一种1-苯乙烯基异喹啉衍生物及其制备与应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种1-苯乙烯基异喹啉衍生物的制备方法；本发明还同时涉及1-苯乙烯基异喹啉衍生物在制备抗胃癌药物中的应用。


背景技术：

2.胃癌是全球常见的恶性肿瘤，在全球恶性肿瘤导致的相关死亡原因中排第三位。70% 以上的胃癌新发病例在发展中国家，约50% 的病例发生在亚洲东部，主要集中在中国，其死亡率位居中国恶性肿瘤第二位。早期胃癌经过内镜下治疗或手术治疗后，其5年生存率可达90%以上，但由于胃癌早期症状常不明显，绝大部分患者就诊时已达晚期，故胃癌整体五年生存率仍徘徊在较低水平。晚期胃癌患者多数已丧失通过手术治疗直接根治性切除肿瘤的机会，目前晚期胃癌最主要治疗方案是化疗。如今临床上应用于晚期胃癌的药物种类繁多，如氟尿嘧啶类药物、铂类和小分子激酶抑制剂 (如阿帕替尼)等，均有不同程度的毒副作用。因此，研究与开发更高效、更安全的抗肿瘤药物分子具有深远的意义。
3.异喹啉类生物碱是自然界中很重要的一类生物碱，是植物体内次生代谢的产物，数量众多，结构类型复杂。大量具有异喹啉骨架的生物碱于防己科、番荔枝科、罂粟科、芸香科、樟科、小檗科、芸香科等植物中分离得到，现有的研究已证实具有该类化合物具有广泛的药理活性。特别是1-烯基异喹啉作为一种特殊的支架，由于其广泛的抗菌、抗癌以及酶抑制剂的活性而引起了人们的关注。鉴于此，我们认为是有望从1-苯乙烯基异喹啉类化合物中寻找抗肿瘤药物的。
4.随后，我们以1-苯乙烯基异喹啉为基本骨架，引入各种取代基调整电子效应，设计合成了一系列1-苯乙烯基异喹啉衍生物，初步的体外药理实验证实该类化合物具有较好的抗胃癌活性，后续希望进行更深入的研究以期得到能有效治疗胃癌的活性化合物。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种1-苯乙烯基异喹啉衍生物及其制备方法；本发明的另一个目的是提供1-苯乙烯基异喹啉衍生物在制备抗胃癌药物中的应用。
6.本发明一种1-苯乙烯基异喹啉衍生物，其结构式为：其中r1为h、f、cl、br、me、ome或oh；r2为h、f、cl、br、me、ome或oh；r3为h、f、cl、br、
me、ome或oh；r4为h、f、cl、br、me、ome或oh；r5为h、f、cl、br、me、ome或oh。
7.本发明一种1-苯乙烯基异喹啉衍生物的制备方法，是以1-甲基异喹啉和苯甲醛类化合物为原料，以对甲苯磺酰胺为催化剂，以甲苯为溶剂，在氩气保护下，100~150℃下反应8~10 h，反应完成后，将有机相旋干，柱层析分离得到1-苯乙烯基异喹啉衍生物。
8.其中，苯甲醛类化合物为邻氟苯甲醛、邻氯苯甲醛、邻溴苯甲醛、邻甲基苯甲醛、间氟苯甲醛、间氯苯甲醛、间溴苯甲醛、间甲基苯甲醛、对氟苯甲醛、对氯苯甲醛、对溴苯甲醛、对甲基苯甲醛、2，3-二氟苯甲醛、2，4-二氟苯甲醛、2，5-二氟苯甲醛、2，6-二氟苯甲醛、2-氟-4-甲基苯甲醛、2-氟-5-甲基苯甲醛、2-氟-6-甲基苯甲醛、3，4-二氟苯甲醛、3，5-二氟苯甲醛、3-氟-2-甲基苯甲醛、3-氟-4-甲基苯甲醛、3-氟-5-甲基苯甲醛、4-氟-3-甲基苯甲醛、5-氟-2-甲基苯甲醛中的一种。苯甲醛类化合物的用量为1-甲基异喹啉化合物摩尔量的1.0~1.5倍；对甲苯磺酰胺的用量为1-甲基异喹啉化合物摩尔量的1.0~1.5倍。
9.本发明所制备的1-苯乙烯基异喹啉衍生物抗胃癌活性显著，在细胞水平上具有比5-氟尿嘧啶更高的活性，本发明制备的1-苯乙烯基异喹啉衍生物经cck-8法测定，平板克隆实验和edu实验显示具有抑制胃癌细胞增殖的作用。
10.本发明制备的1-苯乙烯基异喹啉衍生物经流式细胞术显示具有诱导胃癌细胞周期阻滞和凋亡的作用。
11.本发明所制备1-苯乙烯基异喹啉衍生物经划痕实验和transwell实验显示具有抑制胃癌细胞迁移和侵袭的作用。
12.本发明所制备的1-苯乙烯基异喹啉衍生物具有抑制pi3k/akt/mtor途径诱导细胞凋亡。
13.综上所述，本发明以1-甲基异喹啉及苯甲醛类化合物为原料，通过对甲苯磺酰胺催化发生分子间亲核加成消除反应得到1-苯乙烯基异喹啉衍生物。本发明所制备的1-苯乙烯基异喹啉衍生物具有良好的抗胃癌活性，阻滞细胞周期在g2/m期，通过抑制pi3k/akt/mtor途径诱导细胞凋亡。对肿瘤细胞具有良好的细胞毒性且合成简单，可应用于制备胃癌治疗药物。
附图说明
14.图1为所选化合物对胃癌hgc-27细胞克隆群落形成的影响；图2为所选化合物对胃癌hgc-27细胞动态增殖的影响；图3为所选化合物对胃癌hgc-27细胞迁移的影响；图4为所选化合物对胃癌hgc-27细胞侵袭的影响；图5为化合物14对胃癌细胞hgc-27周期分布的影响；图6为化合物20对胃癌细胞hgc-27周期分布的影响；图7为所选化合物对胃癌hgc-27细胞周期相关蛋白的影响；图8为所选化合物对胃癌hgc-27细胞hoechst 33342染色情况；图9为化合物14对胃癌细胞hgc-27凋亡的影响；图10为化合物20对胃癌细胞hgc-27凋亡的影响；图11为化合物14对胃癌细胞hgc-27线粒体膜电位的影响；
图12为化合物20对胃癌细胞hgc-27线粒体膜电位的影响；图13为所选化合物对胃癌hgc-27细胞凋亡相关蛋白的影响；图14为所选化合物对凋亡相关的上游信号通路pi3k/akt/mtor的影响。
具体实施方式
15.下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
16.实施例1(e)-1-(2-fluorostyryl)isoquinoline(化合物1)化合物1的结构式为：将1-甲基异喹啉（1.0 mol）、邻氟苯甲醛（1.1 mol）、对甲苯磺酰胺（1.1 mol）置于50 ml圆底烧瓶，并置换成氩气，加入10 ml甲苯，于120℃加热回流，反应8小时。经tlc监测反应完成后，旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到化合物(e)-1-(2-fluorostyryl)isoquinoline (化合物1)，产率为67%。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.63 (d, j = 8.3 hz, 1h), 8.55 (d, j = 5.5 hz, 1h), 8.32 (d, j = 15.6 hz, 1h), 8.21
ꢀ–ꢀ
8.11 (m, 2h), 7.93 (d, j = 7.8 hz, 1h), 7.78
ꢀ–ꢀ
7.64 (m, 3h), 7.38 (ddd, j = 12.6, 5.7, 2.7 hz, 1h), 7.31
ꢀ–ꢀ
7.21 (m, 2h).
13
c nmr (101 mhz, dmso-d6) δ 160.27 (d, j = 248.9 hz), 153.24, 142.25, 136.22, 130.30 (d, j = 8.5 hz), 130.09, 128.08 (d, j = 3.0 hz), 127.49, 127.09, 126.32 (d, j = 4.5 hz), 126.16, 124.95 (d, j = 4.1 hz), 124.64 (d, j = 3.4 hz), 124.53, 124.03 (d, j = 11.4 hz), 120.17, 115.75 (d, j = 21.9 hz).实施例2(e)-1-(2-chlorostyryl)isoquinoline (化合物2)化合物2结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为邻氯苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例1，产率为71%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 8.57 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.33 (d, j = 15.5 hz, 1h), 8.29 (d, j = 8.4 hz, 1h), 7.93 (d, j = 15.6 hz, 1h), 7.84
ꢀ–ꢀ
7.76 (m, 2h), 7.68
ꢀ–ꢀ
7.61 (m, 1h), 7.60
ꢀ–ꢀ
7.50 (m, 2h), 7.41 (m, 1h), 7.28 (td, j = 7.6, 1.4 hz, 1h), 7.25
ꢀ–ꢀ
7.18 (m, 1h). 13
c nmr (101 mhz, dmso-d6) δ 154.11, 142.50, 136.57, 135.14, 134.28, 131.94, 129.92, 129.79, 129.29, 127.23, 127.19, 127.18, 126.83, 126.68, 120.16.
j = 243.1 hz), 153.35, 142.18, 139.13 (d, j = 8.0 hz), 136.20, 133.77 (d, j = 2.7 hz), 130.45 (d, j = 8.5 hz), 130.06, 127.38, 127.03, 126.25, 124.80, 124.37, 124.24 (d, j = 2.4 hz), 120.09, 115.17 (d, j = 21.5 hz), 113.50 (d, j = 21.8 hz).实施例6(e)-1-(3-chlorostyryl)isoquinoline (化合物6)化合物6结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为间氯苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例1，产率为83%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 8.52 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.27 (d, j = 8.4 hz, 1h), 7.97
ꢀ–ꢀ
7.83 (m, 2h), 7.76 (d, j = 8.0 hz, 1h), 7.66
ꢀ–ꢀ
7.60 (m, 2h), 7.56 (t, j = 7.5 hz, 1h), 7.51 (d, j = 5.6 hz, 1h), 7.50
ꢀ–ꢀ
7.45 (m, 1h), 7.32
ꢀ–ꢀ
7.21 (m, 2h). 13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 153.77, 142.31, 138.65, 136.55, 134.57, 134.06, 129.85, 129.81, 128.30, 127.20, 127.17, 126.76, 126.61, 125.77, 124.1, 123.98, 120.17.实施例7(e)-1-(3-bromostyryl)isoquinoline (化合物7)化合物7结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为间溴苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例1，产率为72%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 8.53 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.28 (d, j = 8.4 hz, 1h), 7.96
ꢀ–ꢀ
7.82 (m, 2h), 7.83
ꢀ–ꢀ
7.75 (m, 2h), 7.67
ꢀ–ꢀ
7.61 (m, 1h), 7.58 (td, j = 7.6, 6.9, 1.3 hz, 1h), 7.53 (d, j = 6.1 hz, 2h), 7.44
ꢀ–ꢀ
7.39 (m, 1h), 7.22 (t, j = 7.8 hz, 1h). 13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 153.85, 142.40, 139.04, 136.64, 134.07, 131.28, 130.22, 129.90, 129.75, 127.29, 127.27, 126.70, 126.32, 124.24, 124.11, 122.91, 120.26.实施例8(e)-1-(3-methylstyryl)isoquinoline(化合物8)化合物8结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为间甲基苯甲醛，其余操作步骤皆同实施
例1，产率为81%。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.70 (d, j = 8.3 hz, 1h), 8.54 (d, j = 5.5 hz, 1h), 8.27 (d, j = 15.5 hz, 1h), 7.98 (d, j = 15.5 hz, 1h), 7.94 (d, j = 7.9 hz, 1h), 7.80
ꢀ–ꢀ
7.73 (m, 1h), 7.73
ꢀ–ꢀ
7.66 (m, 3h), 7.63 (d, j = 7.7 hz, 1h), 7.30 (t, j = 7.6 hz, 1h), 7.15 (d, j = 7.5 hz, 1h), 2.36 (s, 3h). 13
c nmr (101 mhz, dmso-d6) δ 153.74, 142.22, 137.83, 136.37, 136.21, 135.22, 130.05, 129.32, 128.56, 127.95, 127.35, 127.06, 126.11, 125.05, 124.75, 122.56, 119.75, 20.93.实施例9(e)-1-(4-fluorostyryl)isoquinoline(化合物9)化合物9结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为对氟苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例1，产率为75%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 8.55 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.34 (d, j = 8.3 hz, 1h), 7.99
ꢀ–ꢀ
7.86 (m, 2h), 7.82 (d, j = 8.1 hz, 1h), 7.72
ꢀ–ꢀ
7.58 (m, 4h), 7.56 (d, j = 5.6 hz, 1h), 7.10 (t, j = 8.6 hz, 2h). 13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 162.95 (d, j = 248.7 hz), 154.36, 142.44, 136.74, 134.58, 133.14 (d, j = 3.4 hz), 129.94, 129.05 (d, j = 8.1 hz), 127.35, 127.23, 126.70, 124.38, 122.56 (d, j = 2.4 hz), 120.02, 115.79 (d, j = 21.7 hz).实施例10(e)-1-(4-chlorostyryl)isoquinoline(化合物10)化合物10结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为对氯苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例1，产率为71%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 8.53 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.27 (d, j = 8.4 hz, 1h), 7.90 (s, 2h), 7.76 (d, j = 8.1 hz, 1h), 7.63 (t, j = 7.4 hz, 1h), 7.59
ꢀ–ꢀ
7.53 (m, 3h), 7.51 (d, j = 5.6 hz, 1h), 7.37
ꢀ–ꢀ
7.30 (m, 2h).
13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 154.02, 142.35, 136.60, 135.30, 134.29, 134.12, 129.82, 128.86, 128.48, 127.24, 127.15, 126.61, 124.19.实施例11(e)-1-(4-bromostyryl)isoquinoline(化合物11)化合物11结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为对溴苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例
1，产率为83%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 8.54 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.31 (d, j = 8.4 hz, 1h), 7.99
ꢀ–ꢀ
7.86 (m, 2h), 7.80 (d, j = 8.0 hz, 1h), 7.69
ꢀ–ꢀ
7.64 (m, 1h), 7.60 (td, j = 7.6, 6.9, 1.3 hz, 1h), 7.53 (dd, j = 13.3, 3.7 hz, 5h).
13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 154.10, 142.44, 136.69, 135.81, 134.45, 131.88, 129.92, 128.83, 127.32, 127.25, 126.70, 124.28, 123.42, 122.47, 120.16.实施例12(e)-1-(4-methylstyryl)isoquinoline(化合物12)化合物12结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为对甲基苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例1，产率为74%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 8.56 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.36 (d, j = 8.4 hz, 1h), 7.97 (s, 2h), 7.81 (d, j = 7.9 hz, 1h), 7.70
ꢀ–ꢀ
7.64 (m, 1h), 7.64
ꢀ–ꢀ
7.58 (m, 3h), 7.54 (d, j = 5.6 hz, 1h), 7.23 (d, j = 7.9 hz, 2h), 2.40 (s, 3h). 13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 154.72, 142.45, 138.69, 136.72, 135.80, 134.17, 129.84, 129.50, 127.40, 127.27, 127.10, 126.69, 124.48, 121.80, 119.75, 21.40.实施例13(e)-1-(2,3-difluorostyryl)isoquinoline(化合物13)化合物13结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为2，3-二氟苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例1，产率为65%。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.57 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.30 (d, j = 8.4 hz, 1h), 8.18
ꢀ–ꢀ
7.98 (m, 2h), 7.81 (d, j = 8.0 hz, 1h), 7.70
ꢀ–ꢀ
7.64 (m, 1h), 7.63
ꢀ–ꢀ
7.59 (m, 2h), 7.58 (t, j = 5.0 hz, 1h), 7.48
ꢀ–ꢀ
7.41 (m, 2h).
13
c nmr (101 mhz, dmso-d6) δ 153.91, 152.36, 152.23, 150.50, 150.37, 149.90, 149.77, 147.98, 147.85, 142.48, 136.70, 129.96, 127.71, 127.69, 127.68, 127.66, 127.38, 127.33, 127.14, 127.05, 126.92, 126.84, 126.82, 124.25, 124.07, 124.02, 124.00, 123.95, 123.66, 123.63, 123.63, 123.60, 120.47, 116.73, 116.56.实施例14(e)-1-(2,4-difluorostyryl)isoquinoline(化合物14)
= 5.7 hz, 1h), 7.14 (m, 1h), 6.95
ꢀ–ꢀ
6.83 (m, 2h).
13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 162.67, 162.60, 160.16, 160.08, 154.07, 142.32, 136.45, 129.66, 128.91, 128.86, 128.80, 128.77, 128.69, 127.09, 127.03, 126.62, 124.09, 121.86, 121.84, 121.82, 120.16, 114.55, 114.40, 114.25, 111.64, 111.58, 111.44, 111.38.实施例17(e)-1-(2-fluoro-4-methylstyryl)isoquinoline(化合物17)化合物17结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为2-氟-4-甲基苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例1，产率为65%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 8.55 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.28 (d, j = 8.4 hz, 1h), 8.05 (m, 2h), 7.74 (d, j = 7.9 hz, 1h), 7.64
ꢀ–ꢀ
7.52 (m, 3h), 7.50 (d, j = 5.6 hz, 1h), 6.94 (d, j = 8.0 hz, 1h), 6.91 (d, j = 12.0 hz, 1h), 2.32 (s, 3h).
13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 160.97 (d, j = 251.6 hz), 154.45, 142.33, 140.48 (d, j = 8.4 hz), 136.54, 129.70, 128.74, 128.72, 128.57 (d, j = 4.1 hz), 127.11, 127.03, 126.60, 124.43 (d, j = 7.4 hz), 124.29, 121.82 (d, j = 11.9 hz), 119.84, 116.45 (d, j = 21.9 hz), 21.10 (d, j = 1.4 hz).实施例18(e)-1-(2-fluoro-5-methylstyryl)isoquinoline(化合物18)化合物18结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为2-氟-5-甲基苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例1，产率为72%。1h nmr(400 mhz, chloroform-d) δ 8.52 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.23 (d, j= 8.3 hz, 1h), 7.87 (s, 2h), 7.71 (d, j = 8.0 hz, 1h), 7.58 (t, j = 7.4 hz, 1h), 7.52 (t, j = 7.5 hz, 1h), 7.46 (d, j = 5.6 hz, 1h), 7.22
ꢀ–ꢀ
7.10 (m, 2h), 6.80 (d, j = 9.3 hz, 1h), 2.32 (s, 3h).
13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 162.94 (d, j = 244.8 hz), 153.82, 142.24, 140.37 (d, j = 8.2 hz), 138.67 (d, j = 8.3 hz), 136.47, 134.47 (d, j = 2.9 hz), 129.67, 127.10, 127.03, 126.52, 124.09, 124.00 (d, j = 2.3 hz), 123.57, 119.97, 115.87 (d, j = 21.3 hz), 110.55, 21.15 (d, j = 1.8 hz).实施例19(e)-1-(2-fluoro-6-methylstyryl)isoquinoline(化合物19)
1h), 7.82 (d, j = 7.9 hz, 1h), 7.71
ꢀ–ꢀ
7.66 (m, 1h), 7.63 (m, 1h), 7.58 (d, j = 5.6 hz, 1h), 7.22
ꢀ–ꢀ
7.11 (m, 2h), 6.77 (m, 1h).
13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 164.59, 164.46, 162.13, 162.00, 153.50, 142.48, 140.40, 140.36, 140.31, 140.21, 136.74, 133.47, 133.44, 133.41, 130.05, 127.47, 127.42, 126.83, 125.30, 124.17, 120.62, 110.07, 110.00, 109.89, 109.82, 103.94, 103.69, 103.43.实施例22(e)-1-(3-fluoro-2-methylstyryl)isoquinoline(化合物22)化合物22结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为3-氟-2-甲基苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例1，产率为70%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 8.58 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.30 (d, j = 8.4 hz, 1h), 8.21 (d, j = 15.4 hz, 1h), 7.88 (d, j = 15.4 hz, 1h), 7.78 (d, j = 8.0 hz, 1h), 7.67
ꢀ–ꢀ
7.62 (m, 1h), 7.60
ꢀ–ꢀ
7.51 (m, 3h), 7.23
ꢀ–ꢀ
7.14 (m, 1h), 7.02 (t, j = 8.8 hz, 1h), 2.43 (s, 3h).
13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 161.33 (d, j = 243.1 hz), 154.19, 142.35, 138.39 (d, j = 4.7 hz), 136.58, 132.61 (d, j = 2.8 hz), 129.82, 127.20, 127.17, 126.64 (d, j = 2.6 hz), 126.57, 125.37, 124.27, 123.84 (d, j = 16.4 hz), 121.51 (d, j = 3.1 hz), 120.09, 114.69 (d, j = 23.6 hz), 10.81 (d, j = 6.0 hz).实施例23(e)-1-(3-fluoro-4-methylstyryl)isoquinoline(化合物23)化合物23结构式为：将实施例1操作步骤中的邻氟苯甲醛换为3-氟-4-甲基苯甲醛，其余操作步骤皆同实施例1，产率为78%。1h nmr (400 mhz, chloroform-d) δ 8.49 (d, j = 5.6 hz, 1h), 8.20 (d, j = 8.3 hz, 1h), 7.92
ꢀ–ꢀ
7.78 (m, 2h), 7.68 (d, j = 8.0 hz, 1h), 7.60
ꢀ–ꢀ
7.52 (m, 1h), 7.52
ꢀ–ꢀ
7.46 (m, 1h), 7.43 (d, j = 5.6 hz, 1h), 7.27 (t, j = 8.8 hz, 2h), 7.10 (t, j = 7.8 hz, 1h), 2.23 (s, 3h). 13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 161.36 (d, j = 244.5 hz), 153.95, 142.23, 136.53, 136.47, 134.36 (d, j = 2.5 hz), 131.47 (d, j = 5.5 hz), 129.64, 127.08, 126.98, 126.48, 125.09 (d, j = 17.6 hz), 124.09, 123.10 (d, j = 3.0 hz), 122.75, 119.84, 112.98 (d, j = 22.7 hz), 14.37 (d, j = 3.4 hz).实施例24(e)-1-(3-fluoro-5-methylstyryl)isoquinoline(化合物24)
1h), 7.71 (d, j = 8.0 hz, 1h), 7.58 (t, j = 7.3 hz, 1h), 7.52 (t, j = 7.5 hz, 1h), 7.45 (m, 2h), 7.15
ꢀ–ꢀ
7.06 (m, 1h), 6.92 (td, j = 8.2, 2.1 hz, 1h) ,2.43 (s, 3h). 13
c nmr (101 mhz, chloroform-d) δ 161.24 (d, j = 242.9 hz), 153.86, 142.23, 137.39 (d, j = 7.3 hz), 136.39, 132.35 (d, j = 2.9 hz), 132.24 (d, j = 2.4 hz), 131.62 (d, j = 7.9 hz), 129.60, 127.03, 127.00, 126.48, 124.77, 124.04, 119.94, 114.81 (d, j = 21.1 hz), 111.86 (d, j = 21.7 hz), 19.05.实施例27 cck8法测定细胞生长抑制率实验方法：将三株人胃癌细胞(hgc-27、sgc-7901和bgc-823)用含有10%或20%胎牛血清的rpmi-1640培养基在37 ℃、5% co2条件下放置在细胞培养箱中培养，待细胞处于对数期时，以每孔5000~8000个细胞接种于96孔板中，培养基体积为100μl，培养24 h后加入10 μl含有不同浓度待测样品的培养基，各孔培养基体积补充至200μl，每个实验浓度设置3个复孔，同时设置空白对照组。待实验细胞培养72 h 后，加入10 μlcck8溶液，孵育2 h 后在450 nm 波长下利用酶标仪测定实验中96 孔板各孔的吸光值（od 值），计算细胞增殖抑制率(inhibitory rate，ir)，细胞增殖抑制率%=1-（实验孔平均od值-空白od值）/（对照孔平均od值-空白od值），并用spss 20.0计算半数抑制浓度ic
50
值（单位为μm），具体数据见下表。（上述平行实验均独立重复三次）
由上表可知此类化合物对胃癌细胞hgc-27均有突出的抑制活性，其中化合物14及20表现最为优良，ic
50
＜0.1μl。
17.实施例28 本发明化合物对胃癌细胞hgc-27增殖的影响（1）平板克隆实验取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种500个细胞，培养24 h后加入化合物14/20。实验组加入不同浓度的化合物14/20。对照组则加等量不含化合物的培养液。每组3个复孔。在37℃、含5% co2、饱和湿度的培养箱中培养两周。期间3-4天换1次药液。经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用pbs缓冲液小心浸洗2次。用多聚甲醇固定细胞，15分钟后去除固定液。加适量0.5%结晶紫染色，30分钟后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
18.（2）edu实验取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。96孔板每孔种5000个细胞。贴壁后加药处理。实验组加入不同浓度的药物。对照组则加等量不含药物的培养液。每组3个复孔。在37℃、含5% co2、饱和湿度的培养箱中培养24 h，弃去上清液，加入100 μl含有50 μmedu的完全培养基，37℃孵育2h。4%的多聚甲醛固定后加入0.5%的曲拉通透膜。pbs洗两次后，先后加入apollo染液和hoechst 33342染液，pbs清洗后，在显微镜下观察。
19.实验结果：图1为化合物14/20对胃癌细胞hgc-27克隆群落形成的影响。图中显示化合物14/20能够呈浓度依赖性地抑制胃癌细胞hgc-27克隆群落的形成，且经统计具有显著性差异。
20.图2为化合物14/20对胃癌细胞hgc-27动态增殖的影响。图中显示化合物14/20经edu实验测定，能够呈浓度依赖地抑制胃癌细胞hgc-27动态增殖，且经统计具有显著性差异。
21.实施例29本发明化合物对胃癌细胞hgc-27侵袭、迁移的影响实验方法：（1）transwell迁移实验取出transwell小室(corning 3422) 放入24孔板各孔中。每孔加600μl含有20%血清的培养基。消化细胞，得细胞悬液，按每毫升2
ꢀ×ꢀ
105个细胞接入上室。上室加2
ⅹ
浓度药物，加无血清培养基并使上室终体积为200μl。放入细胞培养箱培养24 h。取出小室，用棉签擦去上室内侧未穿过的细胞，用甲醇室温固定10min，pbs清洗，移去小室，倒置，风干。用pbs配制浓度为0.1%结晶紫溶液，每孔加700μl，将小室浸入其中，置于37℃培养箱中染色30min；取出小室，用pbs清洗，并在显微镜下观察，在膜上相互垂直的直径上取5个不同视野，计透膜细胞数。
22.（2）transwell侵袭实验从-20℃冰箱取出matrigel于4℃过夜融化，将ep管于冰上预冷，并将融化后的matrigel与预冷无血清无双抗培养基按体积比1:8混合，轻轻混匀。每个transwell板小室上层加40μl混合后的matrigel混合液，轻轻混匀，并置于培养箱中1h。取出transwell板，轻轻吸弃小室中多余液体，于小室上层加200μl无血清无双抗培养基并将transwell板放入培养箱中1h，水化基底膜。取出transwell小室，下室每孔加600μl含有20%血清培养基。消化细胞，得细胞悬液，按每毫升3
ꢀ×ꢀ
105个细胞接入上室，上室加 2
ⅹ
浓度药物，加无血清培养基并使上室终体积为200 μl，放入细胞培养箱培养24 h。取出小室，用棉签擦去上室内侧未穿过的细胞，用甲醇室温固定10min，pbs清洗，移去小室，倒置，风干。用pbs配制浓度为0.1%结晶紫溶液，每孔加700μl，将小室浸入其中，置于37℃培养箱中染色30min；取出小室，用pbs清洗，并在显微镜下观察，在膜上相互垂直的直径上取5个不同视野，计透膜细胞数。
23.实验结果：图3为化合物14/20对胃癌细胞hgc-27迁移的影响。从图中可看出化合物14/20能够呈浓度依赖性地抑制胃癌细胞hgc-27迁移，且经统计具有显著性差异。
24.图4为化合物14/20对胃癌细胞hgc-27侵袭的影响。从图中可看出化合物14/20能够呈浓度依赖性地抑制胃癌细胞hgc-27侵袭，且经统计具有显著性差异。
25.实施例30本发明化合物对胃癌细胞hgc-27周期分布的影响实验方法：（1）流式细胞术取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种20
×
104个细胞。在37℃、含5% co2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入不同浓度药物处理48 h。每组3个复孔。培养48 h后收集细胞，用预冷的pbs3次洗涤收集的细胞，离心沉淀细胞，弃上清。用500μl pbs重悬细胞，迅速打入预冷的无水乙醇中，吹打均匀，4℃储存过夜。离心乙醇固定过的细胞，弃上清， pbs洗涤细胞3次。用rnase a于37℃重悬细胞，15min后，加入pi染色液避光染色15 min。流式细胞仪测定细胞周期。用modfitlt软件分析流式周期结果，统计g0/g1期、s期、g2/m期各组所占百分比。
26.（2）周期相关蛋白cdk1, cyclin a, cyclinb的检测。
27.将胃癌细胞hgc-27接种于6孔板中，37℃、 5% co2培养箱中培养过夜后，用不同浓度的化合物14/20作用24 h，之后用pbs洗细胞2次，使用索莱宝高效ripa裂解液300 μl于冰
上裂解10min，收集样品，样品液加sds-page蛋白上样缓冲液(5
×
)，涡旋混匀后于95℃水浴中变性10 min，冷却后置于-20 ℃待测。用保鲜膜密封凝胶玻璃板，根据待测蛋白分子量大小配制相应浓度的sds-page 分离胶和浓缩胶，之后插入梳子，向上垂直放置并静置数分钟，充分凝固后拆去保鲜膜和梳子。将制好的胶板插入电泳槽，每个上样孔加入等体积的样品和marker。在梯度电泳条件下跑电泳。电泳结束后，剥离凝胶，将0.45 μm pvdf 膜于甲醇中活化10 min，使用湿转转印法电泳槽将分离后的蛋白样品转印至活化后的pvdf 膜上。待转印结束，将pvdf 膜置于5%脱脂奶粉的tbst 封闭液中室温封闭1.5 h。用tbst 缓冲液洗膜3 次，各10 min。将pvdf 膜置于适当比例稀释的对应一抗中，于4
ꢀ°
c 孵育过夜。用tbst 缓冲液洗膜3 次，各5 min。加入适当比例稀释的hrp标记的igg 二抗，室温摇床孵育1.5 h。抗体孵育结束后，再次用tbst 缓冲液洗膜3次，各10 min。加入ecl 化学发光液，采用多功能成像仪进行化学发光成像测定。
28.实验结果：图5、图6分别为化合物14和化合物20对胃癌细胞hgc-27周期分布的影响。结果显示化合物14/20将胃癌细胞hgc-27周期阻滞在g2/m期。
29.图7为化合物14/20对胃癌细胞hgc-27周期相关蛋白cdk1, cyclin a, cyclin b表达的影响。图中显示：化合物14/20能够呈浓度依赖性地下调cdk1, cyclin a, cyclin b蛋白的表达，且具有统计学显著性。
30.实施例31本发明化合物对胃癌细胞hgc-27凋亡的影响实验方法：（1）hoechst 33342染色取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种5
×
104个细胞。贴壁后加药处理。实验组加入不同浓度的药物。对照组则加等量不含药物的培养液。每组3个复孔。在37℃、含5% co2、饱和湿度的培养箱中培养24h，弃去上清液，用pbs小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞，10分钟后去除固定液。加10 μg/mlhoechst 33342染液染色，30分钟后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
31.（2）流式细胞术取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种15
×
104个细胞。在37℃、含5% co2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入不同浓度药物处理48 h。每组3个复孔。培养48 h后收集细胞，用annexin-v fitc/pi凋亡试剂盒对细胞染色，用流式细胞仪分析细胞凋亡。
32.（3）线粒体膜电位检测取生长状态良好，处于对数生长期的细胞，常规胰酶消化后培养液吹打成细胞悬液。六孔板每孔种2
×
106个细胞。在37℃、含5% co2、饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁后加入不同浓度药物处理。每组3个复孔。随后，胰蛋白酶消化收集细胞，加入1 ml含tmre的培养基，在37℃下孵育30min，而后离心（1000rpm，5min），用培养基冲洗两次。用500微升培养基悬浮细胞，然后用流式细胞仪检测。
33.（4）凋亡相关蛋白cleaved-casepase-3, cleaved-casepase-9, bcl-2, bax and cytochrome c的检测。
34.将胃癌细胞hgc-27接种于6孔板中，37
ꢀ°
c、 5% co2培养箱中培养过夜后，用不同
h。用tbst 缓冲液洗膜3 次，各10 min。
44.（6）一抗孵育：将pvdf 膜置于适当比例稀释的相应一抗中，于4
ꢀ°
c 孵育过夜。
45.（7）二抗孵育：用tbst 缓冲液洗膜3 次，各10 min。加入适当比例稀释的hrp标记的igg 二抗，室温摇床孵育1.5 h。
46.（8）化学发光：抗体孵育结束后，再次用tbst 缓冲液洗膜3次，各10 min。加入ecl 化学发光液，采用天能多功能成像仪化学发光模块成像。
47.实验结果：图14为化合物14/20对胃癌细胞hgc-27中pi3k/akt/mtor信号通路的影响。图中显示：化合物14/20能够呈浓度依赖性地下调p-pi3k, p-akt 和 p-mtor的表达，且具有统计学显著性，表明化合物14/20可以通过抑制pi3k/akt/mtor信号通路从而诱导肝癌细胞凋亡。