用于急性髓系白血病的细胞疗法的嵌合抗原受体

1.本发明涉及一种嵌合抗原受体(car)，本发明进一步涉及包含该car的car t细胞、使用该car t细胞的细胞疗法。


背景技术：

2.急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,aml)是一种来源于骨髓的肿瘤，尽管化疗可以诱导高达70％的缓解率，但绝大部分患者都会复发。((bishop,1997))。
3.嵌合抗原受体t细胞(car t)疗法，为一种最近应用于临床上的新型细胞疗法，利用嵌合抗原受体t细胞设计患者自身的免疫细胞来对抗癌细胞，是一种精准的靶向肿瘤疗法。通过设计car并用它来激活t细胞而杀死靶标。嵌合抗原受体即car主要由两个结构域：胞外域和胞内信号转导区组成。机理为通过将含有能识别肿瘤细胞且激活t细胞的病毒载体转入t细胞而将t细胞改造成car t细胞用于治疗。
4.目前已经报道使用靶向cd19嵌合抗原受体t细胞治疗急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,all)，取得了惊人的效果(maude et al.,2014)，显示了嵌合抗原受体t细胞疗法对于治疗血液病的巨大潜力。
5.目前，cd123、cd33、cll1等靶点已经在临床前被验证为aml的潜在靶点(kenderian et al.,2015；mardiros et al.,2013；wang et al.,2018)。然而，针对这些靶点的疗法存在这样的缺点，由于这些靶点不仅在aml细胞上表达，同时也在造血干细胞中表达，因此，导致在进行car t治疗的时候会造成骨髓毒性，损害造血细胞的形成，使得患者可能难以耐受。
6.因此，对于复发难治性aml中的car t治疗，需要一种不造成骨髓毒性，且造血细胞的形成不受影响的具有安全性的治疗靶点，针对该靶点的car t细胞及应用这样的细胞进行治疗的细胞疗法。


技术实现要素：

7.上皮细胞黏附因子(epithelial cell adhesion factor,epcam)属于ⅰ型跨膜蛋白，表达于绝大多数正常上细胞。目前也被报道epcam在众多实体瘤上具有高表达。还有报道称epcam可以用作肿瘤干细胞的标志物(munz,baeuerle et al.2009)。
8.发明人在前期工作中发现，epcam也在部分白血病细胞上表达，尤其是复发难治性的aml上(zheng et al.,2017)。并且，我们发现epcam不在造血干细胞上表达，因此不会造成骨髓毒性。
9.此外，已知卡妥索单抗(catumaxomab)是一种抗cd3和上皮细胞黏附因子epcam的小鼠双特异性抗体，catumaxomab能够同时靶向肿瘤表面抗原epcam和t细胞表面受体cd3，激活并召集杀伤性t细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。而epcam car t是在t细胞上过表达可以直接识别epcam的car结构，两者具有一定的相似性。鉴于欧盟已经临床批准catumaxomab用于治疗epcam阳性肿瘤的恶性腹水患者，这也提示了epcam car t应用于人体治疗时的安
全性。
10.本发明人通过试验证实，epcam能够作为aml治疗的靶点。在一个实施方式中，本发明提供了能够用于治疗epcam阳性复发难治性aml的epcam car，含有所述epcam car的car t细胞，该细胞的制备方法及使用该细胞的细胞疗法。
11.在一个实施方式中，本发明提供了一种嵌合抗原受体(car)，其中在所述car中包含epcam结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域。
12.本发明具体包括以下内容。
13.1.嵌合抗原受体，其包含分别编码人上皮细胞黏着分子(epcam)蛋白的结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域的序列，其包含如seq id no：2所示的氨基酸序列。
14.2.项1所述的嵌合抗原受体，其包含如seq id no：1所示的核苷酸序列。
15.3.car t细胞，其包含项1或2所述的嵌合抗原受体。
16.4.药物组合物，其包含项4所述的重组t细胞。
17.5.项1或2所述的嵌合抗原受体，或项3的car t细胞在制备用于治疗epcam阳性的白血病的药物中的应用，其中所述白血病优选为急性髓系白血病(aml)，例如为白血病细胞株hl60，k562。
18.6.car t细胞的制备方法，包括将如seq id no：1所示的核苷酸序列，或编码如seq id no：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列导入t细胞中，
19.优选所述方法为利用慢病毒载体进行的转染，更优选为使用pcdh,ps.pax2，pmd2g共转染293t细胞进行的转染。
20.附图简述
21.图1t细胞car阳性率的流式检测图。
22.图2两种髓系白血病细胞系epcam阳性的流式检测图。
23.图3epcam car t细胞体外杀伤活性的图
24.图4epcam car t细胞产生的细胞因子的结果的图。
25.图5epcam car t细胞被epcam

aml刺激增殖的结果的图图6epcam car t细胞对造血干细胞的分化的影响结果的图
26.图7epcam car t细胞在体内对aml的清除，(a)hl60荷瘤鼠体内治疗方案示意图，(b)来自一个实验的小鼠荧光成像的肿瘤负荷代表图(n＝8)，(c)总荧光值统计图，(d)kaplan-meier生存分析。
具体实施方式
27.实施例1epcam car t细胞的制备
28.嵌合抗原受体t细胞(car t细胞)的制备和生产
29.依次将鼠源抗人epcam的scfv(序列如seq id：3所示)连上cd8跨膜区(序列如seq id：4所示)，41bb共刺激域(序列如seq id：5所示)及cd3ζ(序列如seq id：6所示)插入到pcdh-mscv-mcs-ef1-copgfp(购自addgene公司)中。
30.或者将cd19 car(序列如seq id：7所示)(ying et al.,2019)插入到pcdh-mscv-mcs-ef1-copgfp(购自addgene公司)中。
31.接着分别将下表的3种质粒利用pei(polyscience,23966)按照说明书操作转染到
293t细胞(购自中国科学院上海细胞库)中，收集48h和72h的细胞培养液上清以转导t细胞。
[0032][0033]
通过ficoll密度梯度离心从新鲜人外周血(来自安徽省血液中心)分离单个核细胞，使用cd3 t细胞阳选分离试剂盒(miltenyi，30-097-043)分离t细胞。将初始分离的t细胞分成两份，一份用于流式检测，另一份用于构建car t细胞。
[0034]
在第0天，用补充了5％人ab型血清(gemini，100-512)，2mmol/l谷氨酰胺的x-vivo 15培养基(lonza，be02-060f)以5
×
105/ml的浓度重悬t细胞，并按数目比为1:1比例加入抗cd3/cd28 dynabeads(thermo，11161d)，在加入抗cd3/cd28 dynabeads的时候同时加入il-2(金斯利，100万单位)使终浓度为100u/ml，每两天补充一次il-2。
[0035]
24小时后，将从上述收集的细胞培养液上清中利用50000g，4℃，离心2h得到的浓缩慢病毒以moi 50与终浓度为8ng/ml的聚凝胺(polybrene)(购自sigma，h9268)按聚凝胺的操作说明加入活化的t细胞中，720g，32℃离心1h，6-8h后换液。
[0036]
在转导过程中每天监测细胞培养，并添加完全x-vivo 15培养基保持细胞浓度为0.5
–1×
106细胞/ml。转导后第4天，去除dynabeads。第5天后收获细胞，即epcam car t细胞，分别用于后续分析及体内实验。
[0037]
实施例2epcam car t细胞的流式细胞仪鉴定
[0038]
测定组别：体外培养的epcam car t细胞细胞系，髓系白血病细胞系k562和hl60。
[0039]
流式细胞的测定
[0040]
使用下述抗体，采用bd lsrii流式细胞仪进行检测，使用flowjo v10进行分析。
[0041]
本发明中在流式细胞术中使用的抗体包括：
[0042]
抗人抗体epcam(购自biolengend，324208),抗鼠fab抗体(购自jackson immunoresearch115-606-006)，
[0043]
抗人cd34抗体(购自bd，555821),
[0044]
抗人cd38抗体(购自biolegend，303522)，
[0045]
alexa fluor 647缀合的山羊抗小鼠f(ab')2抗体(购自jackson immunoresearch)。
[0046]
把实施例1中收获的体外培养的epcam car t细胞系，或髓系白血病细胞系k562或hl60在补充有2％胎牛血清的磷酸盐缓冲液中洗涤一次，并用小鼠血清阻断fc受体后于4℃避光染色30min，pbs洗涤两次后上机(bd lsrii)检测，获得各组细胞流式检测的t细胞car阳性率。
[0047]
具体地，epcam car的表面表达的检测使用了alexa fluor 647缀合的山羊抗小鼠
f(ab')2抗体进行染色，小鼠scfv使用抗小鼠anti-fab抗体用来标记，结果示于图1、图2。
[0048]
图1显示，被anti-fab抗体染色的t细胞car阳性率达到92.6％，证明epcam car慢病毒载体有效感染了t细胞，可知本发明的car在细胞膜上表达成功，证实获得的t细胞即为本发明的epcam car t细胞。
[0049]
作为适用本发明的细胞疗法的细胞，发明人在后续实施例中使用了epcam阳性的髓系白血病细胞系k562和hl60(购自中科院上海细胞库)，图2显示：髓系白血病细胞系k562和hl60中出现了在apc缀合的epcam抗体染色的峰，证实这两种细胞为epcam阳性细胞。
[0050]
实施例3epcam car t细胞的细胞杀伤检测
[0051]
通过生物发光法对本发明的epcam car t细胞的体外杀伤活性进行评估。
[0052]
测定组别：epcam car t细胞组，cd19 car t细胞(该细胞的构建见实施例1)作为阴性对照。靶细胞为髓系白血病细胞系k562和hl60(稳定表达荧光素酶，购自中国科学院上海细胞库)。
[0053]
生物发光法是一种基于荧光素酶的测定方法，将稳定表达荧光素酶的k562，hl60细胞(每孔1万个)和epcam car t细胞或cd19 car t细胞按照效应细胞：靶细胞比(效靶比e：t)为5:1-1.25:1共孵育，使用多功能酶标仪(clariostar)检测剩余肿瘤细胞的残留荧光素酶活性。
[0054]
裂解百分比系数计算如下：裂解百分比＝100
–
(((来自t细胞处理过的孔的平均信号)/(平均来自未处理目标孔的信号))
×
100)。
[0055]
分别设置三个效靶比(5:1，2.5:1，1.25:1)进行比较，结果如图3所示。
[0056]
结果显示：采用生物发光法检测各组car t细胞对epcam阳性aml细胞系的杀伤活性时，观察到在白血病细胞系k562和hl60中，epcam car t细胞组的裂解百分比均明显高于阴性对照cd19 car t细胞组，即，epcam car t细胞组的杀伤能力高于cd19 car t细胞，证明本发明的epcam car t细胞能够特异性杀伤epcam阳性的靶细胞。
[0057]
实施例4epcam car t细胞在体外产生的细胞因子检测
[0058]
评估了epcam car t细胞在体外产生的细胞因子il-2，tnfα和ifn-γ的水平。
[0059]
测定组别：epcam car t细胞组，cd19 car t细胞(该细胞的构建见实施例1)作为阴性对照。靶细胞为髓系白血病细胞系k562和hl60购自中科院上海细胞库)。
[0060]
将各组car t细胞与靶细胞分别以1：1的比例共孵育(每孔细胞100,000个)，24小时后，收集上清液，使用elisa试剂盒(il2 elisa 试剂盒，达科为，dkw12-1020-096；tnfαelisa试剂盒，达科为，dkw12-1720-096；ifnγelisa试剂盒，达科为，dkw12-1000-096；)按照说明书对上清液中的il-2，tnfα和ifn-γ的细胞因子水平进行测量。结果如图4所示。
[0061]
结果显示，在与epcam阳性的靶细胞共孵育24h后，在k562和hl60中，epcam car t细胞组均产生了显著高水平的杀伤性细胞因子il-2，tnfα和ifn-γ(*表示p《0.05,**表示p《0.01,***表示p《0.001)。而在cd19car t细胞进行处理的靶细胞k562和hl60中，则几乎未检测到这些细胞因子的表达或表达较低，进一步证明epcam car t可以特异性杀伤epcam阳性靶细胞。
[0062]
实施例5基于cfse标记的细胞增殖实验
[0063]
cfse(羧基荧光素双乙酸盐，琥珀酰亚胺酯)，可以与赖氨酸侧链或其他氨基基团反应，共价偶联至细胞内和细胞表面的蛋白，适合用于细胞标记。
biotechnology,lock)，并进行荧光成像检测。将处理日程表及检测结果示于图7，并对各组小鼠的生存天数进行kaplan-meier生存分析。
[0081]
结果显示：在各时间点，epcam car t细胞组的荧光均显著低于pbs治疗组和cd19 car t治疗组，结果证明，epcam car t细胞在体内可以有效清除aml肿瘤(图7b，c)。
[0082]
kaplan-meier生存分析结果显示，在第40天，cd19 car t治疗组的生存率为50％，epcam car t细胞治疗组的生存率为100％，在第60天，cd19 car t治疗组的生存率为0％，epcam car t细胞治疗组的生存率为37.5％，可知相比于pbs治疗组和cd19 car t细胞治疗组，epcam car t细胞可以更为有效地延长荷瘤小鼠的生存时间(图7d)。
[0083]
参考文献
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