂蜜酵素液ⅰ；所述生物硒的添加量为水果蜂蜜混合物的2.5wt％；步骤s3：将步骤s2所得的果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的ph值调为7.0，然后加入地衣芽胞杆菌株，并在28℃的温度下好氧发酵40天，发酵过程中每隔4h进行搅拌；随后保持温度为28℃、调节ph为5.0并加入复合发酵菌粉，持续搅拌，继续厌氧发酵10天，得果蔬蜂蜜酵素液ⅱ；所述地衣芽胞杆菌株的添加量为果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的1.6wt％；所述复合发酵菌粉的添加量为果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的13wt％，其中复合发酵菌粉是所述巴斯德毕赤酵母菌株、大豆肽粉和桃胶提取物按重量比为1：18：6的混合物；步骤s4：对步骤s3所得的果蔬蜂蜜酵素液ⅱ，进行总酸值测定，当总酸值达到8g/l值时，进行密封状态保持温度28℃，窖贮50天；随后200目过滤，得到果蔬蜂蜜酵素原液。
31.对比例1生物硒的制备方法所述对比例1的制备方法与实施例1类似。与实施例1的区别在于，培养基中采用生育酚琥珀酸酯替换维生素e。
32.对比例2生物硒的制备方法所述对比例2的制备方法与实施例1类似。与实施例1的区别在于，所述菌株为保藏编号为cicc21790的植物乳杆菌。
33.对比例3一种蜂蜜果蔬酵素原液制备方法所述对比例3的制备方法与实施例4类似。与实施例4的区别在于，所述步骤s3中采用大豆分离蛋白替换大豆肽粉。
34.对比例4一种蜂蜜果蔬酵素原液制备方法所述对比例4的制备方法与实施例4类似。与实施例4的区别在于，所述步骤s3中采用甲基营养芽孢杆菌（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccn0:m2011201）替换巴斯德毕赤酵母菌株。
35.对比例5一种蜂蜜果蔬酵素原液制备方法所述对比例5的制备方法与实施例4类似。与实施例4的区别在于，所述所述复合发酵菌粉的添加量为果蔬蜂蜜酵素液ⅰ的5wt％。
36.对比例6一种蜂蜜果蔬酵素原液制备方法所述对比例6的制备方法与实施例4类似。与实施例4的区别在于，所述复合发酵菌粉中不添加桃胶提取物。
37.对比例7一种蜂蜜果蔬酵素原液制备方法所述对比例7的制备方法与实施例4类似。与实施例4的区别在于，所述步骤s2中的生物硒采用对比例2所得的生物硒进行替换。
38.试验例一：酶活性及甲醇含量的检测1、试验对象：实施例2~4和对比例3~6得的蜂蜜果蔬酵素原液。
39.2、试验方法：参照国标：gb/t15038-2006中的气相色谱法检测甲醇含量。
40.3、试验结果：试验结果如表1所示。
41.表1实施例2~4和对比例3~6所得的蜂蜜果蔬酵素原液的甲醇含量检测由表1可知：与对照组相比，实施例2组，实施例3组和实施例4组中的甲醇含量均显著降低，其中实施例4组效果最好，为本发明的最佳实施例。而对比例组与实施例组的试验结果表明，本发明中添加的复合发酵菌粉可显著提高巴斯德毕赤酵母菌株的活性。
42.试验例二：抑菌测试试验对象：实施例2~4和对比例3~7所得的蜂蜜果蔬酵素原液。
43.试验方法：制作抑菌实验平板：往灭菌平板中倒入8ml琼脂营养液，待其凝固后在琼脂上放牛津杯；并分别向含有沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的斜面培养基中加入5ml生理盐水，然后震荡，再从中取1ml注入5ml无菌生理盐水中，充分震荡，再重复上述梯度稀释3次，制备稀释度为10-4
的菌悬液；用漩涡振荡器将菌悬液震荡均匀后取1ml加入25ml营养培养基中，混匀后倒入上述凝固好的待用琼脂平板中，拔出牛津杯，在所留下的孔中加入100μl蜂蜜果蔬酵素原液，即制成抑菌实验平板；所述琼脂营养液为4g牛肉膏、11g蛋白胨、5g氯化钠、7.5g琼脂和蒸馏水制成1000ml溶液，调解ph值为7.0、121℃条件下灭菌20min。
44.试验结果：试验结果如表2所示。
45.表2实施例2~4和对比例3~7所得的蜂蜜果蔬酵素原液的抑菌测试由表2可知：实施例的抑菌测试结果显示，本发明所得的蜂蜜果蔬酵素原液对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均较敏感，能很好地抑制杂菌生长。
46.对比例7制备方法的步骤s3中采用的对比例2所得硒化菌株，结果显示其对沙门氏
菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等的抑制效果明显变弱；而对比例3-6中复合发酵菌粉改变以后，所得的蜂蜜果蔬酵素原液对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制效果也有一定影响。
47.试验例三：有机硒含量测试1、试验对象：实施例1和对比例1、2所得的富硒植物乳杆菌植物亚种菌株。
48.2、试验方法：按食品安全国家标准gb5009.93-2017《食品中硒的测定》方法测定每克干重酵母有机硒含量。
49.3、试验结果：表3实施例1和对比例1、2所得的富硒植物乳杆菌植物亚种菌株有机硒含量由表3可知，采用本发明实施例1的方法的制得的生物硒中的有机硒含量达到了4189μg/g，而对比例1和对比例2中的有机硒含量较实施例1明显下降，可以看出，在本发明制备生物硒的培养基中添加一定量的维生素e，可以显著的提高植物乳杆菌植物亚种菌株的富硒量。
50.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。