高亚碲酸盐耐受菌介导合成生物碲纳米颗粒及其抗菌应用

1.本发明涉及生物纳米材料技术领域，更具体地涉及一种高亚碲酸盐耐受菌介 导合成生物碲纳米颗粒及其抗菌应用。


背景技术：

2.在过去的研究中，碲及其化合物在冶金、电子和应用化工等各个行业得到了 广泛的应用，环境中碲氧化物的存在引起了人们对水体和土壤污染的关注。研究 表明，即使在低浓度下，碲氧化物对大多数微生物都有毒性，单质碲相比碲氧化 物的毒性更低、溶解度小、应用更加广泛。利用微生物解毒机制，将高毒性的 te(iv)还原为毒性较低的单质碲，是一种有利于te(iv)污染的生物修复和 碲资源合理利用的重要方式。细菌感染是全球最重要的死亡原因之一，过度使用 的抗生素导致细菌对抗生素抗性不断增加，对人类健康构成严重的威胁。纳米技 术的最新进展为“代替”抗生素杀死细菌，解决细菌感染的挑战提供了新的机会， 在开展新型功能性有机纳米抗菌材料的研究中，利用生物学方法合成所需的有机 纳米抗菌材料，对缓解环境中的细菌感染的有着重要意义。
3.有文献报道，许多微生物通过酶或非酶反应，可以在胞外或胞内将te(iv) 还原为碲纳米结构，但是，利用真菌合成碲纳米的研究较少，另外，此项研究还 利用生物合成的碲纳米材料作为抗菌材料，一方面，以缓解te(iv)在环境中 的高毒性，另一方面，生产的生物碲纳米颗粒具有独特的抗菌功能，对缓解环境 问题有着双重意义，此发明填补了的该方向的技术空白。
4.本发明，筛选了一株亚碲酸盐高耐受性菌株，检测了其对亚碲酸盐的还原性 能力，通过描电镜、透射电镜、元素mapping、红外光谱等方法对亚碲酸盐还原 产生的生物碲纳米颗粒进行了表征分析，并通过抑菌圈实验和稀释涂布平板法分 别对其抗菌活性和物表杀菌效果进行了评价；另外，本发明利用所述菌株可在对 高毒性的te(iv)还原为毒性较低的单质碲的同时，合成了具有抗菌作用的生 物碲纳米颗粒。


技术实现要素：

5.本发明的目的是解决现有技术中尚未出现在合成具有独特的抗病原菌功能 的生物碲纳米颗粒的同时，又能缓解te(iv)在环境中的高毒性的的技术缺陷， 提供一种原料价格低廉，生产成本低，合成工艺简单，抗菌效果显著，实用性强， 生物功能丰富，绿色环保，可为环保产业提供经济、高效的的高亚碲酸盐耐受菌 介导合成生物碲纳米颗粒。
6.为实现上述技术目的，本发明提供了一种高亚碲酸盐耐受菌介导合成生物碲 纳米颗粒，其特征在于是通过包含如下方法的步骤制备：
7.1)菌株被孢霉ab1(mortierella sp.ab1，保藏于中国典型培养物保藏中 心，湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期2021年9月15日， 保藏编号为cctcc m 20211177)的获得；
8.2)将步骤1)获得的被孢霉ab1接种到玉米粉培养基中，在26～28℃， 180～200r/
min的摇床中生长2～3天，得到发酵液；
9.3)取步骤2)得到的发酵液接种于改良pda中，同时加入亚碲酸盐溶液， 使得亚碲酸根离子在培养基中的终浓度为0.3～0.5mm，在26～28℃，180～200 r/min的摇床中继续生长6～7天；
10.4)收集经步骤3)生长后的菌体，将所述菌体进行抽滤、洗涤、再次抽滤， 后将菌体置于-78℃～-80℃下冷冻5～6小时，加入液氮研磨成粉状，加入去离子 水重悬，得到重悬液；
11.5)将步骤4)得到的重悬液在10000～12000rpm、5～10min的条件下，用 tris-hcl洗涤2～3次，正辛醇洗涤2～3次，去离子水洗涤2～3次，最后将收集的 沉淀重悬在去离子水中，得到所述高亚碲酸盐耐受菌介导合成生物碲纳米颗粒。
12.优选地，所述生物碲纳米颗粒，其特征在于是通过包含如下方法的步骤制备：
13.1)菌株被孢霉ab1的获得，所述获得过程为：
14.a选取废弃土，加入生理盐水，混匀，得土样；
15.b加热溶解固体lb培养基，加入k2teo3，倒平板，取步骤a获得的土样， 均匀涂布在平板表面，培养，出现黑色菌丝；
16.c挑选步骤b得到的黑色菌丝，接种到固体pda平板培养；
17.d切取经步骤c培养后含菌丝的小块固体pda，加入到pda中培养获得所 述菌株被孢霉ab1；
18.2)将步骤1)获得的被孢霉ab1接种到玉米粉培养基中，在28℃，200r/min 的摇床中生长3天，得到发酵液；
19.3)取步骤2)得到的发酵液接种于改良pda中，同时加入亚碲酸钾溶液， 使得亚碲酸钾在培养基中的终浓度为0.5mm，在28℃，200r/min的摇床中继续 生长7天；
20.4)收集经步骤3)生长后的菌体，将所述菌体进行抽滤、洗涤、再次抽滤， 后将菌体置于-78℃下冷冻5小时，加入液氮研磨成粉状，加入去离子水重悬， 得到重悬液；
21.5)将步骤4)得到的重悬液在12000rpm、5min的条件下，用tris-hcl 洗涤2次，正辛醇洗涤2次，去离子水洗涤2次，最后将收集的沉淀重悬在去离 子水中，得到所述高亚碲酸盐耐受菌介导合成生物碲纳米颗粒。
22.本发明还提供了所述的生物碲纳米颗粒的抗菌应用。
23.优选地，所述菌为痢疾志贺氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌 中的一种或几种。
24.进一步优选地，所述菌为大肠杆菌。
25.本发明的有益效果是：菌种生物功能稳定，有较强的亚碲酸盐还原能力和生 物碲纳米颗粒合成能力，生产原料来源低廉，合成工艺条件简单，由所述微生物 独特的生物功能，合成抗菌能力强大的代谢产物，获取方式安全可控，反应条件 温和，保存方式简单，稳定性较高，抗菌活性较高。
【附图说明】
26.图1为mortierella sp.ab1形态学观察图；
27.图2为mortierella sp.ab1进化树分析图；
28.图3为mortierella sp.ab1亚碲酸盐耐受性测试结果图；
29.图4为mortierella sp.ab1亚碲酸盐还原性测试结果图；
30.图5为生物碲纳米颗粒透射电镜、元素mapping检测图；
31.图6a为生物碲纳米颗粒傅立叶红外光谱图；
32.图6b为生物碲纳米颗粒x射线光电子te(0)元素谱图；
33.图7为生物碲纳米颗粒抗菌效果检测图；
34.图8为实施例9结果图。
【具体实施方式】
35.为了更好地理解本发明，下面结合附图，详细描述实施例。应理解，本实施 例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的范围。
36.除特别说明外，本实施例所采用的技术手段为本领域的常规技术手段。
37.实施例1亚碲酸盐耐受性菌株的分离、筛选与鉴定
38.(1)选取废弃垃圾堆土样1g，加入10ml已灭菌的质量体积比为0.85％ 的生理盐水，在37℃，200rpm的摇床中混匀30min；
39.(2)加热溶解100ml固体lb培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g， 氯化钠10g，琼脂20g，加入dd h2o定容至1000ml，121℃，20min灭菌后 使用)，加入终浓度为0.1mmol/l的亚碲酸钾(k2teo3)，倒平板，取200μl上 述溶解后的土样，均匀涂布在平板表面，在37℃条件下，培养16h；
40.(3)挑选黑色菌丝，接种到固体pda平板(土豆200g，葡萄糖20g，琼 脂20g，加入ddh2o定容至1000ml，121℃，20min灭菌后使用)，在28℃条 件下，培养6～7天；
41.(4)切取小块固体pda(含菌丝)，加入到100ml液体pda中，在28℃， 200r/min的条件下，培养3～5天，获得液体菌种；
42.(5)切取小块固体pda(含菌丝)，加入到10ml试管斜面pda中，在 28℃的条件下，培养3～5天，获得斜面菌种；
43.(6)形态观察：将原试管斜面pda接种于平板，观察平板中的菌株形态， 并在平板上挑取菌丝在光镜下观察与检测；
44.(7)分子生物学鉴定：以被孢霉ab1菌株基因组dna为模板，选择its rrna的区域扩增特异片段(seq id no.1)，选择通用引物its1(seq id no.2： 5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3')和its4(seq id no.3： 5'-tcctccgcttattgatatgc-3')，pcr反应体系如下：98℃2min，98℃10 s，58℃10s，72℃10s，35个循环，72℃5min，使用tsingke dna凝胶回 收试剂盒(code no.ge0101)切胶回收目的片段以相应引物测序，在ncbi官网， 选择代表性菌株序列作进一步的分析，采用mega 11软件进行系统发育分析， 选择neighbor-joining法构建邻接树，共循环1000次，根据系统发育树中组群关 系对菌株进行分类，鉴定菌株种属；
45.(8)菌株保藏：选取生长3～5天的试管斜面pda(含菌丝)，保藏于武汉 大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20211177，保藏证书见附 录1。
46.结果说明：
47.如图1、图2，通过含有亚碲酸盐的培养基筛选亚碲酸盐耐受性菌株，根据 在40倍光学显微镜观察(图1a)、扫描电镜观察(图1b)、平板菌丝(图1c)、 液体培养基菌丝体(图
1d)等菌株形态学观察，表明其为霉菌菌株，分子生物 学比对序列，测得该菌株its序列长度610bp(登录号：ol 825013.1)，具体序 列见seq id no.1；通过blast比对、构建进化树(图2)确定其属于被孢霉属， 结合形态学特征，将该菌株命名为被孢霉ab1(mortierella sp.ab1)。
48.实施例2亚碲酸盐耐受性测试
49.(1)优化培养基：一级摇瓶使用玉米粉培养基(玉米粉40g/l，kno32 g/l， nahpo41 g/l，mgso4·
7h2o 0.3g/l)，培养基配制后封口，在121℃，20min 条件下灭菌。二级摇瓶使用改良pda培养基(土豆200g/l，kno32g/l，nahpo
4 1g/l，mgso4·
7h2o 0.3g/l)，培养基配制后封口，在121℃，20min条件下灭 菌；
50.(2)使用实施例1中的斜面菌种，切取小块固体pda(含菌丝)，加入到 100ml的一级摇瓶中，在28℃，200r/min的条件下，培养3～5天，获得适量液 体菌种；
51.(3)取5ml一级摇瓶中的液体菌种，加入到100ml二级摇瓶中，在28℃， 200r/min的条件下，培养3～5天，获得大量液体菌种；
52.(4)使用二级摇瓶的培养基配方，加入2％的琼脂，制备成改良pda固体 培养基，分装于锥形瓶后，在121℃，20min条件下灭菌；
53.(5)加热溶解20ml改良pda固体培养基，加入终浓度为0～28mm的亚 碲酸钾(k2teo3)，倒平板；
54.(6)使用实施例1中的斜面菌种，切取小块固体pda(含菌丝)，放置于 改良pda固体培养基中，在28℃条件下，生长6～7天，观察菌株的生长情况。
55.结果说明：
56.结果如图3，使用实施例2中斜面pda中的菌株，接种到含有不同浓度梯 度亚碲酸盐的平板培养基中，测定菌株对亚碲酸盐的最大耐受性，结果显示，在 菌株生长6天后，0mm(图3a)、5mm(图3b)、15mm(图3c)、25mm(图 3d)，随着亚碲酸钾浓度的提高，显示出菌株生长活性的减弱，在亚碲酸钾终浓 度超过25mm时，菌株无明显生长迹象，表明该菌株对亚碲酸钾的最大耐受性 约为25mm。
57.实施例3亚碲酸盐还原性测试
58.(1)制作标准曲线：a.配制5mg/ml硼氢化钠。b.配制10mm的k2teo3， 并且进行8次倍比稀释，留0值。c.配制300mm的pbs(ph 7)。d.在500μl 的离心管中加入50μl硼氢化钠、50μl亚碲酸钾和200μl pbs，混合均匀，在 60℃条件下，反应10min。e.取反应溶液200μl到96孔板中，在od
500
下测定 吸光度，制作标准曲线；
59.(2)使用实施例2中的二级摇瓶液体菌种，取菌液5ml加入到100ml 改良的pda液体培养基中(含终浓度为0.5mm的亚碲酸钾)；
60.(3)每隔24h取培养基液体500μl，在12000rpm条件下，离心10min， 取50μl样本与50μl硼氢化钠和200μl pbs均匀混合，在60℃条件下，反应 10min，取反应溶液200μl到96孔板中，在od
500
下测定吸光度；
61.(4)条件不变，连续取样，在od
500
下测定吸光度，检测剩余te(ⅳ) 的含量。
62.结果说明：
63.如图4，以实施例2中的二级摇瓶为菌株培养基，测定该菌株对亚碲酸盐的 还原能力，以硼氢化钠为强还原剂制作标准曲线，通过测定od
500
处的吸光度， 监测菌株对亚碲酸
盐的还原过程，结果显示，以二级摇瓶为培养基，菌株接种量 为5％，在该条件下，菌株可在6天内将终浓度0.5mm的亚碲酸盐完全还原。
64.实施例4生物碲纳米颗粒的合成与提取
65.(1)将实施例1中的斜面菌种接种到玉米粉培养基中，在26℃，180r/min 的摇床中生长3天；
66.(2)取5ml发酵液接种于100ml的改良pda中，同时加入300μl的 亚碲酸钾溶液(100mm)，在26℃，180r/min的摇床中继续生长7天；
67.(3)收集菌体，将含有生物碲纳米颗粒的菌体进行抽滤，并用去离子水洗 涤菌体，再次抽滤，并将菌体置于-78℃下冷冻6小时，加入液氮研磨成粉状， 加入去离子水重悬；
68.(4)在10000rpm、10min的条件下，分别用tris-hcl、正辛醇、去离子 水洗涤3次，最后将收集的沉淀重悬在去离子水中，得到生物碲纳米颗粒 (biological telluriumnanoparticles，bio-tenps)。
69.实施例5生物碲纳米颗粒的合成与提取
70.(1)将实施例1中的斜面菌种接种到玉米粉培养基中，在27℃，190r/min 的摇床中生长2天；
71.(2)取5ml发酵液接种于100ml的改良pda中，同时加入400μl的 亚碲酸钾溶液(100mm)，在27℃，190r/min的摇床中继续生长6天；
72.(3)收集菌体，将含有生物碲纳米颗粒的菌体进行抽滤，并用去离子水洗 涤菌体，再次抽滤，并将菌体置于-80℃下冷冻5小时，加入液氮研磨成粉状， 加入去离子水重悬；
73.(4)在12000rpm、8min的条件下，分别用tris-hcl、正辛醇、去离子水 洗涤2次，最后将收集的沉淀重悬在去离子水中，得到生物碲纳米颗粒(biologicaltellurium nanoparticles，bio-tenps)。
74.实施例6生物碲纳米颗粒的合成与提取
75.(1)将实施例1中的斜面菌种接种到玉米粉培养基中，在28℃，200r/min 的摇床中生长3天；
76.(2)取5ml发酵液接种于100ml的改良pda中，同时加入500μl的 亚碲酸钾溶液(100mm)，在28℃，200r/min的摇床中继续生长7天；
77.(3)收集菌体，将含有生物碲纳米颗粒的菌体进行抽滤，并用去离子水洗 涤菌体，再次抽滤，并将菌体置于-78℃下冷冻5小时，加入液氮研磨成粉状， 加入去离子水重悬；
78.(4)在12000rpm、5min的条件下，分别用tris-hcl、正辛醇、去离子水 洗涤2次，最后将收集的沉淀重悬在去离子水中，得到生物碲纳米颗粒(biological tellurium nanoparticles，bio-tenps)；
79.(5)取1ml生物碲纳米颗粒提取液于60℃烘箱烘干3天，测定干重。
80.结果说明：
81.将菌株接种于二级摇瓶中，同时，在其生长过程中加入亚碲酸钾溶液，菌株 在生长过程中会将te(ⅳ)转移到胞内，并将其还原为生物碲纳米颗粒，同时 可以明显观察到菌株有白色变为黑色，通过液氮碾磨破开细胞，释放胞内的生物 碲纳米颗粒，再通过一系列洗涤与纯化过程，最终得到生物碲纳米颗粒。
82.实施例7生物碲纳米颗粒的表征分析
83.(1)使用实施例6中提取的生物碲纳米颗粒，放置-80℃超低温冰箱1～2h， 使用真空冷冻干燥机，连续冻干16～24h后收集；
84.(2)使用粉末状样品，进行红外光谱、x射线光电子能谱扫描，使用液体 样品，进行透射电镜、元素mapping分析；
85.结果说明：
86.如图5、图6a、图6b，通过透射电镜观察不同视野中的生物碲纳米颗粒， 确定其形状为棒状、大小约为100nm～500nm(图5abc)；通过元素mapping 分析，确定了其表面均匀分布碲(图5d)、碳(图5e)、氮(图5f)、氧(图5g)、 磷(图5h)和硫(图5i)元素，确定其表面均匀分布碲元素以及多种有机物； 通过红外光谱扫描分析生物碲纳米颗粒(图6a)，发现其在3415.74(羟基)、 3012.09(烯基)、2925.54(亚甲基)、2855.58(亚甲基)、1744.93(酯)、1628.41 (烯基)、1459.01(芳环基)、1240.62(芳香磷酸盐)、1152.55(叔胺，cn振动)、 1080.53(硫酸盐离子)、707.35(芳基硫醚)、576.19(二硫化物)及432.19(芳 基二硫化物)cm-1
处有振动，表明生物碲纳米颗粒含有蛋白质、脂类等有机物以 及无机盐离子等物质；通过x射线衍射技术分析生物碲纳米颗粒元素价态，确 定其在573.29和584.0处有最高峰(如图6b)，标志碲元素的价态为0；综合可 得，生物碲纳米颗粒的形状为不规则的棒状结构，大小在100～500nm，碲元素 的价态为0价，在其表面均匀分布着碲元素和蛋白质、脂类等有机物以及无机盐 离子。
87.实施例8生物碲纳米颗粒的抗菌应用
88.(1)使用实施例6中提取的生物碲纳米颗粒，将其浓度配制为10mg/ml、 1mg/ml、0.1mg/ml；
89.(2)选取100μl痢疾志贺氏菌(shigella dysenteriae cmcc 51252)、阪崎 肠杆菌(enterobacter sakazakii atcc 51329)、大肠杆菌(escherichia coli atcc 25922)和鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium atcc 14028)母种，分别接 种到mha培养基(mueller hinton agar)(配方：牛肉粉：6.0g/l，可溶性淀粉： 1.5g/l，酸水解酪蛋白：17.5g/l，琼脂：17.0g/l)中，25℃过夜培养；
90.(3)使用质量百分比为0.85％的生理盐水清洗、重悬、收集mha培养皿 中的细菌，并使用比浊仪将其浊度调整为0.5m；
91.(4)取50μl菌悬液，分别将痢疾志贺氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌和鼠 伤寒沙门氏菌涂于mha培养皿中；
92.(5)在每个培养皿中央放置一个灭菌的内部直径为6mm(外部直径为8 mm)的牛津杯；
93.(6)分别取10mg/ml、1mg/ml、0.1mg/ml的生物碲纳米颗粒(100μl) 加入到灭菌牛津杯中；
94.(7)在25℃的条件下，培养15h，记录培养皿中抑菌圈的直径。
95.结果说明：
96.如图7，使用琼脂糖凝胶扩散法测定生物碲纳米颗粒的抗菌效果，根据抑菌 圈大小判定其抑菌效价，结果显示生物碲纳米颗粒可以很好地抑制0.5m的痢疾 志贺氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌以及鼠伤寒沙门氏菌的生长，根据其在15个 小时内抑菌圈大小，评价其抗菌能力，具体抑菌圈大小结果见表1，结果表明生 物碲纳米颗粒在10mg/ml和1mg/ml条件
下均能很好地抑制痢疾志贺氏菌、阪 崎肠杆菌、大肠杆菌以及鼠伤寒沙门氏菌的生长，而对照组的生理盐水没有形成 抑菌圈，只有牛津杯的外径环8mm。
97.表1不同浓度生物碲纳米颗粒的抗菌效果(单位：mm)
[0098][0099]
备注：nd表示无抗菌效果。
[0100]
实施例9生物碲纳米颗粒抗菌应用实例
[0101]
(1)取约8*109cfu/ml的大肠杆菌atcc 25922 50μl菌悬液，2次涂 布，25μl/次，均匀涂布在2cm*2cm的载玻片上；
[0102]
(2)约15分钟，菌液在载玻片上干燥后，加入浓度为10mg/ml的实施 例6中提取的生物碲纳米颗粒100μl覆盖菌液涂布的区域，同时以100μl的 生理盐水的涂布作为对照；
[0103]
(3)在室温条件下，经过材料处理30分钟后，用无菌棉签将2cm*2cm 区域内的微生物收集起来，然后将棉签头浸泡在1ml的0.85％的生理盐水中；
[0104]
(4)然后取50μl上述处理后的生理盐水和生物碲纳米颗粒，梯度稀释至 10-3
后涂布mha平板，计算菌落的数量。
[0105]
结果说明：
[0106]
如图8，通过稀释平板法进行菌落计数，评价其物表的实际杀菌效果，数据 显示经过10mg/ml和生理盐水(对照组)处理后的大肠杆菌存活率分别为 15.13％和100％，结果显示，生物碲纳米颗粒可以在30min内，将接触过载玻片 的大肠杆菌进行灭活，其最大灭活率可达到84.87％。
[0107]
附：seq id no.1(mortierella sp.ab1的its序列)
[0108]
gcggaaggatcattcataatcaagtgtttttatggcactttcaaaaatcca tatccaccttgtgtgcaatgtcatctctctgggggctgccggctgtcaaaa gccgtgtggtcacctttgggatttatatctactcagaactttagtgatttt gtctgaaacatattatgaatacttaattcaaaatacaactttcaacaacg gatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgta atgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcatattgcg ctctctggtattccggagagcatgcttgtttgagtatcagtaaacacctca acttccatatcttttttgaaatgggagttggacttgagtgatcccaacgct tttccttaccgaaaagtggcgggttacttgaaatgcaggtgcagctggac ttttctctgagctataagcatatctatttagtctgcctaaaaaacagatta ttacctttgctgcagctaacataaaggagattagttcttgtgctgactgat gcaggattcacaaagacaggcttcggccgactttgtaaactcgatctcaa at