一种山麦冬离体快繁方法

1.本发明涉及植物生物技术中的植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种山麦冬离体快繁方法。


背景技术：

2.山麦冬(liriope spicata(thunb.)lour.)为天门冬科山麦冬属的多年生草本植物。原产于中国、日本和越南，在中国野生资源非常丰富且分布广泛。山麦冬具有耐寒、耐阴、耐旱的特性，可适应林下、路旁、山地、湿地等多种环境；可观叶、可观花、可地栽、可盆栽，适用于林下覆盖、道旁绿化、园林造景、庭院美化、家庭装饰等多种场景，兼具观赏植物和地被植物的特性。因此山麦冬是既具有本国特色，又符合现代园林景观和城市绿化需求的优质资源。
3.目前，对于山麦冬的研究大都集中在其药用价值和药用成分分析方面，只有少量的无性繁殖相关研究报道，生产中主要使用的繁殖方式为种子繁殖和地下茎分株繁殖，效率较低，种苗一致性差，且受季节影响较大，难以实现周年生产。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种便捷高效的山麦冬离体快繁方法，以山麦冬幼嫩的种胚为外植体，经过外植体消毒、诱导愈伤、增殖培养、分化培养、生根培养等过程，明显加快了山麦冬再生进程，并提高了再生效率，其中愈伤诱导、继代增殖、发芽分化所使用的为同一种培养基，进一步建立了简单高效的山麦冬再生体系，从而实现本发明的目的。
5.本发明所提供的山麦冬离体快繁方法，包括如下步骤：
6.(1)外植体消毒：取山麦冬种子，清洗，消毒；
7.(2)愈伤诱导及芽分化：从步骤(1)中处理过的种子中挑取出种胚，将所得种胚接种至再生培养基上，黑暗培养进行愈伤诱导及芽分化；
8.(3)愈伤增殖及丛生芽分化：将步骤(2)中诱导出的已分化出芽的愈伤组织切割成小块，移接至新鲜的再生培养基上，光照培养进行丛生芽分化，并将长满丛生芽的愈伤块分成小块不断扩增；
9.(4)生根培养：将步骤(3)中的丛生芽切下，移接至生根培养基上，生根培养，得到山麦冬组培苗。
10.上述方法步骤(1)中，所述山麦冬幼嫩种子为山麦冬当年生的绿色幼嫩种子；
11.所述清洗、消毒的操作为：用洗洁精浸泡20min(每5min剧烈摇晃30s)，流水冲洗2～4h；在超净工作台中，用75％(v/v)乙醇浸泡5～10min，再用质量浓度为1％的naclo浸泡10～20min，无菌水涮洗5～8次，最后将种子置于无菌水中备用。
12.步骤(2)中将步骤(1)中处理过的种子从无菌水中取出置于无菌滤纸上，沿种脐纵向切开，用镊子挑取其种胚；
13.所述再生培养基为ms 6-ba 2mg/l naa 0.2mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7g/l，ph为5.8；
14.所述黑暗培养在20-25℃温度下进行，具体可为23℃；
15.所述黑暗培养进行2-3周；
16.步骤(2)的愈伤诱导率为85.17％，芽分化率为57.14％；
17.步骤(3)中，所述切割为将已分化出芽的愈伤组织切割至1cm2大小；
18.所述光照培养在20-25℃温度下进行，具体可为23℃；
19.所述光照培养的光照强度可为：50-200um
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，具体可为100um
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；
20.光照培养过程中，每30天更换一次培养基；
21.步骤(4)中，所述生根培养基为：ms iba 0.1mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7g/l，ph为5.8；
22.所述生根培养的条件为：每天光照12h，光照强度50-200um
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(具体可为100um
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)，培养温度为20-25℃，培养15-21天，具体可为20天。
23.该培养基生根率约为95％，生根状况良好，根较粗、较长、较多。
24.本发明还提供一种用于山麦冬离体快繁的试剂盒，为包括所述再生培养基和所述生根培养基的试剂盒，
25.其中，所述再生培养基为ms 6-ba 2mg/l naa 0.2mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7g/l，ph为5.8；
26.所述生根培养基为：ms iba 0.1mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7g/l，ph为5.8。
27.本发明的优点是：通过植物组织培养技术手段开发出一种通用于山麦冬幼嫩种子愈伤诱导、丛生芽诱导、丛生芽继代增殖全过程的高效培养基，及一种高效的生根培养基。本发明使山麦再生的多个环节(愈伤诱导、丛生芽诱导、丛生芽继代增殖)在同一种培养基上快速完成，并保持愈伤高效分化能力；生根培养基诱导丛生芽短时间生出大量健壮新根，大大缩短了培养时间，增强了生产效率，减少了工作量，真正实现了高效便捷。为大规模山麦冬种苗生产及优良性状的保持提供了技术支持。
附图说明
28.图1为本发明的山麦冬再生诱导过程图。
具体实施方式
29.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
30.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
31.本发明提供一种山麦冬离体快繁方法，包括如下步骤：
32.(1)外植体消毒：取山麦冬种子，清洗，消毒；
33.(2)愈伤诱导及芽分化：从步骤(1)中处理过的种子中挑取出种胚，将所得种胚接种至再生培养基上，23℃下黑暗培养2-3周进行愈伤诱导及芽分化；
34.所述再生培养基为ms 6-ba 2mg/l naa 0.2mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7g/l，ph为5.8；
35.(3)愈伤增殖及丛生芽分化：将步骤(2)中诱导出的已分化出芽的愈伤组织切割，
移接至新鲜的再生培养基上，23℃光照培养30天持续进行丛生芽分化；
36.(4)生根培养：将步骤(3)中的丛生芽切下，移接至生根培养基上，生根培养20天，得到山麦冬组培苗，
37.所述生根培养基为：ms iba 0.1mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7g/l，ph为5.8。
38.实施例1：
39.(1)外植体消毒：取山麦冬当年生的绿色幼嫩种子(种皮中无花青苷出现)，水中加入1滴洗洁精，浸泡20min(每5min振荡30s)，洗净泡沫后，用流水冲洗至少2h。在超净工作台中，用75％(v/v)乙醇浸泡5min(其间不断剧烈振荡容器)，再用质量浓度为1％naclo浸泡10min(其间不断剧烈振荡容器)，再用无菌水冲洗5次(其间不断剧烈振荡容器)，最后将种子置于无菌水中备用。
40.(2)愈伤诱导及芽分化：将步骤(1)中处理过的种子从无菌水中取出置于无菌滤纸上，沿种脐纵向切开，用尖头镊子挑取其种胚(种胚一般会被切成两半)，接种至再生培养基上，在23℃的条件下黑暗培养，培养3周。所述的再生培养基为：ms 6-ba 2mg/l naa 0.2mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7g/l，ph为5.8。分化出白色小芽的愈伤组织如图1所示。愈伤诱导率为85.17％，芽分化率为57.14％。
41.(3)愈伤增殖及丛生芽分化：将步骤(2)中诱导出的已分化出白色小芽的愈伤块切割至1cm2大小，移接至新鲜的再生培养基上，在23℃的条件下，光照培养，光照强度100um
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，每30天更换一次培养基，并将长满丛生芽的愈伤块(如图1)，分成小块不断扩增。丛生芽的分化效率太高，无法统计。
42.(4)生根培养：将步骤(3)中的丛生芽切下，插入生根培养基，每天光照12h，光照强度100um
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，培养温度为23℃的条件下，培养20天，得到山麦冬组培苗。所述的生根培养基为：ms iba 0.1mg/l 蔗糖30g/l 琼脂7g/l，ph为5.8。
43.实施例2
44.再生培养基激素配比与激素浓度试验分析：基础培养基选用ms 蔗糖30g/l 琼脂7g/l(ph5.8)，选用激素2,4-d、6-ba、naa、kt进行配比，比较其诱导效果。最后发现cim3号培养基(6-ba 2mg/l naa 0.2mg/l)诱导效率最高，周期最短，且能够使愈伤持续分化一年以上，仍保持较高的活力。
45.表1愈伤诱导培养基的配方及诱导诱导效率其统计
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实施例3
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已知生长素具有明显的促进生根的作用，因此选择市面上常用生长素iba、iaa、naa进行试验，根据三种激素的效应强度，设置各自的使用浓度(如表2所示，分别设置三种浓度)，基础培养基为ms 蔗糖30g/l 琼脂7g/l(ph5.8)。综合比较生根率、根数量、根长、根粗、根质量，含0.1mg/l iba的培养基生根效果最好。
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表2生根培养基的生根效果统计
[0050][0051]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申
请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。