分离、检测和分析胎儿细胞的组合物和方法与流程

分离、检测和分析胎儿细胞的组合物和方法
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2019年7月15日提交的美国临时申请号62/874,306的优先权，将其公开内容通过引用以其整体而并入。


背景技术：

2.在过去的四十年里，研究者一直试图分离孕妇中的胎儿细胞以开发产前诊断工具。在20世纪70年代初期，首次开发了羊膜穿刺术，随后在20世纪80年代开发了绒毛膜绒毛取样(cvs)。羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样(cvs)是常规临床实践中用于诊断染色体异常如常见胎儿非整倍性(染色体的额外拷贝)(例如13、18和21号染色体的三体性(导致唐氏综合征))的两种侵入性方法。
3.在妊娠期间从母体血液中分离胎儿细胞和胎儿dna的能力已经为改进非侵入性产前测试开辟了令人激动的机会。最近，在产前筛查中引入了称为非侵入性产前检测(nipt)的基于无细胞dna的筛查(cfdna)，并且已经被公认为对21三体具有高度预测性。然而，筛查性能低于侵入性诊断工具，并且仍然需要确认性测试。此外，根据专业协会(practice bulletin n163 obstet gynecol.2016；127(5)979-981)，nipt不能预测拷贝数变异(cnv)或微缺失/重复。因此，目前的无细胞nipt还不足以以高特异性、灵敏度和阳性预测值检测亚染色体缺失和重复。
4.鉴于母体血液中胎儿细胞的稀缺，对来自母体循环的胎儿细胞的直接分析迄今一直具有挑战性。已经测试了许多不同的富集方法，包括过滤器、密度梯度、荧光激活细胞分选(facs)、微流体和免疫磁珠。尽管可以回收循环胎儿细胞，但这些方法缺乏一致性和再现性。这是由于极低数量的循环胎儿细胞(1ml含有约1-5百万个细胞的母体血液中有0.1-10个细胞)迄今为止一直阻碍了可再现方案的建立。挑战是在不损失妊娠早期非常少的循环胎儿细胞的情况下消除所有污染性有核血细胞。
5.考虑到这些限制，以及羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样(cvs)是具有相关流产风险的程序的事实，需要开发新的基于细胞的nipd(非侵入性产前诊断)程序以从孕妇的母体血液中选择胎儿细胞，从而筛查出生缺陷和遗传病。
6.已知胎儿有核红细胞(nrbc)和滋养层细胞存在于母体循环中，但是一直难以开发可靠的基于细胞遗传细胞的nipt形式。最近，已经提出了开发能够以与目前通过羊膜穿刺术和cvs可以获得的类似的准确度检测异常的基于细胞的nipt形式的可能性(amy m.breman等人,prenatal diagnosis,2016,36(11):1009-1019)。
7.本文公开了胎儿细胞标记物和结合它们的试剂。本文进一步公开了用于基于胎儿细胞标记物分离、检测和分析胎儿细胞的组合物、试剂盒和方法。


技术实现要素：

8.本文公开了一种用于检测来自怀孕受试者的样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与第一抗体接触，其中所述样品包含多个细胞；(b)分离结合至所述第
一抗体的细胞以产生富集样品；(c)使所述富集样品与第二抗体接触；以及(d)将结合至所述第二抗体的细胞鉴定为胎儿细胞，其中所述第一抗体或所述第二抗体：(i)是与髓系细胞触发受体样转录因子2(triggering receptor expressed on myeloid cells like 2，treml2)蛋白结合的抗体；或(ii)包含与treml2蛋白结合的抗原结合片段。
9.在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿有核红细胞(fnrbc)。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是滋养层细胞。
10.在一些实施方案中，所述第一抗体与一个或多个磁性颗粒缀合。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述磁性颗粒与第一外源性聚集增强因子(eaef)偶联，所述第一eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
11.在一些实施方案中，步骤(a)包括添加第二eaef以诱导所述磁性颗粒的聚集，所述第二eaef包含所述特异性结合对的另一成员。
12.在一些实施方案中，步骤(b)包括使所述样品经受磁场。
13.在一些实施方案中，步骤(b)包括向所述富集样品中添加所述特异性结合对的成员以逆转所述富集样品中所述磁性颗粒的聚集。
14.在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前，向所述样品中添加至少一种选自还原剂、免疫复合物、螯合剂和二氨基丁烷的聚集抑制剂。在一些实施方案中，所述聚集抑制剂是螯合剂。在一些实施方案中，所述螯合剂是乙二胺四乙酸(edta)。
15.在一些实施方案中，所述第二抗体是与treml2蛋白结合的抗体或包含与treml2蛋白结合的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述treml2蛋白包含如seq id no:1所示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述treml2蛋白包含如seq id no:2-5中任一个所示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。
16.在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(d)之前，分离单个胎儿细胞。
17.在一些实施方案中，通过分离结合至所述第二抗体的单个胎儿细胞来分离单个胎儿细胞。
18.在一些实施方案中，所述第二抗体与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，所述标记选自藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc)、辣根过氧化物酶(hrp)和生物素。
19.在一些实施方案中，分离单个胎儿细胞是基于免疫荧光技术。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(facs)分离单个胎儿细胞。在一些实施方案中，通过deparray分离单个细胞。
20.在一些实施方案中，步骤(d)包括进行测序分析。在一些实施方案中，所述测序分析包含短串联重复(str)分析。
21.在一些实施方案中，所述方法进一步包括分析所述胎儿细胞。在一些实施方案中，分析所述胎儿细胞包括进行基因组或遗传分析。在一些实施方案中，进行遗传分析包括检测所述胎儿细胞中一种或多种遗传异常的存在或不存在。
22.在一些实施方案中，所述第一抗体是与treml2蛋白结合的抗体或包含与treml2蛋白结合的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述treml2蛋白包含如seq id no:1所示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述treml2蛋白包含如seq id no:2-5中任一个所示的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。
23.在一些实施方案中，与treml2蛋白结合的所述抗体或与treml2蛋白结合的抗原结合片段包含一个或多个选自以下的cdr：(i)包含seq id no:6的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)互补决定区(cdr)1；(ii)包含seq id no:7的氨基酸序列的hcvr cdr2；(iii)包含seq id no:8的氨基酸序列的hcvr cdr3；(iv)包含seq id no:9的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)cdr1；(v)包含seq id no:10的氨基酸序列的lcvr cdr2；和(vi)包含seq id no:11的氨基酸序列的lcvr cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，与treml2蛋白结合的所述抗体或与treml2蛋白结合的抗原结合片段包含选自(i)-(vi)的2、3、4、5或6个cdr。
24.在一些实施方案中，与treml2蛋白结合的所述抗体是抗treml2抗体。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体选自sc-109096、arp49877_p050、oaca04996、af3259、ma5-30973、pa5-47471、abin634968、abin928294、30-552、abin2463297、abin19999041、11655-r001、abin749888、bs-2737r、abin1999045、11655-rp02、abin293207、abin2387613、t8282-40、abin4249314、nbp1-70737-20ul和bd563661。
25.本文进一步公开了一种用于检测来自怀孕受试者的样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与磁性试剂接触，其中所述样品包含多个细胞，其中所述磁性试剂包含与第一抗体缀合的磁性颗粒，并且其中所述第一抗体与选自epcam、cd105和cd71的蛋白质结合；(b)使所述样品与抗treml2抗体或其抗原结合片段接触；以及(c)将结合至所述抗treml2抗体的细胞鉴定为胎儿细胞。
26.在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(c)之前，分离结合至所述第一抗体的细胞。在一些实施方案中，分离细胞包括使所述样品经受磁场以使所述样品富集结合至所述第一抗体的细胞。
27.在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒小于200nm。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约80至200nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约90至150nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少50％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少60％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有在70％至90％之间的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒包含被包衣分子包围的超顺磁性材料的结晶核。
28.在一些实施方案中，所述磁性颗粒与第一外源性聚集增强因子(eaef)进一步偶联，所述第一eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
29.在一些实施方案中，所述方法包括在步骤(a)期间添加第二eaef以增加所述颗粒的聚集，其中所述第二eaef包含所述特异性结合对的另一成员。
30.在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述富集样品中添加所述特异性结合对的成员(第三eaef)以逆转所述样品中所述磁性试剂的聚集，从而促进所述细胞的鉴定。
31.在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前，向所述样品中添加至少一种选自还原剂、免疫复合物、螯合剂、二氨基丁烷的聚集抑制剂。在一些实施方案中，所述聚集抑制剂是螯合剂。在一些实施方案中，所述螯合剂是edta。
32.在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(c)之前，使用所述抗treml2抗体或第二抗体分离所述细胞。在一些实施方案中，所述第二抗体选自抗细胞角蛋白抗体和抗hlag抗体。
33.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或所述第二抗体与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，所述标记选自藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc)、辣根过氧化物酶(hrp)和生物素。
34.在一些实施方案中，分离所述细胞是基于免疫荧光技术。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(facs)分离所述细胞。在一些实施方案中，通过deparray分离所述细胞。
35.在一些实施方案中，鉴定所述细胞包括进行测序分析。
36.在一些实施方案中，所述测序分析包含短串联重复(str)分析。
37.在一些实施方案中，所述方法进一步包括分析所述胎儿细胞。在一些实施方案中，分析所述胎儿细胞包括进行基因组或遗传分析。在一些实施方案中，进行遗传分析包括检测所述胎儿细胞中一种或多种遗传异常的存在或不存在。
38.在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿成红细胞或胎儿滋养层细胞。
39.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含一个或多个选自以下的互补决定区(cdr)：(i)包含seq id no:6的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)cdr1；(ii)包含seq id no:7的氨基酸序列的hcvr cdr2；(iii)包含seq id no:8的氨基酸序列的hcvr cdr3；(iv)包含seq id no:9的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)cdr1；(v)包含seq id no:10的氨基酸序列的lcvr cdr2；和(vi)包含seq id no:11的氨基酸序列的lcvr cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。
40.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体选自sc-109096、arp49877_p050、oaca04996、af3259、ma5-30973、pa5-47471、abin634968、abin928294、30-552、abin2463297、abin19999041、11655-r001、abin749888、bs-2737r、abin1999045、11655-rp02、abin293207、abin2387613、t8282-40、abin4249314、nbp1-70737-20ul和bd563661。
41.本文进一步公开了一种用于检测来自怀孕受试者的样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与第一抗体接触，其中所述样品包含多个细胞，并且其中所述第一抗体与髓系细胞触发受体样转录因子2(treml2)蛋白(抗treml2抗体)或其抗原结合片段结合；以及(b)将结合至所述第一抗体的细胞鉴定为胎儿细胞。
42.在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿有核红细胞(fnrbc)。
43.在一些实施方案中，所述第一抗体与一个或多个磁性颗粒缀合。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒小于200nm。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约80至200nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约90至150nm之间。在一
些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少50％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少60％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有在70％至90％之间的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒包含被包衣分子包围的超顺磁性材料的结晶核。
44.在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品经受磁场。
45.在一些实施方案中，所述磁性颗粒与第一外源性聚集增强因子(eaef)偶联，其中所述第一eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
46.在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前，添加第二eaef以增加所述磁性颗粒的聚集，其中所述第二eaef包含所述特异性结合对的另一成员。
47.在一些实施方案中，所述方法进一步包括分离结合至所述第一抗体的细胞以产生富集样品。
48.在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述富集样品中添加第三eaef以逆转所述富集样品中所述磁性颗粒的聚集，其中所述第三eaef能够与所述第一eaef或所述第二eaef结合。在一些实施方案中，所述第三eaef是所述特异性结合对的成员。
49.在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前，向所述样品中添加至少一种选自还原剂、免疫复合物、螯合剂和二氨基丁烷的聚集抑制剂。在一些实施方案中，所述聚集抑制剂是螯合剂。在一些实施方案中，所述螯合剂是edta。
50.在一些实施方案中，所述第一抗体与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，所述标记选自藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc)、辣根过氧化物酶(hrp)和生物素。
51.在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(b)之前，分离结合至所述第一抗体的细胞，其中分离细胞是基于免疫荧光技术。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(facs)分离结合至所述第一抗体的细胞。在一些实施方案中，通过deparray分离结合至所述第一抗体的细胞。
52.在一些实施方案中，步骤(b)包括进行测序分析。在一些实施方案中，所述测序分析包含短串联重复(str)分析。在一些实施方案中，所述方法进一步包括分析所述胎儿细胞。在一些实施方案中，分析所述胎儿细胞包括进行基因组或遗传分析。在一些实施方案中，进行遗传分析包括检测所述胎儿细胞中一种或多种遗传异常的存在或不存在。
53.在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含一个或多个选自以下的cdr、由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列的hcvr cdr1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列的lcvr cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列的lcvr cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含选自(a)-(f)的2、3、4、5或6个cdr，由其组成或基本上由其组成。
54.在一些实施方案中，所述第一抗体选自sc-109096、arp49877_p050、oaca04996、af3259、ma5-30973、pa5-47471、abin634968、abin928294、30-552、abin2463297、abin19999041、11655-r001、abin749888、bs-2737r、abin1999045、11655-rp02、abin293207、abin2387613、t8282-40、abin4249314、nbp1-70737-20ul和bd563661。
55.本文进一步公开了一种用于基于细胞的胎儿遗传测试的方法，所述方法包括：(a)使获自怀孕受试者的样品与抗treml2抗体或其抗原结合片段接触，其中所述样品包含多个细胞；(b)分离结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞；(c)分析来自结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的所述细胞的一种或多种核酸分子；以及(d)基于对所述一种或多种核酸分子的分析生成报告，其中所述报告提供胎儿具有一种或多种遗传异常的可能性。
56.在一些实施方案中，结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的所述细胞是胎儿细胞。
57.在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿成红细胞。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿滋养层细胞。
58.在一些实施方案中，分析所述一种或多种核酸分子包括进行核型分析。
59.在一些实施方案中，分析所述一种或多种核酸分子包括进行测序分析。在一些实施方案中，所述测序分析包含短串联重复(str)分析。
60.在一些实施方案中，所述一种或多种遗传异常选自三体性、性染色体异常和结构异常。在一些实施方案中，所述三体性选自3三体、4三体、6三体、7三体、8三体、9三体、10三体、11三体、12三体、13三体、16三体、17三体、18三体、20三体、21三体和22三体。在一些实施方案中，所述性染色体异常选自x单体、x三体和克兰费尔特综合征。在一些实施方案中，所述结构异常是拷贝数变异(cnv)。在一些实施方案中，所述结构异常是cnv的缺失或cnv的重复。
61.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体与磁性颗粒缀合。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。
62.在一些实施方案中，步骤(b)包括使所述样品经受磁场。
63.在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前，使所述样品与第一抗体接触，其中所述第一抗体与选自epcam、cd105和cd71的蛋白质结合。
64.在一些实施方案中，进一步包括在步骤(a)之前，分离结合至所述第一抗体的细胞。
65.在一些实施方案中，所述第一抗体与磁性颗粒缀合。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒小于200nm。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约80至200nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约90至150nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少50％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少60％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有在70％至90％之间的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒包含被包衣分子包围的超顺磁性材料的结晶核。
66.在一些实施方案中，分离结合至所述第一抗体的细胞包括使所述样品经受磁场。
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。
67.在一些实施方案中，分离结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞是基于免疫荧光技术。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(facs)分离结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞。在一些实施方案中，通过deparray分离结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞。
68.在一些实施方案中，所述方法进一步包括使结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的所述细胞与第二抗体或其抗原结合片段接触。
69.在一些实施方案中，所述第二抗体是抗treml2抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第二抗体与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。
70.在一些实施方案中，所述方法进一步包括分离结合至所述第二抗体或其抗原结合片段的细胞。在一些实施方案中，分离结合至所述第二抗体或其抗原结合片段的细胞是基于免疫荧光技术。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(facs)分离结合至所述第二抗体或其抗原结合片段的细胞。在一些实施方案中，通过deparray分离结合至所述第二抗体或其抗原结合片段的细胞。
71.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体选自sc-109096、arp49877_p050、oaca04996、af3259、ma5-30973、pa5-47471、abin634968、abin928294、30-552、abin2463297、abin19999041、11655-r001、abin749888、bs-2737r、abin1999045、11655-rp02、abin293207、abin2387613、t8282-40、abin4249314、nbp1-70737-20ul和bd563661。
72.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含一个或多个选自以下的cdr、由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列的hcvr cdr1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列的lcvr cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列的lcvr cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含选自(i)-(vi)的2、3、4、5或6个cdr，由其组成或基本上由其组成。
73.本文进一步公开了一种从获自怀孕受试者的母体样品制备胎儿细胞样品的方法，所述方法包括：(a)使包含胎儿细胞和母体细胞的所述母体样品与第一抗体缀合物接触，其中所述第一抗体缀合物包含(i)第一抗体；和(ii)胶体磁性颗粒，其中所述第一抗体与所述胶体磁性颗粒缀合；以及(b)通过使所述母体样品经受磁场来分离结合至所述第一抗体缀合物的细胞，从而制备胎儿细胞样品。
74.在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒小于200nm。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约80至200nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约90至150nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少50％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少60％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有在70％至90％之间的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒包含被包衣分子包围的超顺磁性材料的结晶核。
75.在一些实施方案中，所述磁性颗粒与第一外源性聚集增强因子(eaef)偶联，其中所述第一eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
76.在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述母体样品中添加第二eaef，其中所述第二eaef包含所述特异性结合对的另一成员。
77.在一些实施方案中，所述第一抗体是抗treml2抗体。
78.在一些实施方案中，所述第一抗体是抗cd71抗体。
79.在一些实施方案中，所述第一抗体与选自epcam和cd105的蛋白质结合。
80.在一些实施方案中，制备所述胎儿细胞样品进一步包括使分离自所述母体样品的所述细胞与第二抗体接触。
81.在一些实施方案中，所述第二抗体与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。
82.在一些实施方案中，制备所述胎儿细胞样品进一步包括分离结合至所述第二抗体的细胞。
83.在一些实施方案中，分离结合至所述第二抗体的细胞是基于免疫荧光技术。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(facs)分离结合至所述第二抗体的细胞。在一些实施方案中，通过deparray分离结合至所述第二抗体的细胞。
84.本文进一步公开了一种用于检测来自怀孕受试者的样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与第一抗体缀合物接触，其中所述样品包含多个细胞，并且其中所述第一抗体包含与胶体磁性颗粒缀合的第一抗体；(b)通过使所述样品经受磁场来分离结合至所述第一抗体的细胞，从而产生富集样品；(c)使所述富集样品与第二抗体接触，其中所述第二抗体与胎儿细胞表面上的标记物结合；以及(d)将结合至所述第二抗体的细胞鉴定为胎儿细胞。
85.在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿有核红细胞(fnrbc)。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿滋养层细胞。
86.在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒小于200nm。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约80至200nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约90至150nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少50％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少60％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有在70％至90％之间的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒包含被包衣分子包围的超顺磁性材料的结晶核。
87.在一些实施方案中，所述磁性颗粒与第一外源性聚集增强因子(eaef)偶联，其中所述第一eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
88.在一些实施方案中，步骤(a)包括添加第二eaef以增加所述磁性颗粒的聚集，所述
第二eaef包含所述特异性结合对的另一成员。
89.在一些实施方案中，步骤(b)包括向所述富集样品中添加所述特异性结合对的成员以逆转所述富集样品中所述磁性颗粒的聚集。
90.在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前，向所述样品中添加至少一种选自还原剂、免疫复合物、螯合剂和二氨基丁烷的聚集抑制剂。在一些实施方案中，所述聚集抑制剂是螯合剂。在一些实施方案中，所述螯合剂是edta。
91.在一些实施方案中，所述第二抗体是与treml2蛋白结合的抗体或包含与treml2蛋白结合的抗原结合片段。
92.在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(d)之前，分离单个胎儿细胞。在一些实施方案中，通过分离结合至所述第二抗体的单个胎儿细胞来分离单个胎儿细胞。
93.在一些实施方案中，所述第二抗体与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，所述标记选自藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc)、辣根过氧化物酶(hrp)和生物素。
94.在一些实施方案中，分离单个胎儿细胞是基于免疫荧光技术。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(facs)分离单个胎儿细胞。在一些实施方案中，通过deparray分离单个细胞。
95.在一些实施方案中，步骤(d)包括进行测序分析。在一些实施方案中，所述测序分析包含短串联重复(str)分析。
96.在一些实施方案中，所述方法进一步包括分析所述胎儿细胞。在一些实施方案中，分析所述胎儿细胞包括进行基因组或遗传分析。在一些实施方案中，进行遗传分析包括检测所述胎儿细胞中一种或多种遗传异常的存在或不存在。
97.在一些实施方案中，所述第一抗体是与treml2蛋白结合的抗体或包含与treml2蛋白结合的抗原结合片段。
98.在一些实施方案中，与treml2蛋白结合的所述抗体或与treml2蛋白结合的抗原结合片段包含一个或多个选自以下的cdr、由其组成或基本上由其组成：(i)包含seq id no:6的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)互补决定区(cdr)1；(ii)包含seq id no:7的氨基酸序列的hcvr cdr2；(iii)包含seq id no:8的氨基酸序列的hcvr cdr3；(iv)包含seq id no:9的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)cdr1；(v)包含seq id no:10的氨基酸序列的lcvr cdr2；和(vi)包含seq id no:11的氨基酸序列的lcvr cdr3。在一些实施方案中，与treml2蛋白结合的所述抗体或与treml2蛋白结合的抗原结合片段包含选自(i)-(vi)的2、3、4、5或6个cdr。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。
99.在一些实施方案中，与treml2蛋白结合的所述抗体选自sc-109096、arp49877_p050、oaca04996、af3259、ma5-30973、pa5-47471、abin634968、abin928294、30-552、abin2463297、abin19999041、11655-r001、abin749888、bs-2737r、abin1999045、11655-rp02、abin293207、abin2387613、t8282-40、abin4249314、nbp1-70737-20ul和bd563661。
100.本文进一步公开了抗treml2抗体。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含一个或多个选自以下的cdr、由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列的hcvr cdr1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列的hcvr cdr2；(c)包含
seq id no:8的氨基酸序列的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列的lcvr cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列的lcvr cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含选自(a)-(f)的两个或更多个cdr。在一些实施方案中，其中所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含选自(a)-(f)的三个或更多个cdr。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含选自(a)-(f)的四个或更多个cdr。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含选自(a)-(f)的五个或更多个cdr。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含(a)-(f)中的所有cdr。
101.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，所述标记选自藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc)、辣根过氧化物酶(hrp)和生物素。
102.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段与磁性颗粒缀合。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒小于200nm。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约80至200nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约90至150nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少50％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少60％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有在70％至90％之间的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒包含被包衣分子包围的超顺磁性材料的结晶核。
103.在一些实施方案中，所述磁性颗粒与第一外源性聚集增强因子(eaef)偶联，其中所述第一eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
104.本文公开了一种抗treml2抗体缀合物，其包含(a)抗treml2抗体或其抗原结合片段；和(b)磁性颗粒，其中所述磁性颗粒与所述抗treml2抗体缀合。
105.在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒小于200nm。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约80至200nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒在约90至150nm之间。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少50％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有至少60％的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒具有在70％至90％之间的磁质量。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒包含被包衣分子包围的超顺磁性材料的结晶核。
106.在一些实施方案中，所述磁性颗粒与第一外源性聚集增强因子(eaef)偶联，其中所述第一eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
107.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含一个或多个选自以下的cdr、由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列的hcvr cdr1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列的lcvr cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列的lcvr cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含选自(a)-(f)的两个或更多个cdr、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含选自(a)-(f)的三个或更多个cdr、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含选自(a)-(f)的四个或更多个cdr、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含选自(a)-(f)的五个或更多个cdr、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含(a)-(f)中的所有cdr、由其组成或基本上由其组成。
108.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体选自sc-109096、arp49877_p050、oaca04996、af3259、ma5-30973、pa5-47471、abin634968、abin928294、30-552、abin2463297、abin19999041、11655-r001、abin749888、bs-2737r、abin1999045、11655-rp02、abin293207、abin2387613、t8282-40、abin4249314、nbp1-70737-20ul和bd563661。
109.本文进一步公开了用于分离、检测和/或分析胎儿细胞的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：(a)与髓系细胞触发受体样转录因子2(treml2)蛋白结合的抗体(抗treml2抗体)或其抗原结合片段；和(b)包含胶体磁性颗粒的磁性试剂。
110.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体选自sc-109096、arp49877_p050、oaca04996、af3259、ma5-30973、pa5-47471、abin634968、abin928294、30-552、abin2463297、abin19999041、11655-r001、abin749888、bs-2737r、abin1999045、11655-rp02、abin293207、abin2387613、t8282-40、abin4249314、nbp1-70737-20ul和bd563661。
111.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含一个或多个选自以下的互补决定区(cdr)、由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列的重链可变区(hcvr)cdr1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列的轻链可变区(lcvr)cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列的lcvr cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。
112.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段与标记缀合以产生缀合的抗体。在一些实施方案中，所述标记选自藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc)、辣根过氧化物酶(hrp)和生物素。
113.在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒的尺寸小于200nm。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体颗粒。
114.在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒与抗体或其抗原结合片段缀合。
115.在一些实施方案中，所述抗体是抗treml2抗体。在一些实施方案中，所述抗treml2
抗体或其抗原结合片段包含一个或多个选自以下的cdr、由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列的hcvr cdr1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列的lcvr cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列的lcvr cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含选自(i)-(vi)的2、3、4、5或6个cdr，由其组成或基本上由其组成。
116.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体选自sc-109096、arp49877_p050、oaca04996、af3259、ma5-30973、pa5-47471、abin634968、abin928294、30-552、abin2463297、abin19999041、11655-r001、abin749888、bs-2737r、abin1999045、11655-rp02、abin293207、abin2387613、t8282-40、abin4249314、nbp1-70737-20ul和bd563661。
117.在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含选自以下的抑制剂、由其组成或基本上由其组成：还原剂、免疫复合物、螯合剂、二氨基丁烷。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含螯合剂、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述螯合剂是edta。
118.在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含外源性聚集增强因子(eaef)、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员、由其组成或基本上由其组成：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
119.本文进一步公开了试剂盒，其包含(a)能够与胎儿细胞表面上表达的蛋白质结合的第一抗体，其中所述第一抗体结合至胶体磁性颗粒；和(b)抗treml2抗体或其抗原结合片段。
120.在一些实施方案中，所述第一抗体与选自epcam、cd105和cd71的蛋白质结合。
121.在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体颗粒。
122.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含一个或多个选自以下的cdr、由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列的hcvr cdr1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列的lcvr cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列的lcvr cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。
123.在一些实施方案中，所述抗treml2抗体选自sc-109096、arp49877_p050、oaca04996、af3259、ma5-30973、pa5-47471、abin634968、abin928294、30-552、abin2463297、abin19999041、11655-r001、abin749888、bs-2737r、abin1999045、11655-rp02、abin293207、abin2387613、t8282-40、abin4249314、nbp1-70737-20ul和bd563661。
124.在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含选自以下的抑制剂、由其组成或基本上由其组成：还原剂、免疫复合物、螯合剂、二氨基丁烷。在一些实施方案中，所述螯合剂是edta。
125.在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含外源性聚集增强因子(eaef)、由其组
成或基本上由其组成，其中所述eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员、由其组成或基本上由其组成：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
附图说明
126.图1描绘了用于分离、检测和分析稀有细胞的示例性方法。
127.图2描绘了示例性铁磁流体结构。
128.图3描绘了用于检测稀有细胞的示例性方法。
129.图4描绘了用于分离和检测稀有细胞的示例性方法。
130.图5a-图5e描绘了使用facs仪器对细胞进行门控。
131.图6描绘了用于分离、检测和分析稀有细胞的示例性方法。
132.图7描绘了经由受控的聚集的铁磁流体聚集的示意图。
133.图8：用于胎儿细胞富集的示意性工作流程：从孕妇的全血中富集并染色胎儿细胞。通过使用deparray
tm
分离纯的单个细胞，用于全基因组扩增和基因组分析。
134.图9分离自胎儿血液样品的成红细胞的门控策略：(1)fsc-a/ssc-a门控主要细胞群(2)门控sytox green阴性活细胞(3)fsc-h/w排除双联体细胞(4)门控双阳性gpa/hoechst(5)门控cd71阳性/cd45阴性(6)门控tls1/treml2并与同种型对照叠加以确定treml2阳性细胞的％。
135.图10分离自骨髓样品的成红细胞的门控策略：(1)fsc-a/ssc-a门控主要细胞群(2)门控sytox green阴性活细胞(3)fsc-h/w排除双联体细胞(4)门控双阳性gpa/hoechst(5)门控cd71阳性/cd45阴性(6)门控tls1/treml2并与同种型对照叠加以确定treml2阳性细胞的％。
[0136][0137]
图11a-图11j显示了分离自来自各种克隆的各种胎儿血液(fb)样品的胎儿成红细胞上的tls1/treml2表达。
[0138]
图12a-图12l显示了分离自来自各种克隆的各种骨髓(bm)样品的成人成红细胞上的tls1/treml2表达。
[0139]
图13显示了在掺加cd105-ff和epcam-ff并用其富集后通过deparray
tm
鉴定的tls1/treml-2阳性滋养层细胞的散点图分析。
[0140]
图14显示了图像库：滋养层细胞显示treml-2-pe抗体染色、ck-apc和细胞核染色阳性。
[0141]
图15a显示了掺入健康供体血液并用cd71-ff富集的draq5/hoechst阳性成红细胞的散点图分析。图15b显示了图像库：成红细胞显示cd71-pe抗体染色、draq5和hoechst细胞核染色阳性，并且cd45-fitc抗体染色阴性。
[0142]
图16a显示了掺入健康供体血液并用tls1/treml-2-ff富集的draq5/hoechst阳性成红细胞的散点图分析。图16b显示了图像库：成红细胞显示cd71-pe抗体染色、draq5和hoechst细胞核染色阳性，并且cd45-fitc抗体染色阴性。
[0143]
图17显示了分离自母体血液的单个胎儿细胞的str分析。
[0144]
图18显示了单个胎儿细胞的cnv分析结果。
[0145]
图19显示了健康供体单个细胞的cnv分析结果。
[0146]
图20描绘了用于分离和检测稀有细胞的示例性方法。
具体实施方式
[0147]
本文公开了用于分离、检测和/或分析样品中的稀有细胞的组合物、试剂盒和方法。通常，本文公开的组合物、试剂盒和方法包含与髓系细胞触发受体样转录因子2(treml2)蛋白(此蛋白在整个申请中也称为tls1)结合的试剂。可替代地或另外地，本文公开的组合物、试剂盒和方法包含抗体缀合物。所述抗体缀合物包含与胶体磁性颗粒缀合的抗体。所述稀有细胞可以是胎儿细胞。所述样品可以是来自怀孕受试者的样品。
[0148]
用于分离、检测和/或表征稀有细胞的方法
[0149]
本文公开了用于分离、检测和/或表征稀有细胞的方法。在一些实施方案中，所述稀有细胞是胎儿细胞。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿有核红细胞(fnrbc)。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是滋养层细胞。通常，所述方法包括使用抗treml2抗体或其抗原结合片段来将细胞鉴定为胎儿细胞。可替代地或另外地，所述方法包括使用与胶体磁性颗粒缀合的抗体来分离胎儿细胞。
[0150]
本文公开了用于检测来自怀孕受试者的样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与抗treml2抗体或其抗原结合片段接触，其中所述样品包含多个细胞；以及(b)将结合至所述抗treml2抗体的细胞鉴定为胎儿细胞。
[0151]
本文进一步公开了用于检测来自怀孕受试者的样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与第一抗体或其抗原结合片段接触，其中所述样品包含多个细胞；(b)分离结合至所述第一抗体或其抗原结合片段的细胞以产生富集样品；(c)使所述富集样品与第二抗体或其抗原结合片段接触；以及(d)将结合至所述第二抗体的细胞鉴定为胎儿细胞，其中所述第一抗体或所述第二抗体是与髓系细胞触发受体样转录因子2(treml2)蛋白结合的抗体。
[0152]
本文进一步公开了用于检测来自怀孕受试者的样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与磁性试剂接触，其中所述样品包含多个细胞，其中所述磁性试剂包含与第一抗体或其抗原结合片段缀合的磁性颗粒，并且其中所述第一抗体或其抗原结合片段与选自epcam、cd105和cd71的蛋白质结合；(b)使所述样品与抗treml2抗体或其抗原结合片段接触；以及(c)将结合至所述抗treml2抗体的细胞鉴定为胎儿细胞。
[0153]
本文进一步公开了用于检测来自怀孕受试者的样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与磁性试剂接触，其中所述样品包含多个细胞，其中所述磁性试剂包含与第一抗体或其抗原结合片段缀合的胶体磁性颗粒，并且其中所述第一抗体或其抗原结合片段与选自epcam、cd105和cd71的蛋白质结合；(b)使所述样品与第二抗体或其抗原结合片段接触；以及(c)将结合至所述第二抗体的细胞鉴定为胎儿细胞。
[0154]
本文进一步公开了用于检测来自怀孕受试者的样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与磁性试剂和第二外源性聚集增强因子(eaef)接触，其中所述样品包含多个细胞，其中所述磁性试剂包含与第一抗体或其抗原结合片段缀合的胶体磁性颗
粒，其中所述胶体磁性颗粒与第一eaef缀合，并且其中所述第一抗体或其抗原结合片段与选自epcam、cd105和cd71的蛋白质结合；(b)使所述样品与第二抗体或其抗原结合片段接触；以及(c)将结合至所述第二抗体的细胞鉴定为胎儿细胞。在一些实施方案中，所述第一eaef包含特异性结合对的第一成员，并且所述第二eaef包含所述特异性结合对的第二成员，其中所述特异性结合对选自生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
[0155]
本文进一步公开了用于检测来自怀孕受试者的样品中的胎儿细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与第一抗体缀合物接触，其中所述样品包含多个细胞，并且其中所述第一抗体缀合物包含与胶体磁性颗粒缀合的第一抗体或其抗原结合片段；(b)通过使所述样品经受磁场来分离结合至所述第一抗体的细胞，从而产生富集样品；(c)使所述富集样品与第二抗体或其抗原结合片段接触，其中所述第二抗体与胎儿细胞表面上的标记物结合；以及(d)将结合至所述第二抗体的细胞鉴定为胎儿细胞。
[0156]
本文进一步公开了从获自怀孕受试者的母体样品制备胎儿细胞样品的方法，所述方法包括：(a)使包含胎儿细胞和母体细胞的所述母体样品与第一抗体缀合物接触，其中所述第一抗体缀合物包含(i)第一抗体或其抗原结合片段；和(ii)胶体磁性颗粒，其中所述第一抗体与所述胶体磁性颗粒缀合；以及(b)通过使所述母体样品经受磁场来分离结合至所述第一抗体缀合物的细胞，从而制备胎儿细胞样品。
[0157]
本文进一步公开了从获自怀孕受试者的母体样品制备胎儿细胞样品的方法，所述方法包括：(a)使包含胎儿细胞和母体细胞的所述母体样品与第一抗体缀合物和第二外源性聚集增强因子(eaef)接触，其中所述第一抗体缀合物包含(i)第一抗体或其抗原结合片段；(ii)胶体磁性颗粒；和(iii)第一eaef，其中所述第一抗体与所述胶体磁性颗粒缀合，并且其中所述第一eaef与所述胶体磁性颗粒缀合；以及(b)通过使所述母体样品经受磁场来分离结合至所述第一抗体缀合物的细胞，从而制备胎儿细胞样品。在一些实施方案中，所述第一eaef包含特异性结合对的第一成员，并且所述第二eaef包含所述特异性结合对的第二成员，其中所述特异性结合对选自生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
[0158]
本文进一步公开了从获自怀孕受试者的母体样品制备胎儿细胞样品的方法，所述方法包括：(a)使包含胎儿细胞和母体细胞的所述母体样品与第一抗体缀合物接触，其中所述第一抗体缀合物包含(i)第一抗体或其抗原结合片段；和(ii)胶体磁性颗粒，其中所述第一抗体与所述胶体磁性颗粒缀合并且其中所述第一抗体是抗treml2抗体；以及(b)通过使所述母体样品经受磁场来分离结合至所述第一抗体缀合物的细胞，从而制备胎儿细胞样品。
[0159]
本文进一步公开了从获自怀孕受试者的母体样品制备胎儿细胞样品的方法，所述方法包括：(a)使包含胎儿细胞和母体细胞的所述母体样品与第一抗体缀合物和第二外源性聚集增强因子(eaef)接触，其中所述第一抗体缀合物包含(i)第一抗体或其抗原结合片
段；和(ii)胶体磁性颗粒，其中所述第一抗体与所述胶体磁性颗粒缀合，并且其中所述胶体磁性颗粒与第一eaef缀合；以及(b)通过使所述母体样品经受磁场来分离结合至所述第一抗体缀合物的细胞，从而制备胎儿细胞样品。在一些实施方案中，所述第一eaef包含特异性结合对的第一成员，并且所述第二eaef包含所述特异性结合对的第二成员，其中所述特异性结合对选自生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
[0160]
在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿有核红细胞(fnrbc)。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是成红细胞。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是滋养层细胞。
[0161]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括分离结合至所述抗treml2抗体或所述第一抗体的细胞，其中分离所述细胞发生在鉴定细胞之前。
[0162]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法包括使用第一抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体与一个或多个磁性颗粒缀合。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。
[0163]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法包括分离结合至第一抗体或其抗原结合片段的细胞。在一些实施方案中，分离细胞包括使所述样品经受磁场。
[0164]
在一些实施方案中，所述磁性颗粒与第一外源性聚集增强因子(eaef)偶联，所述第一eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
[0165]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法包括添加第二eaef以诱导所述磁性颗粒的聚集，所述第二eaef包含所述特异性结合对的另一成员。
[0166]
在一些实施方案中，分离结合至所述第一抗体或其抗原结合片段的细胞包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：向所述富集样品中添加所述特异性结合对的成员，以逆转所述富集样品中所述磁性颗粒的聚集。
[0167]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法包括向所述样品中添加至少一种选自还原剂、免疫复合物、螯合剂和二氨基丁烷的聚集抑制剂。在一些实施方案中，聚集抑制剂是螯合剂。在一些实施方案中，所述螯合剂是edta。所述还原剂可以是巯基乙磺酸。所述聚集抑制剂可以是牛血清白蛋白(bsa)。
[0168]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法使用第二抗体。在一些实施方案中，所述第二抗体是与treml2蛋白结合的抗体，或包含与treml2蛋白结合的抗原结合片段、由其组成或基本上由其组成。
[0169]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法包括分离单个胎儿细胞。在一些实施方案中，通过分离结合至所述第二抗体的单个胎儿细胞来分离单个胎儿细胞。
[0170]
在一些实施方案中，所述第二抗体与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，分离单个胎儿细胞是基于免疫荧光技术。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(facs)分离单个胎儿细胞。在一些实施方案中，通过deparray分离单个细胞。
[0171]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法包括对分离自胎儿细胞的一种或多种核酸分子进行测序分析。在一些实施方案中，所述测序分析包含短串联重复(str)分析。
[0172]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法包括分析胎儿细胞。在一些实施方案中，分析所述胎儿细胞包括进行基因组或遗传分析。在一些实施方案中，进行遗传分析包括检测所述胎儿细胞中一种或多种遗传异常的存在或不存在。
[0173]
在一些实施方案中，所述第一抗体是与treml2蛋白结合的抗体或包含与treml2蛋白结合的抗原结合片段。
[0174]
在一些实施方案中，与treml2蛋白结合的所述抗体或与treml2蛋白结合的抗原结合片段包含1、2、3、4、5或6个选自以下的cdr：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的重链可变区(hcvr)互补决定区(cdr)1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的轻链可变区(lcvr)cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个取代、添加或缺失。
[0175]
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体与一个或多个磁性颗粒缀合。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。在一些实施方案中，分离细胞包括将所述样品置于磁力分离器中。在一些实施方案中，分离细胞包括使所述样品经受磁场。
[0176]
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，分离细胞包括流式细胞术。在一些实施方案中，流式细胞术是荧光激活细胞分选(facs)。
[0177]
在一些实施方案中，分离细胞包括进行deparray。
[0178]
在一些实施方案中，鉴定所述细胞包括进行测序反应。
[0179]
在一些实施方案中，所述样品是在使所述样品与所述抗treml2抗体接触之前富集胎儿细胞的样品。在一些实施方案中，通过使所述样品与铁磁流体试剂接触来富集所述样品中的胎儿细胞，其中所述铁磁流体包含与铁磁流体偶联的抗体。
[0180]
在一些实施方案中，所述抗体与选自epcam、cd105和cd71的蛋白质结合。
[0181]
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括分离与所述铁磁流体偶联的抗体所结合的细胞，从而产生富集胎儿细胞的样品。
[0182]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括进行测序分析。在一些实施方案中，所述测序分析包含短串联重复(str)分析。
[0183]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括分析所述胎儿细胞。在一些实施方案中，分析所述胎儿细胞包括检测一种或多种胎儿异常的存在或不存在。在一些实施方案中，分析所述胎儿细胞包括进行基因组分析。在一些实施方案中，分析所述胎儿细胞包括进行遗传分析。在一些实施方案中，进行遗传分析包括检测所述胎儿细胞中一种或多种遗传异常的存在或不存在。在一些实施方案中，进行遗传分析包括检测所述胎儿细胞中染色体异常的存在或不存在。在一些实施方案中，所述染色体异常是21三体、18三体或13三
体。
[0184]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括对所述胎儿细胞进行遗传测试。在一些实施方案中，对所述胎儿细胞进行遗传测试包括检测一种或多种胎儿异常的存在或不存在。在一些实施方案中，对所述胎儿细胞进行遗传测试包括进行基因组分析。在一些实施方案中，对所述胎儿细胞进行遗传测试包括进行遗传分析。在一些实施方案中，进行遗传分析包括检测所述胎儿细胞中染色体异常的存在或不存在。在一些实施方案中，所述染色体异常是21三体、18三体或13三体。
[0185]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括基于所述胎儿细胞的分析结果提供治疗建议。在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括基于所述胎儿细胞的遗传测试结果提供治疗建议。
[0186]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括基于所述胎儿细胞的分析结果向所述受试者施用疗法。在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括基于所述胎儿细胞的遗传测试结果向所述受试者施用疗法。
[0187]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括基于所述胎儿细胞的分析结果推荐对所述受试者或胎儿的额外监测。在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括基于所述胎儿细胞的遗传测试结果推荐对所述受试者或胎儿的额外监测。
[0188]
图1描绘了用于分离、检测和/或分析稀有细胞的示例性方法。本文公开的方法可以包括图1所示的一个或多个步骤、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：(a)从受试者获得包含多个细胞的样品(101)；以及(b)分离稀有细胞(110)。在一些实施方案中，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：(a)从受试者获得包含多个细胞的样品(101)；(b)分离稀有细胞(110)；以及(c)分析所述稀有细胞(120)。在一些实施方案中，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：(a)从受试者获得包含多个细胞的样品(101)；(b)分离稀有细胞(110)；(c)分析所述稀有细胞(120)；以及(d)基于对所述稀有细胞的分析生成一个或多个报告(106)。
[0189]
如图1所示，在一些实施方案中，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：(a)从受试者获得包含多个细胞的样品(101)；(b)通过以下方式分离稀有细胞(110)：(i)从所述样品中耗尽非稀有细胞以产生富集的稀有细胞样品(102)；并且(ii)从所述富集的稀有细胞样品中分离稀有细胞(103)；(c)通过以下方式分析所述稀有细胞(120)：(i)从所述稀有细胞中纯化核酸分子(104)；并且(ii)对一种或多种核酸分子测序(105)；以及(f)生成一个或多个报告(106)。在一些实施方案中，所述稀有细胞是胎儿细胞。在一些实施方案中，富集稀有细胞(102)包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：使所述样品与铁磁流体接触，其中所述铁磁流体包含与磁性颗粒偶联的抗体，并且其中所述抗体与所述稀有细胞上的标记物结合。在一些实施方案中，所述稀有细胞上的标记物是本文公开的任何标记物。在一些实施方案中，所述稀有细胞上的标记物是treml2蛋白。在一些实施方案中，所述抗体是本文公开的任何抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗treml2抗体。在一些实施方案中，所述抗体是本文公开的任何抗treml2抗体。在一些实施方案中，所述铁磁流体包含图2所描绘的铁磁流体结构、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，富集稀有细胞(102)进一步包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：对所述样品应用外部梯度磁力
分离器以除去未结合至所述铁磁流体的细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：使所述稀有细胞与一种或多种另外的抗体接触，其中所述一种或多种另外的抗体与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，在分离所述稀有细胞(103)之前使所述稀有细胞与一种或多种另外的抗体接触。在一些实施方案中，分离稀有细胞(103)包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：选择与所述稀有细胞上的标记物结合的抗体所结合的单个细胞。在一些实施方案中，所述抗体是抗treml2抗体。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体是本文公开的任何抗treml2抗体。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体包含(a)包含seq id no:6的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的重链可变区(hcvr)互补决定区(cdr)1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的轻链可变区(lcvr)cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr3。在一些实施方案中，分离稀有细胞(103)包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：从富集的细胞样品中分选稀有细胞。在一些实施方案中，分离稀有细胞(103)包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：进行荧光激活细胞分选(facs)。在一些实施方案中，分离稀有细胞(103)包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：进行deparray。在一些实施方案中，从所述稀有细胞中纯化核酸分子(104)包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：进行核酸扩增。在一些实施方案中，从所述稀有细胞中纯化核酸分子(104)包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：产生核酸文库。
[0190]
图3描绘了用于检测稀有细胞(例如，胎儿细胞)的示例性方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：(a)使包含多个细胞(302，303)的样品(301)与第一抗体或其抗原结合片段(304)接触；以及(b)将所述第一抗体或其抗原结合片段(304)所结合的细胞(303)鉴定为胎儿细胞。在一些实施方案中，所述第一抗体(304)是与treml2蛋白结合的抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段(304)与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含本文公开的任一种抗treml2抗体、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的重链可变区(hcvr)互补决定区(cdr)1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的轻链可变区(lcvr)cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr3。所述第一抗体或其抗原结合片段可以与磁性颗粒偶联。例如，所述第一抗体或抗原结合片段可以呈铁磁流体的形式。可替代地，所述第一抗体或抗原结合片段可以与标记缀合。所述标记可以是本文公开的任何标记。例如，所述第一抗体或抗原结合片段可以与荧光标记缀合。可以通过本文公开的任何鉴定技术来鉴定所述细胞。在一些实施方案中，鉴定结合至所述第一抗体或其抗原结合片段的细胞包括分离结合至所述第一抗体或其抗原结合片段的细胞。分离所述细胞可以包括本文公开的任何细胞分离技术。在一些实
施方案中，分离所述细胞包括磁分离。在一些实施方案中，鉴定所述细胞可以包括使用显微镜。鉴定所述细胞可以包括荧光显微术。在一些实施方案中，鉴定所述细胞包括或是基于facs。可替代地或另外地，鉴定所述细胞包括或是基于deparray。
[0191]
图4描绘了用于分离和检测稀有细胞的示例性方法。在一些实施方案中，用于检测稀有细胞的方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：(a)使包含多个细胞(402，403)的样品(401)与抗体缀合物(406)接触，其中所述抗体缀合物(406)包含与磁性颗粒(405)偶联的第一抗体或抗原结合片段(404)；(b)通过使所述样品经受磁场(407)并除去未结合至所述抗体缀合物的细胞(402)来富集稀有细胞(403)，从而产生富集的稀有细胞样品(411)；(c)使所述富集的稀有细胞样品(411)与抗体缀合物(410)接触，其中所述抗体缀合物(410)包含与标记(409)缀合的第二抗体或抗原结合片段(408)；以及(d)将结合至所述抗体缀合物的细胞鉴定为稀有细胞(403)。在一些实施方案中，所述稀有细胞是胎儿细胞。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿有核红细胞(fnrbc)。在一些实施方案中，所述富集的稀有细胞样品(411)包含结合至所述抗体缀合物(406)的稀有细胞(403)，其中所述抗体缀合物包含与所述磁性颗粒(405)缀合的第一抗体(404)或其抗原结合片段(404)。可替代地或另外地，进一步处理所述富集的稀有细胞样品(411)以从所述抗体缀合物(406)中分离所述稀有细胞(403)。在一些实施方案中，所述第一抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，所述第一抗体或抗原结合片段和所述第二抗体或抗原结合片段均与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，(a)所述第一抗体或抗原结合片段或(b)所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，(a)所述第一抗体或抗原结合片段与选自epcam、cd105和cd71的蛋白质结合；并且(b)所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，(a)所述第一抗体或抗原结合片段与epcam结合；并且(b)所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，(a)所述第一抗体或抗原结合片段与cd105结合；并且(b)所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，(a)所述第一抗体或抗原结合片段与cd71结合；并且(b)所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，与treml2结合的所述抗体或抗原结合片段是本文公开的任何抗treml2抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含1、2、3、4、5或6个选自以下的cdr，由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的重链可变区(hcvr)互补决定区(cdr)1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的轻链可变区(lcvr)cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr3。在一些实施方案中，所述第二抗体是与所述第一抗体结合的抗体。例如，如果所述第一抗体是山羊igg抗体，则所述第二抗体可以是小鼠抗山羊igg抗体。在一些实施方案中，所述标记是本文公开的任何标记。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述磁性颗粒与第一外源性聚集增强因子
(eaef)进一步缀合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)期间，使所述样品(401)与能够与所述第一eaef结合的第二eaef接触。在一些实施方案中，添加所述第二eaef诱导所述抗体缀合物(406)的聚集。在一些实施方案中，所述方法进一步包括添加能够与所述第一或第二外源性聚集增强因子结合的第三eaef。在一些实施方案中，添加所述第三eaef逆转所述第一eaef的聚集。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)之前，向所述样品中添加聚集抑制剂。可以通过本文公开的任何鉴定技术来鉴定所述细胞。在一些实施方案中，鉴定所述细胞可以包括使用显微镜。鉴定所述细胞可以包括荧光显微术。在一些实施方案中，鉴定所述细胞包括或是基于facs。可替代地或另外地，鉴定所述细胞包括或是基于deparray。
[0192]
图20描绘了用于分离和检测稀有细胞的另一种示例性方法。如图20所示，在一些实施方案中，用于检测稀有细胞的方法包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：步骤(a1)：使包含多个细胞(2002，2003)的样品(2001)与第一抗体缀合物(2006)和第二外源性聚集增强因子(eaef)(2011)接触，其中所述第一抗体缀合物(2006)包含与磁性颗粒(2005)偶联的第一抗体或抗原结合片段(2004)，其中所述磁性颗粒(2005)与第一eaef(2012)进一步缀合；以及步骤(b1)：通过使所述样品经受磁场(2007)并除去未结合至抗体缀合物(2006)-第二eaef(2011)复合物的细胞(2002)来富集稀有细胞(2003)，从而产生富集的稀有细胞样品(2011)。如步骤(a2)所示，添加所述第二eaef(2011)诱导所述第一抗体缀合物(2006)的聚集。在一些实施方案中，所述方法进一步包括步骤(b2)：向所述富集的稀有细胞样品(2011)中添加第三eaef(2013)。如步骤(b3)所示，添加所述第三eaef(2013)逆转所述第一抗体缀合物(2006)的聚集。在一些实施方案中，所述方法进一步包括步骤(c)：使所述富集的稀有细胞样品(2011)与第二抗体缀合物(2010)接触，其中所述第二抗体缀合物(2010)包含与标记(2009)缀合的第二抗体或抗原结合片段(2008)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括步骤(d)：将结合至所述第一抗体缀合物(2006)的细胞鉴定为稀有细胞(2003)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括步骤(d)：将结合至所述第二抗体缀合物(2010)的细胞鉴定为稀有细胞(2003)。在一些实施方案中，所述稀有细胞是胎儿细胞。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿有核红细胞(fnrbc)。在一些实施方案中，所述富集的稀有细胞样品(2011)包含结合至所述第一抗体缀合物(2006)的稀有细胞(2003)，其中所述第一抗体缀合物包含与所述磁性颗粒(2005)缀合的第一抗体(2004)或其抗原结合片段(2004)，其中所述磁性颗粒(2005)与所述第一eaef(2012)进一步缀合。可替代地或另外地，进一步处理所述富集的稀有细胞样品(2011)以从所述抗体缀合物(2006)中分离所述稀有细胞(2003)。在一些实施方案中，所述第一抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，所述第一抗体或抗原结合片段和所述第二抗体或抗原结合片段均与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，(a)所述第一抗体或抗原结合片段或(b)所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，(a)所述第一抗体或抗原结合片段与选自epcam、cd105和cd71的蛋白质结合；并且(b)所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，(a)所述第一抗体或抗原结合片段与epcam结合；并且(b)所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，(a)所述第一抗体或抗原结合片段与cd105结合；并且(b)所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，(a)所述第一
抗体或抗原结合片段与cd71结合；并且(b)所述第二抗体或抗原结合片段与treml2蛋白结合。在一些实施方案中，与treml2结合的所述抗体或抗原结合片段是本文公开的任何抗treml2抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含1、2、3、4、5或6个选自以下的cdr，由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的重链可变区(hcvr)互补决定区(cdr)1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的轻链可变区(lcvr)cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr3。在一些实施方案中，所述第二抗体是与所述第一抗体结合的抗体。例如，如果所述第一抗体是山羊igg抗体，则所述第二抗体可以是小鼠抗山羊igg抗体。在一些实施方案中，所述标记是本文公开的任何标记。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述胶体磁性颗粒是铁磁流体磁性颗粒。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a1)之前，向所述样品中添加聚集抑制剂。在一些实施方案中，所述第一eaef(2012)是脱硫生物素。在一些实施方案中，所述第二eaef(2011)是链霉亲和素。在一些实施方案中，所述第三eaef(2013)是生物素。可以通过本文公开的任何鉴定技术来鉴定所述细胞。在一些实施方案中，鉴定所述细胞可以包括使用显微镜。鉴定所述细胞可以包括荧光显微术。在一些实施方案中，鉴定所述细胞包括或是基于facs。可替代地或另外地，鉴定所述细胞包括或是基于deparray。在一些实施方案中，鉴定所述细胞包括或是基于基于免疫的测定。
[0193]
尽管本文公开的方法可以列举抗treml2抗体或其抗原结合片段或者包含所述抗treml2抗体的抗体缀合物的使用，但任何这些方法均可以通过使用可以与treml2蛋白结合的任何试剂或包含可以与treml2蛋白结合的试剂的缀合物来进行。因此，本文公开的方法不限于抗treml2抗体或其抗原结合片段或者包含所述抗treml2抗体的抗体缀合物的使用。
[0194]
用于基于细胞的胎儿遗传测试的方法
[0195]
新型胎儿细胞标记物(如treml-2)的鉴定允许分离和/或检测胎儿细胞并随后分析此类细胞。因此，本文公开了用于基于细胞的胎儿遗传测试的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(a)使用抗treml2抗体从来自怀孕受试者的样品分离胎儿细胞；以及(b)分析来自所述胎儿细胞的一种或多种核酸分子以确定所述胎儿具有一种或多种遗传异常的可能性。可替代地，所述方法包括使用本文公开的用于分离或检测胎儿细胞的任何方法分离胎儿细胞，以及分析来自所分离或检测的胎儿细胞的一种或多种核酸分子以确定所述胎儿具有一种或多种遗传异常的可能性。在一些实施方案中，所述方法包括分析通过本文公开的任何方法分离和/或检测的胎儿细胞。在一些实施方案中，所述方法包括分析通过本文公开的任何方法制备的胎儿细胞。
[0196]
本文公开了用于基于细胞的胎儿遗传测试的方法，所述方法包括：(a)使获自怀孕受试者的样品与抗treml2抗体或其抗原结合片段接触，其中所述样品包含多个细胞；(b)分离结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞；(c)分析来自结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞的一种或多种核酸分子；以及(d)基于对所述一种或多种核酸分子的分析生成报告，其中所述报告提供胎儿具有一种或多种遗传异常的可能性。
[0197]
本文公开了用于基于细胞的胎儿遗传测试的方法，所述方法包括：(a)使获自怀孕受试者的样品与第一抗体或其抗原结合片段接触，其中所述样品包含多个细胞，其中所述第一抗体或抗原结合片段与胶体磁性颗粒缀合，并且其中所述第一抗体或其抗原结合片段与胎儿细胞上的标记物结合；(b)分离结合至所述第一抗体或其抗原结合片段的细胞；(c)分析来自结合至所述第一抗体或其抗原结合片段的细胞的一种或多种核酸分子；以及(d)基于对所述一种或多种核酸分子的分析生成报告，其中所述报告提供胎儿具有一种或多种遗传异常的可能性。
[0198]
本文公开了用于基于细胞的胎儿遗传测试的方法，所述方法包括：(a)使获自怀孕受试者获得的样品与第一抗体或其抗原结合片段和第二外源性聚集增强因子(eaef)接触，其中所述样品包含多个细胞，其中所述第一抗体或抗原结合片段与胶体磁性颗粒缀合，其中所述胶体磁性颗粒与第一eaef缀合，并且其中所述第一抗体或其抗原结合片段与胎儿细胞上的标记物结合；(b)分离结合至所述第一抗体或其抗原结合片段的细胞；(c)分析来自结合至所述第一抗体或其抗原结合片段的细胞的一种或多种核酸分子；以及(d)基于对所述一种或多种核酸分子的分析生成报告，其中所述报告提供胎儿具有一种或多种遗传异常的可能性。在一些实施方案中，所述第一eaef包含特异性结合对的第一成员，并且所述第二eaef包含所述特异性结合对的第二成员，其中所述特异性结合对选自生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
[0199]
在一些实施方案中，所述第一抗体是抗treml2抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体是抗cd71抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体是抗epcam抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体是抗cd105抗体。在一些实施方案中，当所述第一抗体是抗ecam抗体或抗cd105抗体时，所述方法进一步包括使所分离的细胞与第二抗体或其抗原结合片段接触，其中所述第二抗体与所述胎儿细胞上的标记物结合。在一些实施方案中，所述第二抗体是抗treml2抗体。在一些实施方案中，所述第二抗体是抗cd71抗体。在一些实施方案中，所述第二抗体或其抗原结合片段与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，所述方法进一步包括分离结合至所述第二抗体的细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括分析来自结合至所述第二抗体或其抗原结合片段的细胞的核酸分子。
[0200]
在一些实施方案中，结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞是胎儿细胞。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿成红细胞。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿有核红细胞(fnrbc)。在一些实施方案中，所述胎儿细胞是胎儿滋养层细胞。
[0201]
在一些实施方案中，分析所述一种或多种核酸分子包括进行核型分析。可以使用本领域已知的任何技术进行核型分析。
[0202]
在一些实施方案中，分析所述一种或多种核酸分子包括进行测序分析。可以使用本领域已知的任何技术进行测序分析。在一些实施方案中，所述测序分析包含短串联重复(str)分析。
[0203]
在一些实施方案中，分析所述一种或多种核酸分子包括进行一个或多个扩增反应。可以通过本领域已知的任何技术进行核酸扩增。在一些实施方案中，通过聚合酶链式反应(pcr)进行核酸扩增。
[0204]
在一些实施方案中，所述一种或多种遗传异常选自三体性、性染色体异常和结构异常。在一些实施方案中，所述遗传异常是三体性。在一些实施方案中，所述三体性选自3三体、4三体、6三体、7三体、8三体、9三体、10三体、11三体、12三体、13三体、16三体、17三体、18三体、20三体、21三体和22三体。在一些实施方案中，所述遗传异常是性染色体异常。在一些实施方案中，所述性染色体异常选自x单体、x三体和克兰费尔特综合征。在一些实施方案中，所述遗传异常是结构异常。在一些实施方案中，所述结构异常是拷贝数变异(cnv)。在一些实施方案中，所述结构异常是cnv的缺失或cnv的重复。
[0205]
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段与磁性颗粒缀合。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。
[0206]
在一些实施方案中，分离结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞包括使所述样品经受磁场。
[0207]
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括在使所述样品与所述抗treml2抗体接触之前，使所述样品与第一抗体接触，其中所述第一抗体与选自epcam、cd105和cd71的蛋白质结合。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括在使所述样品与所述抗treml2抗体接触之前，分离结合至所述第一抗体的细胞。在一些实施方案中，所述第一抗体与磁性颗粒缀合。在一些实施方案中，所述磁性颗粒是胶体磁性颗粒。在一些实施方案中，分离结合至所述第一抗体的细胞包括使所述样品经受磁场。
[0208]
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，分离结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞是基于免疫荧光技术。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(facs)分离结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞。在一些实施方案中，通过deparray分离结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞。
[0209]
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括使结合至所述抗treml2抗体或其抗原结合片段的细胞与第二抗体或其抗原结合片段接触。在一些实施方案中，第二抗体是抗treml2抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述第二抗体与标记缀合。在一些实施方案中，所述标记是荧光标记。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括分离结合至所述第二抗体或其抗原结合片段的细胞。在一些实施方案中，分离结合至所述第二抗体或其抗原结合片段的细胞是基于免疫荧光技术。在一些实施方案中，通过荧光激活细胞分选(facs)分离结合至所述第二抗体或其抗原结合片段的细胞。在一些实施方案中，通过deparray分离结合至所述第二抗体或其抗原结合片段的细胞。
[0210]
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体选自sc-109096、arp49877_p050、oaca04996、af3259、ma5-30973、pa5-47471、abin634968、abin928294、30-552、abin2463297、abin19999041、11655-r001、abin749888、bs-2737r、abin1999045、11655-rp02、abin293207、abin2387613、t8282-40、abin4249314、nbp1-70737-20ul和bd563661。可替代地或另外地，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含1、2、3、4、5或6个选自以下的cdr，由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的重链可变区(hcvr)互补决定区(cdr)1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组
成的轻链可变区(lcvr)cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含两个或更多个氨基酸取代、添加或缺失。
[0211]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括基于所述胎儿细胞的遗传测试结果提供治疗建议。
[0212]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括基于所述胎儿细胞的遗传测试结果向所述受试者施用疗法。
[0213]
在一些实施方案中，本文公开的任何方法进一步包括基于所述胎儿细胞的遗传测试结果推荐对所述受试者或胎儿的额外监测。
[0214]
尽管本文公开的方法可以列举抗treml2抗体或其抗原结合片段或者包含所述抗treml2抗体的抗体缀合物的使用，但任何这些方法均可以通过使用可以与treml2蛋白结合的任何试剂或包含可以与treml2蛋白结合的试剂的缀合物来进行。因此，本文公开的方法不限于抗treml2抗体或其抗原结合片段或者包含所述抗treml2抗体的抗体缀合物的使用。
[0215]
结合稀有细胞标记物的试剂
[0216]
本文公开了结合稀有细胞标记物的试剂。如本文所用，“稀有细胞标记物”是稀有细胞(例如，胎儿细胞)上的标记物(例如，细胞表面蛋白)。所述稀有细胞标记物可以是在稀有细胞上比样品中的另一种类型的细胞以更高水平表达的细胞表面蛋白。所述稀有细胞标记物可以是髓系细胞触发受体样转录因子2(treml2)蛋白。所述稀有细胞标记物可以是人treml2蛋白。所述人treml2蛋白可以具有seq id no:1的氨基酸序列。可替代地，所述稀有细胞标记物可以是cd71。在一些实施方案中，所述稀有细胞标记物不是cd71。
[0217]
如本文所用，术语“treml2”和“tls1”是指相同的蛋白质并且可互换使用。tls1和treml2是指具有对应于seq id no:1的氨基酸序列的相同序列并且包含具有seq id no:2-5的氨基酸序列的结构域和片段的相同标记物。
[0218]
如本文所用，“稀有细胞”是指以小于总细胞群的10％的浓度存在于来自受试者的样品中的细胞，其中所述样品是未纯化的或未富集的样品。在一些实施方案中，所述稀有细胞以小于总细胞群的9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的浓度存在于所述样品中。在一些实施方案中，所述稀有细胞以小于总细胞群的1％的浓度存在于所述样品中。在一些实施方案中，所述稀有细胞是胎儿细胞，并且所述样品来自怀孕受试者。
[0219]
如本文所用，术语“未纯化的样品”或“未富集的样品”可以可互换使用，并且是指获自受试者的尚未以从样品中除去或分离细胞的方式进行处理的样品。可替代地或另外地，未纯化的样品或未富集的样品是指获自受试者的尚未耗尽一种或多种细胞的样品。可替代地或另外地，未纯化或未富集的样品是指获自受试者的含有多种不同细胞类型的样品。
[0220]
在一些实施方案中，结合稀有细胞标记物的试剂选自抗体、抗体片段、受体和配体。在一些实施方案中，所述抗体片段包含抗体的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述抗体片段选自单价抗原结合片段(fab或fab')、二价抗原结合片段((fab)2或(fab’)2)、可变片段(fv)、单链可变片段(scfv)、二价双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体和双特异性
scfv(bis-scfv)。
[0221]
通常，单价fab片段具有一个抗原结合位点，而二价(fab)2片段具有通过二硫键连接的两个抗原结合区。fab片段由抗体的重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)以及重链1恒定区(c
h1
)和轻链1恒定区(c
l1
)组成。fv片段具有由重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)组成的抗原结合位点，但是缺乏fab的恒定区(ch1和c
l
)。vh和v
l
在fv片段中通过非共价相互作用结合在一起。fab可以是二聚体(fab2)或三聚体(fab3)，其允许分别结合2或3种不同的抗原。
[0222]
可以改变v结构域的方向和接头长度以产生不同形式的fv分子。通常，当接头为至少12个残基长时，scfv片段主要是单体的。3-11个残基长的接头产生不能折叠成功能性fv结构域的scfv分子。这些分子与第二scfv分子缔合，这产生二价双抗体。如果接头长度小于三个残基，则可以形成三抗体或四抗体。微型抗体是组装成二价二聚体的scfv-ch3融合蛋白。bis-scfv片段由具有两个不同可变结构域的scfv片段组成，并且能够同时结合两个不同的表位。
[0223]
所述抗体可以是多克隆抗体。可替代地或另外地，所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是免疫球蛋白γ(igg)抗体。所述igg抗体可以是igg1抗体。所述igg抗体可以是igg2抗体。所述igg抗体可以是igg3抗体。所述igg抗体可以是igg4抗体。所述抗体可以是免疫球蛋白μ(igm)抗体。所述抗体可以是免疫球蛋白ε(ige)抗体。所述抗体可以是免疫球蛋白δ(igd)抗体。所述抗体可以是免疫球蛋白α(iga)抗体。所述igga抗体可以是igga1抗体。可替代地，所述igg抗体是igga2抗体。
[0224]
在一些实施方案中，所述试剂是与treml2蛋白结合的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段与treml2蛋白的胞外结构域结合。在一些实施方案中，所述胞外结构域具有seq id no:2的氨基酸序列。可替代地，所述抗体或抗体片段可以与treml2的胞外结构域的片段结合。胞外结构域的所述片段具有seq id no:3-4的氨基酸序列。所述抗体或抗体片段可以与treml2蛋白的n末端结构域结合。
[0225]
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体是多克隆抗体。所述多克隆抗体可以选自抗treml2抗体，其选自sc-109096(santa cruz biotechnology,inc.)、arp49877_p050(aviva systems biology)、oaca04996(aviva systems biology)、af3259(r&d systems)、pa5-47471(thermo fisher)、abin634968(antibodies-online.com)、abin928294(antibodies-online.com)、30-552(prosci)、abin2463297(antibodies-online.com)、abin749888(antibodies-online.com)、bs-2737r(bioss)、abin1999045(antibodies-online.com)、11655-rp02(sino biological)、abin293207(antibodies-online.com)、abin2387613(antibodies-online.com)、t8282-40(usbio)、abin4249314(antibodies-online.com)和nbp1-70737-20ul(novus biologicals)。
[0226]
所述抗treml2抗体可以是单克隆抗体。所述单克隆抗体可以选自ma5-30973(thermo fisher)、abin19999041(antibodies-online.com)、11655-r001(sino biological)和bd563661(fisher scientific)。
[0227]
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含1、2、3、4、5或6个选自以下的cdr，由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的重链可变区(hcvr)互补决定区(cdr)1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列、由其
组成或基本上由其组成的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的轻链可变区(lcvr)cdr1；(e)包含seq id no:10的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr3。
[0228]
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含1、2或3个选自以下的cdr，由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的重链可变区(hcvr)互补决定区(cdr)1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr2；和(c)包含seq id no:8的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr3。
[0229]
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含1、2或3个选自以下的cdr，由其组成或基本上由其组成：(a)包含seq id no:9的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的轻链可变区(lcvr)cdr1；(b)包含seq id no:10的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr2；和(c)包含seq id no:11的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr3。
[0230]
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：(a)包含seq id no:6的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的重链可变区(hcvr)互补决定区(cdr)1；(b)包含seq id no:7的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr2；(c)包含seq id no:8的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的hcvr cdr3；(d)包含seq id no:9的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的轻链可变区(lcvr)cdr1；和(e)包含seq id no:10的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr2；和(f)包含seq id no:11的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的lcvr cdr3。
[0231]
在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个、两个或三个或更多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，seq id no:6包含一个、两个或三个或更多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，seq id no:7包含一个、两个或三个或更多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，seq id no:8包含一个、两个或三个或更多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，seq id no:9包含一个、两个或三个或更多个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，seq id no:10包含一个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，seq id no:11包含一个、两个或三个或更多个氨基酸取代、添加或缺失。
[0232]
在一些实施方案中，所述抗treml2抗体与标记缀合以产生缀合的抗体。在一些实施方案中，所述标记选自荧光标记、放射性核素、酶标记、化学发光标记和半抗原。在一些实施方案中，所述可检测标记是半抗原。在一些实施方案中，所述半抗原选自dcc、生物素、硝基吡唑、噻唑磺酰胺、苯并呋咱和2-羟基喹喔啉。在一些实施方案中，所述可检测标记是生物素。在一些实施方案中，所述标记是荧光分子。在一些实施方案中，所述荧光分子选自荧光团、花青染料和近红外(nir)染料。在一些实施方案中，所述荧光分子是荧光素。在一些实施方案中，所述荧光分子是异硫氰酸荧光素(fitc)。在一些实施方案中，所述标记选自藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc)、辣根过氧化物酶(hrp)和生物素。在一些实施方案中，所述缀合的抗体选自abin6070559(antibodies-online.com)、abx307664(abbexa，多克隆)、
abin6070561(antibodies-online.com)、abx307665(abbexa，多克隆)、abin2662892(antibodies-online.com)、bld-351203(biolegend)、abin2662891(antibodies-online.com)、bld-351204(biolegend)、abin2662890(antibodies-online.com，单克隆)和bld-351104(biolegend)。
[0233]
磁性颗粒
[0234]
本文公开的方法、组合物和试剂盒可以包含或使用磁性颗粒。例如，本文公开的任何抗体(或更一般地，结合稀有细胞标记物的任何试剂)可以与磁性颗粒缀合。在一些实施方案中，与稀有细胞标记物(例如，treml2)结合的试剂与磁性颗粒缀合。所述磁性颗粒可以是胶体磁性颗粒。所述胶体磁性颗粒可以是铁磁流体。
[0235]
如本文所用，术语“磁性颗粒”是指可以使用磁场操纵的颗粒。磁性颗粒包含金属。金属的例子包括但不限于铁、镍、钴和铜。
[0236]
如本文所用，术语“胶体磁性颗粒”是指用非磁性材料包被的磁性颗粒。非磁性颗粒的例子是牛血清白蛋白(bsa)。
[0237]
如本文所用，术语“铁磁流体磁性颗粒”是指含有铁的胶体磁性颗粒。
[0238]
在一些实施方案中，所述磁性颗粒的特征在于它们的亚微米粒度。在一些实施方案中，所述颗粒的直径通常小于约300纳米(nm)、275nm、250nm、225nm、200nm、190nm、180nm、170nm、160nm、150nm、140nm、130nm、120nm、110nm或100nm。在一些实施方案中，所述颗粒的直径通常为至少10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm或120nm或更大。在一些实施方案中，所述颗粒的直径在约40nm至250nm、40nm至200nm、50nm至200nm、50nm至190nm、50nm至180nm、50nm至170nm、60nm至200nm、70nm至200nm、80nm至200nm、90nm至200nm、90nm至175nm或90nm至150nm之间。
[0239]
在一些实施方案中，所述颗粒具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％或更多的磁质量。在一些实施方案中，所述颗粒具有在约40％至95％、45％至95％、50％至90％、55％至90％、60％至90％或70％至90％之间的磁质量。
[0240]
在一些实施方案中，可以使用在90-150nm范围内并且具有在70％-90％之间的磁质量的颗粒。
[0241]
在一些实施方案中，所述颗粒的特征在于它们对从溶液中重力分离的抗性。所述颗粒可以长时间抵抗重力分离。所述颗粒可以抵抗重力分离至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、105或120分钟或更长时间。所述颗粒可以抵抗重力分离至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、105或120小时或更长时间。所述颗粒可以抵抗重力分离至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、105或120天或更长时间。
[0242]
在一些实施方案中，磁性颗粒由被包衣分子包围的超顺磁性材料的结晶核构成，所述包衣分子结合(例如，物理吸附或共价连接)到磁核并且赋予稳定的胶体性质。所述包衣材料可以以有效防止样品中发现的生物大分子与磁核之间的非特异性相互作用的量施加。此类生物大分子可以包括非靶细胞表面上的唾液酸残基、凝集素、糖蛋白和其他膜组分。此外，所述包衣材料可以含有尽可能高的磁质量/纳米颗粒比。构成核的磁性晶体的尺寸足够小，使得它们不含有完整的磁畴。纳米颗粒的尺寸使得它们的布朗能超过它们的磁
矩。因此，即使在中等强度的磁场中，也不会发生这些胶体磁性颗粒的北极-南极排列和随后的相互吸引/排斥，这有助于它们的溶液稳定性。
[0243]
所述磁性颗粒在高磁梯度外场分离器中可以是可分离的。该特征有利于样品处理，并且提供了优于装载有铁磁珠或钢丝绒的更复杂的内部梯度柱的经济优势。
[0244]
磁性颗粒可以通过如ep0842042中所述的基础材料的改性来制备，将其通过引用以其整体而并入。
[0245]
磁性颗粒可以用能够识别对应于实施例1中鉴定的首选候选物的差异表达蛋白质的ab(或更一般地任何试剂)包被。在一些实施方案中，磁性颗粒可以用与稀有细胞标记物(例如，treml2)结合的试剂包被。磁性颗粒可以用本文公开的任何抗体或试剂包被。
[0246]
可以通过本领域已知的任何方法进行磁性颗粒的包被。例如，磁性颗粒可以用如us6365362b1中所述的抗体包被，将其通过引用以其整体而并入。
[0247]
图2描绘了示例性铁磁流体磁性颗粒结构。本文公开的铁磁流体磁性颗粒可以包含图2所示的铁磁流体磁性颗粒结构、由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，本文公开的铁磁流体磁性颗粒具有图2所示的铁磁流体磁性颗粒结构。如图2所示，示例性铁磁流体磁性颗粒结构包含被牛血清白蛋白(bsa)包围的铁原子、由其组成或基本上由其组成。bsa与链霉亲和素(sa)连接，后者与生物素(bt)连接。bt可以与另一个bsa连接，后者与外源性聚集增强因子(例如，脱硫生物素(dt-bt))连接。bt还可以与和稀有细胞上的标记物结合的抗体(y)连接。在一些实施方案中，所述稀有细胞是胎儿细胞。在一些实施方案中，所述标记物是treml2。可替代地，所述标记物是epcam、cd105或cd71。
[0248]
图7描绘了经由受控的聚集的磁性颗粒聚集的示意图。如图7所示，磁性颗粒(如图2的铁磁流体磁性颗粒)与外源性聚集增强因子(eaef，例如脱硫生物素(dt-bt))偶联。添加能够与所述第一eaef结合的第二eaef(例如，链霉亲和素(sa))促进抗体-磁性颗粒缀合物的聚集。在一些实施方案中，通过添加第三eaef逆转抗体-磁性颗粒缀合物的聚集，其中所述第三eaef能够与所述第一eaef或第二eaef结合。在一些实施方案中，所述第三eaef与所述第一eaef相同。可替代地，所述第三eaef与所述第二eaef相同。在另一个实施方案中，所述第三eaef是所述第一eaef或第二eaef的结合配偶体(例如生物素)。
[0249]
组合物和试剂盒
[0250]
本文公开了包含本文公开的任何抗treml2抗体或其抗原结合片段的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒可以进一步包含一种或多种选自以下的组分：磁性试剂、一种或多种另外的抗体或抗体缀合物、聚集抑制剂和聚集因子。
[0251]
在一些实施方案中，所述试剂盒包含(a)抗treml2抗体或其抗原结合片段；和(b)磁性试剂。
[0252]
在一些实施方案中，所述试剂盒包含(a)抗treml2抗体或其抗原结合片段；和(b)胶体磁性颗粒。
[0253]
在一些实施方案中，所述试剂盒包含(a)抗treml2抗体或其抗原结合片段；和(b)一种或多种另外的抗体或其抗原结合片段。
[0254]
本文进一步公开了试剂盒，其包含(a)抗treml2抗体或其抗原结合片段；和(b)第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体与胎儿有核红细胞(fnrbc)表面上表达的蛋白质结合。
[0255]
本文进一步公开了试剂盒，其包含(a)抗treml2抗体或其抗原结合片段；和(b)第二抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗体与标记缀合。
[0256]
本文进一步公开了试剂盒，其包含(a)第一抗treml2抗体或其抗原结合片段，其中所述第一抗treml2抗体或其抗原结合片段与磁性颗粒缀合；和(b)第二抗treml2抗体或其抗原结合片段，其中所述第二抗treml2抗体与标记缀合。
[0257]
在一些实施方案中，所述组合物或试剂盒包含抗treml2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗treml2抗体或其抗原结合片段包含(a)包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的重链可变区(hcvr)：(i)包含seq id no:6的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的互补决定区(cdr)1；(ii)包含seq id no:7的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的cdr2；和(iii)包含seq id no:8的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的cdr3；以及(b)包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的轻链可变区(lcvr)：(i)包含seq id no:9的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的cdr1；(ii)包含seq id no:10的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的cdr2；和(iii)包含seq id no:11的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的cdr3。在一些实施方案中，seq id no:6-11中的任一个独立地包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。
[0258]
在一些实施方案中，所述试剂盒包含(a)抗treml2抗体或其抗原结合片段；和(b)包含聚集抑制剂的缓冲液。
[0259]
在一些实施方案中，所述试剂盒包含(a)抗treml2抗体或其抗原结合片段；和(b)外源性聚集增强因子。
[0260]
本文公开的任何组合物、试剂盒或方法可以包含一种或多种磁性试剂。所述磁性试剂可以包含一种或多种磁性颗粒。所述磁性试剂可以包含铁磁性颗粒、超顺磁性颗粒。所述磁性试剂可以包含铁磁流体试剂。
[0261]
如本文所用，术语“铁磁性颗粒”是指可永久磁化的颗粒。
[0262]
所述磁性试剂可以包含超顺磁性颗粒。如本文所用，术语“超顺磁性颗粒”可以指代作为磁性响应颗粒的颗粒。超顺磁性颗粒是仅当经受磁场时才表现出磁性行为的颗粒。在一些实施方案中，胶体磁性颗粒是超顺磁性颗粒。
[0263]
在一些实施方案中，所述磁性试剂包含磁性颗粒。在一些实施方案中，所述磁性颗粒的尺寸为约1.5至约50微米、0.7-1.5微米或小于200nm。在一些实施方案中，所述磁性颗粒的尺寸小于200nm。在一些实施方案中，所述磁性试剂包含与抗体缀合的磁性颗粒。在一些实施方案中，这种与磁性颗粒缀合的抗体是与选自上皮细胞粘附分子(epcam)和内皮联蛋白(cd105)的蛋白质结合的抗体。可替代地，这种与磁性颗粒缀合的抗体与cd147结合。在进一步的实施方案中，这种与磁性颗粒缀合的抗体与cd45结合。在另一个实施方案中，这种与磁性颗粒缀合的抗体与胎儿细胞表面上表达的蛋白质结合。
[0264]
在一些实施方案中，所述磁性试剂包含铁磁流体试剂。如本文所用，术语“铁磁流体试剂”是指包含磁性颗粒的液体悬浮液。在一些实施方案中，所述铁磁流体试剂包含含有与所述抗treml2抗体缀合的磁性颗粒的液体悬浮液。可替代地，所述铁磁流体试剂包含含有与本文公开的一种或多种抗体缀合的磁性颗粒的液体悬浮液。在一些实施方案中，所述铁磁流体试剂包含含有与抗epcam抗体缀合的磁性颗粒的液体悬浮液。在一些实施方案中，所述铁磁流体试剂包含含有与抗cd105抗体缀合的磁性颗粒的液体悬浮液。在一些实施方
案中，所述铁磁流体试剂包含含有与和胎儿细胞表面上表达的蛋白质结合的抗体缀合的磁性颗粒的液体悬浮液。在一些实施方案中，所述铁磁流体试剂包含含有与抗cd147抗体缀合的磁性颗粒的液体悬浮液。
[0265]
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种或多种染色试剂。在一些实施方案中，所述一种或多种染色试剂包含一种或多种抗体缀合物。在一些实施方案中，所述一种或多种抗体缀合物的抗体缀合物是与标记缀合的抗体。在一些实施方案中，所述抗体结合选自cd71、血型糖蛋白a(gpa)和cd45的蛋白质。
[0266]
在一些实施方案中，本文公开的任何抗体(例如，抗treml2抗体或者一种或多种另外的抗体)进一步包含标记。在一些实施方案中，所述标记与所述抗体缀合。在一些实施方案中，所述标记选自藻红蛋白(pe)、别藻蓝蛋白(apc)、辣根过氧化物酶(hrp)和生物素。
[0267]
本文公开的任何试剂盒可以包含一种或多种抗体或其片段。所述一种或多种抗体可以与胎儿细胞表面上表达的蛋白质结合。可替代地或另外地，所述一种或多种抗体可以与母体细胞表面上表达的蛋白质结合。所述一种或多种抗体可以与选自epcam、cd105、cd147、cd15、cd71、gpa和cd45的蛋白质结合。所述一种或多种抗体可以与选自cd15、cd71、gpa和cd45的蛋白质结合。
[0268]
本文公开的任何试剂盒可以包含一种或多种抗体或其片段，其中所述一种或多种抗体与胎儿有核红细胞(fnrbc)或滋养层细胞表面上表达的蛋白质结合。所述抗体可以与选自epcam、cd105、cd71和cd147的蛋白质结合。
[0269]
本文公开的任何试剂盒可以包含一种或多种聚集抑制剂。本文公开的试剂盒可以包含1、2、3、4或5种或更多种聚集抑制剂。所述聚集抑制剂可以抑制内源性铁磁流体聚集因子。在一些实施方案中，所述聚集抑制剂选自还原剂、免疫复合物、螯合剂和二氨基丁烷。所述还原剂可以是巯基乙磺酸。所述聚集抑制剂可以是牛血清白蛋白(bsa)。所述螯合剂可以是edta。
[0270]
所述聚集抑制剂可以包含抗体或其片段，其中所述抗体与所述抗treml2抗体是相同的同种型。所述抗体可以是非特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体是小鼠抗体。
[0271]
本文公开的任何试剂盒可以包含抗treml2抗体，其中所述抗treml2抗体可以与铁磁流体偶联。本文公开的任何试剂盒可以包含抗treml2抗体，其中所述抗treml2抗体与磁性颗粒缀合。所述磁性颗粒可以是胶体磁性颗粒。所述磁性颗粒可以是铁磁流体磁性颗粒。
[0272]
本文公开的任何试剂盒可以包含外源性聚集增强因子(eaef)。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒包含1、2、3、4或5种或更多种eaef。在一些实施方案中，本文公开的磁性颗粒与一种或多种eaef偶联。在一些实施方案中，所述eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素。
[0273]
在一些实施方案中，本文公开的试剂盒包含两种或多种eaef。在一些实施方案中，第一eaef包含选自以下的特异性结合对的一个成员：生物素-链霉亲和素、抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、蛋白a-抗体fc、和亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素以及亚氨基生物素-亲和素，并且第二eaef包含所述特异性结合对的另一成员。
[0274]
在一些实施方案中，本文公开的试剂盒进一步包含第三eaef。在一些实施方案中，所述第三eaef与所述第一eaef相同。可替代地，所述第三eaef与所述第二eaef相同。在另一个实施方案中，所述第三eaef能够与所述第一eaef相互作用。在另一个实施方案中，所述第三eaef能够与所述第二eaef相互作用。通过具有与所述第一或第二eaef相同或者能够与所述第一或第二eaef相互作用的第三eaef，添加所述第三eaef导致逆转所述磁性颗粒的聚集。
[0275]
在一些实施方案中，本文公开的试剂盒进一步包含一种或多种聚集抑制剂。在一些实施方案中，所述聚集抑制剂选自还原剂、免疫复合物、螯合剂和二氨基丁烷。在一些实施方案中，所述聚集抑制剂是螯合剂。在一些实施方案中，所述螯合剂是edta。所述还原剂可以是巯基乙磺酸。所述聚集抑制剂可以是牛血清白蛋白(bsa)。
[0276]
实施例
[0277]
实施例1：胎儿细胞的新型标记物的鉴定
[0278]
本实施例描述了胎儿细胞的新型标记物的鉴定。
[0279]
有核红细胞(nrbc)的制备
[0280]
通过超声引导程序从计划手术终止妊娠的孕妇(10
0 15
6
孕周)获得胎儿全血(n＝5)。
[0281]
分娩时(n＝2)或手术终止妊娠前(n＝1)从孕妇收集20ml外周血。
[0282]
在收集后，用等体积的磷酸盐缓冲盐水(pbs)稀释胎儿和母体血液，并且将其缓慢分层到percoll梯度上。将样品在室温下以1800rpm离心10分钟。收集含有胎儿或成人成红细胞的相间层，并且将其用pbs洗涤两次。
[0283]
对于母体血液，使用ld柱(miltenyi biotec)，通过用抗cd45和抗cd15微珠(miltenyi biotec)标记细胞来进行cd45/cd15阳性细胞的耗尽步骤。
[0284]
对于母体血液，还使用微流体装置来除去rbc污染细胞并富集成人成红细胞。
[0285]
通过流式细胞术进行的富集和细胞分选
[0286]
为了制备用于facs分选的样品，将来自胎儿和母体血液的富集细胞用抗cd71抗体(miltenyi biotec)、抗gpa抗体(bd bioscience)、抗cd45抗体(miltenyi biotec)、hoechst(细胞核染色)和sytox green染料(活/死细胞)在室温下染色30分钟。
[0287]
facs分选
[0288]
如图5a-图5e所示，门控和分选成红细胞。图5b：门控fsc-h/w并排除双联体细胞。图5c：门控sytox green阴性活细胞。图5d：门控dp gpa/hoechst。图5e：门控cd71阳性/cd45阴性细胞。
[0289]
对于胎儿血液样品，分选了少于200,000个靶成红细胞。
[0290]
对于母体血液样品，母体成红细胞数从未超过1,000。
[0291]
对分选群体进行rna提取
[0292]
将处理、分选的细胞用于总rna提取。
[0293]
使用picopure rna分离试剂盒(applied biosystems)从分选的细胞中提取总rna，并且通过quant-it ribogreen rna测定试剂盒(thermo fisher)对其定量，并且使用rna 6000pico试剂盒在agilent 2100生物分析仪上分析质量控制。
[0294]
rnaseq制备和文库制备
[0295]
根据illumina测序制备cdna文库(附录a；rna-seq方案)。在hiseq 2000上以2千万个读段/样品进行测序。
[0296]
测序
[0297]
首先使用fastqc方案采用标准程序检查由下一代(illumina)测序得到的读段的质量，然后将其映射到参考基因组，并且随后使用star软件版本2.5进行定量。将所产生的读段-计数矩阵(即，每个样品中所有检测到的特征(编码或非编码rna)的读段-计数表)的尺寸用数据简化步骤简化，在单个样品中仅保留具有至少单个计数的基因。
[0298]
采用生物信息学工具进行数据分析
[0299]
用deseq2 r/biocondutor软件包进一步处理所得的数据用于差异表达以发现在所比较的两种样品类型之间表达显著更高或更低的基因。
[0300]
进行由以下步骤组成的默认deseq2差异表达分析：对于每个样品，使用“中值比值法”(anders和huber,2010)估计尺寸因子，对于每个基因，采用优化负二项式分布数据的离散度的拟合程序找到离散度的估计值，最后使用所获得的尺寸因子和离散度估计值来测试拟合分布的系数的显著性。
[0301]
最后提取来自deseq2分析的结果表，获得具有非零总读段计数的20205个特征(基因)的样品间基础均值、log2倍数变化、标准误差、检验统计量、p值和调整p值。根据0.01的调整p值(benjamini-hockberg/fdr方法)截止值和2倍变化的表达截止值过滤差异表达的基因。利用这些参数，选择3233个差异表达的基因，它们中的大多数(2961个)在胎儿血液中上调(独立于倍数变化截止值)。
[0302]
用从ensembl数据库中提取的注释和功能描述修饰所得的基因表。根据基因本体论术语go:0005886与“质膜”注释相关的基因被标记并另外标记为“跨膜”，从uniprot数据库获得数据。其中，366个质膜基因差异表达，其中大多数(336个)在胎儿细胞中上调(独立于倍数变化截止值)。
[0303]
与差异表达分析平行，使用deseq2将读段计数标准化并转化，以便根据更严格的表达标准进行选择：根据以下标准，从仅在胎儿样品中表达的基因列表，即在所有三个母体样品中具有零个读段的那些(12187个基因，列表“all data”)开始进行第一次选择：1)选择在所有胎儿样品中均检测到(即表达)的基因；2)选择表达平均值/标准差比高于1的基因；3)选择既与质膜go标签相关又被uniprot数据库标记为“跨膜预测”的基因。参见以下选择方案。然后根据递减的胎儿平均表达对所得的77个基因进行排序(列表“ranked”)。考虑到已知的生物学功能、样品间表达水平的稳定性和绝对表达水平的粗略估计(读段与基因长度相比)、抗体可用性和其他生物学考虑，通过手动操作进行最终选择(16个基因，列表“selected”)。
[0304]
选择方案
[0305]
以下是用于鉴定胎儿细胞的潜在新型标记物的选择方案：
[0306]
1)在任何母体样品中均不表达的基因：12187
[0307]
2)仅在所有胎儿样品中表达的基因：2079
[0308]
2.1)注释为与go质膜术语相关的基因：213
[0309]
2.2)通过uniprot预测为跨膜的基因：305
[0310]
3)既与go质膜相关又被预测为跨膜的基因：89
[0311]
4)平均值/标准差比高于1的基因：77
[0312]
来自基因列表的差异表达的基因的排序
[0313]
考虑到转录物长度、读段数和其他生物学相关标准，进行进一步的最终的手动操作的选择和排序程序，并且所得的首选候选物如下：
[0314]
对所选靶分子具有特异性的抗体的鉴定
[0315]
通过facs分析测试成红细胞的ab候选物
[0316]
为了确定rna水平的差异表达是否反映在相应蛋白质的水平上，用市售抗体(n＝13)进行免疫染色用于流式细胞术和deparray分析。
[0317]
作为阴性对照，以相同的浓度使用与和市售抗体相同的荧光染料缀合的同种型匹配的ab。
[0318]
首先在冷冻的胎儿血液上测试表2所示的所有13种抗体。
[0319]
在冷冻的母体血液样品上测试仅在胎儿成红细胞上阳性表达的抗体。
[0320]
除了用于测试的特异性抗体或同种型对照，用于染色的抗体还包括cd71 ab(miltenyi biotec)、gpa ab(bd bioscience)、cd45 ab(miltenyi biotec)、hoechst，用于成红细胞鉴定。简而言之，将细胞(2.5-5x105)与ab在fcr封闭试剂(miltenyi biotec)的存在下在室温下一起孵育30分钟。在洗掉未结合的ab后，用含sytox green染料的automacs运行缓冲液(miltenyi)重悬细胞沉淀。
[0321]
表2：facs分析结果
[0322]
ab 1tlt2用于treml2(后者在本文中也称为tls-1)
[0323]
实施例2：用于细胞捕获和选择的铁磁流体技术
[0324]
在本实施例中，所选的仅由胎儿细胞表达的抗体用于铁磁流体缀合。treml2-ff(也称为tls1-ff)是指能够结合由tls1基因表达的蛋白质的与铁磁流体缀合的抗体。
[0325]
通过使用nanobrook zeta plus粒度分析仪检查ff-ab的尺寸，并且采用分光光度计检查浓度。
[0326]
受控的富集
[0327]
在将铁磁流体添加到血液中之前，将血液样品与含有一种或多种抑制内源性铁磁流体聚集因子的抑制剂的缓冲液一起预孵育(如ep1311820中所述，将其通过引用以其整体而并入)。其中一种抑制剂可以是还原剂，如100mm的巯基乙磺酸，其可以使igm诱导的聚集无效而不影响用于标记细胞的配体。还原剂可以作为单一试剂添加到血液中。第二抑制剂可以是牛血清白蛋白，其可以以10mg/ml包含在缓冲液中，并且将中和任何habaa。第三抑制剂可以是非特异性小鼠抗体，特别是与铁磁流体上的抗体匹配的适当同种型。这可以以0.5-5mg/ml的浓度包含在缓冲液中以中和甚至最严重的hama。如果需要，第四抑制剂可以是包含在缓冲液中的链霉亲和素，以中和血浆中存在的任何抗链霉亲和素抗体。可以用上述缓冲液和还原剂预处理血液15-30分钟以中和所有内源性聚集因子。在中和所有内源性聚集因子后，将外源性铁磁流体聚集因子添加到样品中，随后添加铁磁流体。铁磁流体与对靶标具有特异性的抗体以及对外源性聚集因子具有特异性的另一种配体偶联。在用铁磁流体对靶细胞进行最佳标记和用外源性聚集因子诱导铁磁流体聚集后，对样品进行磁分离以富集靶标。
[0328]
将样品置于磁力分离器(immunicon目录号qs-012)中10分钟。从磁体中取出样品，并且通过涡旋混合样品并放回磁力分离器中10分钟以收集磁性标记的细胞。吸出未收集的样品，并且将磁性收集的细胞重悬于0.75ml洗涤稀释缓冲液中并在磁力分离器中再分离10分钟。丢弃未收集的样品，并且在从磁力分离器中取出管后，将收集的细胞重悬。在除去所有非靶标后，将磁性标记的靶标和游离铁磁流体重悬于缓冲液中。在一些情况下，应当逆转外源介导的铁磁流体聚集。这可以通过将最终样品重悬于含有与外源性聚集因子结合的解聚因子的缓冲液中来实现。解聚因子解聚所有铁磁流体聚集体，使细胞易于进一步分析。
[0329]
实施例3：胎儿细胞的检测和分析
[0330]
本实施例描述了单个胎儿细胞的分离和分析。deparray可以如ep2152859中所述进行，将其通过引用以其整体而并入。
[0331]
孕妇和健康志愿者
[0332]
通过静脉穿刺从14名在12至17 2孕周内的孕妇抽取外周血样品到10ml cellsave防腐管(menarini silicon biosystems，美国宾夕法尼亚州亨廷顿谷)中。对于掺加实验，从健康供体抽取外周血。所有供体均提供了书面知情同意书，并且研究方案得到了蒙扎(意
大利)圣格拉多医院(san gerardo hospital)的医学伦理委员会的批准。1-4天后处理所有样品。
[0333]
使用与铁磁流体偶联的针对上皮细胞粘附抗原(epcam)、血管内皮标记物(cd105)和/或treml2的抗体来从污染细胞中富集胎儿滋养层细胞。用经藻红蛋白(pe)标记的抗treml2单克隆抗体(mab)标记富集的细胞。还用经别藻蓝蛋白(apc)标记的抗细胞角蛋白mab c11、经apc标记的抗hla-g mab和经异硫氰酸荧光素(fitc)标记的抗cd45 mab荧光标记富集的细胞以识别白细胞。
[0334]
靶细胞(例如，滋养层细胞)的这些富集程序是必要的，因为已知母体血液中所述细胞的频率极低，在1ml总血液(其含有超过十亿个细胞)中仅有1-10个细胞。
[0335]
用于掺加的cvs和脐带血。
[0336]
为来自健康志愿者的全血掺加源自绒毛膜绒毛取样(cvs)的胎儿滋养层细胞或源自脐带血的胎儿成红细胞。
[0337]
选择cvs培养物用于其cd105/epcam表达。使细胞在37℃和5％co2下在补充有10％胎牛血清(gibco)、1％青霉素-链霉素(gibco)和l-谷氨酰胺(gibco)的rpmi 1640(gibco)中生长。在掺加前，将细胞从烧瓶中分离，重悬于10ml pbs(gibco)中，并且置于cellsave防腐管中至少1天。
[0338]
将通过圣格拉多医院获得的脐带血样品收集到cellsave防腐管中。
[0339]
进行掺加实验以证明当使用铁磁流体缀合的抗体捕获胎儿细胞时选择程序的特异性。
[0340]
胎儿血液和骨髓样品
[0341]
通过超声引导程序从计划手术终止妊娠的孕妇(10
0 15
6
孕周)获得胎儿全血(n＝3)。
[0342]
所有供体均提供了书面知情同意书，并且研究方案得到了新加坡竹脚妇幼医院(kk women's and children's hospital)的医学伦理委员会的批准。
[0343]
在收集后，用等体积的pbs稀释胎儿血液，并且将其缓慢分层到percoll梯度上。将样品在室温下以1800rpm离心10min。收集含有胎儿成红细胞的相间层，并且将其用pbs洗涤两次。
[0344]
购买含有成人成红细胞的冷冻保存的骨髓单核细胞(lonza，目录号2m-125c)。按照制造商的说明书，将细胞解冻，并且用dna酶i处理并洗涤。然后将细胞在提供有10％fbs、青霉素/链霉素、l-谷氨酰胺的rpmi培养基中在37度下静置1小时，并且用作阴性对照(测试3个不同供体)。
[0345]
通过使用流式细胞术在样品中测试市售treml2抗体的四个克隆。
[0346]
以相同的浓度使用与和市售treml2 ab相同的荧光染料缀合的同种型匹配的ab。除了treml2 ab或同种型对照，用于染色的ab还包括cd71 ab(miltenyi biotec)、gpa ab(bd bioscience)、cd45 ab(miltenyi biotec)、hoechst。简而言之，将细胞(2.5-5x105)与ab在fcr封闭试剂(miltenyi biotec)的存在下在室温下一起孵育30min。在洗掉未结合的ab后，用含sytox green染料的运行缓冲液重悬细胞沉淀，以门控活细胞用于facs分析。
[0347]
用于受控的聚集的脱硫生物素铁磁流体抗体的制备
[0348]
在一些实施方案中，用于实施本发明的铁磁流体是表现为胶体的颗粒。此类颗粒
的特征在于它们的通常小于200纳米(nm)的亚微米粒度以及它们在长时间内对从溶液中重力分离的抗性。使用在90-150nm范围内并且具有在70％-90％之间的磁质量的颗粒。合适的磁性颗粒由被包衣分子包围的超顺磁性材料的结晶核构成，所述包衣分子结合(例如，物理吸附或共价连接)到磁核并且赋予稳定的胶体性质。包衣材料应当优选地以有效防止样品中发现的生物大分子与磁核之间的非特异性相互作用的量施加。此类生物大分子可以包括非靶细胞表面上的唾液酸残基、凝集素、糖蛋白和其他膜组分。此外，包衣材料应当含有尽可能高的磁质量/纳米颗粒比。构成核的磁性晶体的尺寸足够小，使得它们不含有完整的磁畴。纳米颗粒的尺寸使得它们的布朗能超过它们的磁矩。因此，即使在中等强度的磁场中，也不会发生这些胶体磁性颗粒的北极-南极排列和随后的相互吸引/排斥，这有助于它们的溶液稳定性。最后，磁性颗粒应当在高磁梯度外场分离器中可以是可分离的。该特征有利于样品处理，并且提供了优于装载有铁磁珠或钢丝绒的更复杂的内部梯度柱的经济优势。具有上述性质的磁性颗粒可以通过描述于ep0842042中的基础材料的改性来制备。在本发明的一个优选实施方案中，如us6365362b1中所述制备用抗cd105抗体包被的磁性颗粒，将其通过引用以其整体而并入。
[0349]
针对cd105抗原的重组人抗体获自杂交瘤编号166707(r&d systems)，并且通过标准偶联化学方法与基础材料偶联，如美国专利申请号09/248,388中所述。然后将cd105 ab铁磁流体重悬于20mm hepes(ph 7.5)中，以使用n-羟基琥珀酰亚胺-dl-脱硫生物素(nhs-脱硫生物素)(sigma，目录号h-2134)与脱硫生物素缀合。以1mg/ml在dmso中制备nhs脱硫生物素的原液。将nhs-脱硫生物素(5mg)添加到1mg cd105ab铁磁流体中，并且在室温下孵育2小时。通过使用高梯度磁体用含有1mg/ml bsa、0.05％proclin 300的20mm hepes(ph 7.5)洗涤三次来除去未反应的nhs-脱硫生物素。在最后一次洗涤后，将脱硫生物素/cd105 ab铁磁流体重悬于水/bsa/proclin 300中，并且通过0.2um注射器式过滤器过滤。使用分光光度测定法确定cd105 ab铁磁流体的铁浓度，并且将其调节至0.22mg/ml。通过使用粒度仪分析仪nanobrook 90plus(brookhaven instruments corporation)进行粒度确定。
[0350]
通过使用相同的方法将抗cd71、抗treml2和抗epcam抗体与铁磁流体缀合。
[0351]
处理血液
[0352]
用6.5ml稀释缓冲液(menarini silicon biosystems)稀释7.5ml血液的等分试样。
[0353]
在将铁磁流体添加到血液中之前，将血液样品(7.5ml的等分试样)与含有一种或多种抑制内源性铁磁流体聚集因子的抑制剂的6.5ml稀释缓冲液(menarini silicon biosystems)一起预孵育(如ep1311820中所述，将其通过引用以其整体而并入)。其中一种抑制剂可以是还原剂，如100mm的巯基乙磺酸，其可以使igm诱导的聚集无效而不影响用于标记细胞的配体。还原剂可以作为单一试剂添加到血液中。第二抑制剂可以是牛血清白蛋白，其可以以10mg/ml包含在缓冲液中，并且将中和任何habaa。第三抑制剂可以是非特异性小鼠抗体，特别是与铁磁流体上的抗体匹配的适当同种型。这可以以0.5-5mg/ml的浓度包含在缓冲液中以中和甚至最严重的hama。如果需要，第四抑制剂可以是包含在缓冲液中的链霉亲和素，以中和血浆中存在的任何抗链霉亲和素抗体。可以用上述缓冲液和还原剂预处理血液15-30分钟以中和所有内源性聚集因子。在此孵育时间期间，将稀释的血液在室温下在800g下在不制动下离心10min，以除去血浆。
[0354]
在中和所有内源性聚集因子后，将外源性铁磁流体聚集因子(链霉亲和素)添加到样品中，随后添加铁磁流体。铁磁流体与对靶标具有特异性的抗体以及对外源性聚集因子(例如像脱硫生物素(结合对脱硫生物素-链霉亲和素))具有特异性的另一种配体偶联。
[0355]
抗cd105铁磁流体、抗epcam铁磁流体和/或抗treml2铁磁流体用于胎儿滋养层细胞富集。抗cd71铁磁流体和/或抗treml2铁磁流体用于胎儿成红细胞富集。在用铁磁流体对靶细胞进行最佳标记和用外源性聚集因子诱导铁磁流体聚集后，对样品进行磁分离以富集靶标。
[0356]
将样品置于磁力分离器(immunicon目录号qs-012)中10分钟。从磁体中取出样品，并且通过涡旋混合样品并再放回磁力分离器中10分钟。将样品从磁体中取出，并且再次混合并再放回磁力分离器中20分钟以收集磁性标记的细胞。吸出未收集的样品，并且将磁性收集的细胞重悬于3ml洗涤稀释缓冲液中并在磁力分离器中再分离10分钟。丢弃未收集的样品，并且在从磁力分离器中取出管后，将收集的细胞重悬。在除去所有非靶标后，将磁性标记的靶标和游离铁磁流体重悬于缓冲液中。在一些情况下，逆转外源介导的铁磁流体聚集。可以通过将最终样品重悬于含有与外源性聚集因子结合的解聚因子的缓冲液中来实现聚集的逆转(在结合对脱硫生物素-链霉亲和素的情况下，逆转聚集的外源性试剂可以是生物素)。不希望受理论束缚，解聚因子解聚所有铁磁流体聚集体，留下细胞用于进一步分析。
[0357]
对于滋养层细胞，用经藻红蛋白(pe)标记的抗treml2单克隆抗体(mab)荧光标记富集的细胞。对于滋养层细胞，还用用于dna染色的核酸染料(hoechst 33342)、经别藻蓝蛋白(apc)标记的抗细胞角蛋白mab c11、经apc标记的抗hla-g mab和/或经异硫氰酸荧光素(fitc)标记的抗cd45 mab荧光标记富集的细胞以识别白细胞。
[0358]
对于成红细胞，用经藻红蛋白(pe)标记的抗treml2单克隆抗体(mab)荧光标记富集的细胞。对于成红细胞，还用用于dna染色的核酸染料(hoechst 33342)、经藻红蛋白(pe)标记的抗cd71单克隆抗体(mab)和/或经异硫氰酸荧光素(fitc)标记的抗cd45 mab荧光标记富集的细胞。
[0359]
将染色的细胞用2％多聚甲醛(pfa)在室温下固定20分钟，然后洗涤并重悬于适当的缓冲液和体积中用于deparray
tm nxt系统(menarini silicon biosystems)或facs分析。
[0360]
deparray分析
[0361]
deparray
tm nxt是一种用于精确分离纯的单个细胞的基于半导体的技术。它由deparray
tm
控制单元和一次性套筒构成，其结合了最先进的微流体和硅生物芯片技术，以温和地操纵富集样品中的每个单个靶细胞。
[0362]
允许在芯片内操纵细胞的现象被称为“介电电泳”，并且是基于通过电场作用使液体悬浮介质内的颗粒极化的能力。极化产生力场，其可以用于将每个单独的颗粒捕获在一排势阱中，从而允许控制颗粒的位置。可以通过修改芯片的编程来控制每个势阱，以便将一个或多个颗粒从它们的初始位置移动到它们的最终目的地以供回收。
[0363]
deparray
tm
允许以极高的分辨率(低至单个细胞)和极高的纯度选择和分离稀有细胞；通过对荧光信号和通过处理明场或荧光图像获得的形态特征进行多参数分析来选择细胞。
[0364]
此技术已经用于分离和选择肿瘤患者血液中的单个循环肿瘤细胞(如ep1311820中所述，将其通过引用以其整体而并入)。
[0365]
为来自健康志愿者的全血样品掺加含有具有21三体的胎儿滋养层细胞的绒毛膜绒毛培养物。如前所述富集并染色样品。
[0366]
在deparray
tm nxt系统上分析滋养层细胞。滋养层细胞显示treml2染色阳性。此外，将显示泛细胞角蛋白(ck)染色阳性和不可检测的cd45标记并且细胞核染色阳性的细胞分类为胎儿滋养层细胞，并且分离为单个细胞。
[0367]
为来自健康志愿者的全血样品掺加含有用draq5细胞核染料预标记的胎儿成红细胞的脐带血。将样品用cd71-ab铁磁流体和treml2-ab铁磁流体富集，并且如前所述染色。在deparray
tm nxt系统上分析富集成红细胞的细胞。将显示cd71染色阳性、不可检测的cd45标记并且hoechst/draq5细胞核染色阳性的细胞分类为胎儿成红细胞。
[0368]
通过短串联重复(str)分析证明胎儿细胞来源
[0369]
根据制造商的说明书，使用deparray
tm lyseprep试剂盒(msb，意大利)裂解分离的细胞。
[0370]
使用powerplex fusion 6c人dna扩增试剂盒(promega tmd045)pcr扩增来自单个细胞的dna，所述试剂盒由靶向人基因组中27个基因座的多重引物组组成。
[0371]
还使用qiagen dsp血液微型试剂盒(qiagen)从200μl母体全血中分离基因组dna作为对照。当可用时，还分析获自直接或培养的cvs组织或羊水的胎儿基因组dna。
[0372]
根据制造商的建议进行str，并且使用thermofisher scientific 3500遗传分析仪(pop-4和36cm毛细管阵列)进行片段分析；随后使用id-x v1.4进行软件分析。然后将分离的单个细胞的等位基因模式与胎儿和亲代基因组dna模式进行比较，以评估等位基因脱扣(allelic dropout)和预期的遗传模式。
[0373]
poc：20名妊娠早期孕妇的临床研究
[0374]
通过静脉穿刺从14名在12至17 2孕周内的孕妇抽取20ml外周血样品到10ml cellsave防腐管(menarini silicon biosystems，美国宾夕法尼亚州亨廷顿谷)中。1-4天后处理所有样品。从14名孕妇中成功分离出胎儿滋养层细胞(表x)。从14名阳性孕妇中分离出平均1.4个胎儿滋养层细胞。
[0375]
拷贝数变异分析(cnv)
[0376]
为来自健康志愿者的全血样品掺加含有胎儿滋养层细胞的绒毛膜绒毛培养物。如前所述富集并染色样品。
[0377]
对从deparray
tm nxt回收的单个胎儿滋养层细胞进行全基因组扩增(ampli1wga，menarini silicon biosystems)。
[0378]
根据制造商的说明书，用1.8x spriselect珠(beckman coulter)纯化5μlampli1
tm wga产物，并且使用ampl1
tm
低通试剂盒(menarini silicon biosystems)在12.5μl te缓冲液中洗脱用于文库制备。
[0379]
使用bwa在hg19参考基因组上比对来自13个ampli1
tm
低通文库的fastq文件。使用control-freec(无对照样品和进行gc标准化)计算拷贝数分布。使用定制python脚本获得拷贝数图。
[0380]
结果
[0381]
图8显示了胎儿细胞富集的工作流程示意图。如图8所示，工作流程由3个单独的步骤组成：1.收集样品和使用特异性选择靶细胞的铁磁流体缀合抗体捕获靶细胞。2.将靶细
胞用所选抗体标记，并且加载到deparray套筒中用于筛选和选择。然后使用deparray仪器分选所选的单个细胞。3.通过str(短串联重复)技术分析分选的单个细胞以证明它们的胎儿细胞来源。
[0382]
在本实施例中，从孕妇的全血中富集并染色胎儿细胞。通过使用deparray
tm
分离纯的单个细胞，用于全基因组扩增和基因组分析。
[0383]
图9-图10证明了新型treml2抗体的特异性，如通过流式细胞术分析分离自胎儿血液(fb)(图9)和骨髓样品(bm)(图10)的成红细胞上的treml2(即，tls)表达所证明的。如图9-图10所示，通过以下方式门控分离自胎儿血液或骨髓样品的成红细胞：(1)fsc-a/ssc-a门控主要细胞群，(2)门控sytox green阴性活细胞，(3)fsc-h/w排除双联体细胞，(4)门控双阳性gpa/hoechst，(5)门控cd71阳性/cd45阴性，以及(6)门控tls并与同种型对照叠加以确定treml2阳性细胞的％。
[0384]
图11a-图11j显示了分离自来自各种克隆的各种胎儿血液(fb)样品的成红细胞上的tls表达。图12a-图12l显示了分离自来自各种克隆的各种骨髓(bm)样品的成红细胞上的tls表达。如图11a-图11j所示，来自胎儿血液的胎儿成红细胞显示treml2抗体染色阳性，而分离自骨髓的成人成红细胞检测不到表达(图12a-图12l)。
[0385]
表3.尺寸测量ab铁磁流体。cd105-ff的平均直径(nm)为128.70nm。ff的平均直径(nm)为128.70nm。ff的平均直径(nm)为128.70nm。
[0386]
表4：尺寸测量ab铁磁流体。treml-2-ff的平均直径(nm)为189.57。两种尺寸均在胶体颗粒的范围内。
[0387]
使用源自cvs培养物的滋养层细胞来证明cd105-ff和epcam-ff捕获和富集的特异性。
[0388]
图13显示了在掺加cd105-ff和epcam-ff并用其富集后通过deparray
tm
鉴定的treml-2阳性滋养层细胞的散点图分析。图14显示了图像库：滋养层细胞显示treml-2-pe抗体染色、ck-apc和细胞核染色阳性。
[0389]
使用源自脐带血的成红细胞来证明cd71或treml-2捕获和富集的特异性。
[0390]
图15a显示了掺入健康供体血液并用cd71-ff富集的draq5/hoechst阳性成红细胞的散点图分析。图15b显示了图像库：成红细胞显示cd71-pe抗体染色、draq5和hoechst细胞核染色阳性，并且cd45-fitc抗体染色阴性。
[0391]
图16a显示了掺入健康供体血液并用treml-2-ff富集的draq5/hoechst阳性成红细胞的散点图分析。图16b显示了图像库：成红细胞显示cd71-pe抗体染色、draq5和hoechst细胞核染色阳性，并且cd45-fitc抗体染色阴性。
[0392]
通过str(短串联重复)技术分析分选的单个细胞以证明它们的胎儿细胞来源(与母体dna以及源自羊膜穿刺术程序的胎儿dna分析进行比较)。检测到相同的基因座分布。图17显示了来自单个胎儿细胞的str分析。
[0393]
在初步临床研究中，招募了14名处于不同孕周的孕妇，并且如通过str分析所显示的，获自来自孕妇的血液样品的胎儿细胞检测呈阳性。
[0394]
表5.显示了str分析总结
[0395]
为了证明从来自绒毛膜绒毛取样的胎儿细胞的单细胞回收中我们可以检测chr21三体取样(vk)，我们进行了拷贝数变异(cnv)分析。
[0396]
图18显示了胎儿细胞的cnv分析结果。如图18所示，来自deparray的单细胞回收(例如，来自回收1(r1)、回收3(r3)和回收6(r6))证实了来自绒毛膜绒毛取样(vk)的文库上存在chr21三体。
[0397]
图19显示了健康供体的cnv分析结果。如图19所示，健康供体(hd)显示出平坦的拷贝数分布，类似于通过分离自deparray的pbmc单细胞获得的那些。
[0398]
实施例4：从母体血液中选择nrbc的工作流程程序
[0399]
本实施例描述了一种用于从怀孕受试者的血液样品中选择有核红细胞(nrbc)的方法。如图6所示，从怀孕受试者收集血液样品(601)。将血液样品收集在cellsave管中(601)。可以通过磁分离富集nrbc(602，例如铁磁流体富集)。可替代地或另外地，可以使用系统处理样品(603)。可以使用基于控制单元图像的deparray
tm nxt技术来可视化并分离单个细胞(604)。一旦分离出细胞，便从分离的细胞中纯化核酸(605)。进行基因组和/或遗传分析(606)。例如，对核酸分子测序以检测染色体异常。
[0400]
实施例5：rna测序方案
[0401]
可以从稀有细胞(例如，胎儿细胞)中分离核酸分子(如rna)。本实施例提供了用于对来自胎儿细胞的rna测序的示例性方法。
[0402]
smart-seq v2
[0403]
对于rt-pcr，对smartseq版本2进行了一些修改。
[0404]
对于胎儿成红细胞(eb)，2ng总rna输入用于逆转录反应。对于母体eb，由于可以分选的母体eb数量有限，因此浓缩所有rna并用于逆转录反应。
[0405]
(1)逆转录
[0406]
在样品管中添加1ul oligo dt 30vn引物(10um)和1ul dntp混合物(各10mm)。
[0407]
将样品在72℃下孵育3min，并且立即置于冰上。
[0408]
如下在冰上制备逆转录混合物，并且向每个样品中添加5.7ul。个样品中添加5.7ul。
[0409]
如下在热循环仪中孵育反应：
[0410]
(2)pcr预扩增
[0411]
如下在冰上制备pcr混合物，并且向每个样品中添加15ul。组分体积(ul)无核酸酶水2.25kapa hifi hotstart readymix(2x)12.5is pcr引物(10um)0.25样品10
[0412]
将样品放入热循环仪中并运行以下程序。
[0413]
pcr循环数取决于细胞类型，并且可以增加(对于具有低rna含量的细胞)或减少(对于具有更多rna的细胞)。
[0414]
(3)pcr纯化
[0415]
使用0.5x反应体积的ampure xp珠(beckman coulter)将扩增的cdna产物纯化两次。使用高灵敏度dna试剂盒在agilent 2100生物分析仪上定量纯化的cdna。
[0416]
(4)illumina nextera xt dna样品制备
[0417]
使用illumina nextera xt dna试剂盒制备文库，其中有修改(cdna样品体积、试剂和反应体积优化为制造商说明书体积的1/4)
[0418]
相应地稀释cdna，得到300pg。
[0419]
将1.25ul cdna(300pg)等分到0.2pcr管中。
[0420]
添加2.5ul tagment dna缓冲液和1.25ul amplicon tagment miz。
[0421]
将标记反应在热循环仪上在55度下孵育5min。
[0422]
立即添加1.25ul nt并在室温下孵育5min。
[0423]
将1.25ul index1、1.25ul index2和3.75ul nextera pcr主混合物(npm)添加到标记的dna中。
[0424]
使用以下程序进行扩增：
[0425]
(5)文库dna清理(纯化)：
[0426]
向文库dna中添加ampure xp珠(0.6x反应体积)。
[0427]
丢弃珠并保留上清液用于第一次清理。
[0428]
在第二次清理中，添加ampure xp珠(0.7x反应体积)。
[0429]
保留珠并洗脱dna片段。
[0430]
使用高灵敏度dna试剂盒在agilent 2100生物分析仪上定量成功的文库(平均400bp)。
[0431]
为了合并文库，将每个文库样品调节至10nm，并且按体积合并。
[0432]
(6)文库dna测序：
[0433]
将文库送至测序设备并用illumina hiseq
tm
高输出v3系统进行配对末端测序(2x101 bp)。
[0434]
实施例6：滋养层细胞检测
[0435]
本实施例描述了用于检测滋养层细胞的方法。在本实施例中，铁磁流体技术用于细胞捕获和选择，并且deparray技术用于细胞分选。
[0436]
将滋养层细胞通过铁磁流体技术和受控的聚集捕获。使来自怀孕受试者的血液样品与包含与抗epcam抗体缀合的胶体磁性颗粒(epcam-ff)或与抗cd105抗体缀合的胶体磁性颗粒(cd105-ff)的铁磁流体接触。血液样品含有多个细胞(胎儿细胞和母体细胞)。第一外源性聚集增强因子(如脱硫生物素)与胶体磁性颗粒缀合。向样品中添加第二外源性聚集增强因子(如链霉亲和素)。不希望受理论束缚，添加第二外源性聚集增强因子诱导胶体磁性颗粒的聚集，从而更容易分离胎儿细胞和减少非胎儿细胞的污染。将样品施加到磁力分离器上，并且分离结合epcam-ff或cd105-ff的细胞。
[0437]
为了有助于促进进一步分析结合epcam-ff或cd105-ff的细胞，向分离的细胞中添加第三外源性聚集增强因子(如生物素)。不希望受理论束缚，添加第三外源性聚集增强因子逆转胶体磁性颗粒的聚集，这使得更容易分析单个细胞。
[0438]
用于细胞分选的deparray技术：tls1(即，treml2)用作滋养层细胞染色的候选物。将分离的细胞用荧光标记的抗tls抗体(即，抗treml2抗体)、抗hla-g抗体和细胞角蛋白染色。将分离并染色的细胞样品施加到deparray套筒上并使用deparray仪器分析。如果细胞对tls、hla-g和细胞角蛋白染色呈染色阳性，则将它们鉴定为具有滋养层细胞。
[0439]
实施例7：诊断胎儿异常
[0440]
进一步分析通过本文公开的任何方法分离或鉴定的胎儿细胞以诊断胎儿异常。对胎儿细胞进行核型测试以检测染色体异常。如果检测到染色体异常，则胎儿被诊断患有相应的障碍。例如，如果检测到21号染色体的三个拷贝，则胎儿被诊断为患有唐氏综合征。在另一个例子中，如果检测到18号染色体的三个拷贝，则胎儿被诊断为患有爱德华兹综合征(edwards syndrome)。