一种同时测定人他克莫司作用靶点——MAPK信号通路的基因多态性的方法

一种同时测定人他克莫司作用靶点
——
mapk信号通路的基因多态性的方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术和医学检验领域，具体涉及一种同时测定人他克莫司作用靶点——丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，mapk)信号通路的基因多态性的方法。


背景技术：

2.他克莫司治疗窗窄，疗效存在显著个体差异，目前，临床上通常通过对其进行治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，tdm)，即监测血药浓度，以调整他克莫司的剂量。但传统的tdm难以从药效学的角度反映个体之间的变异，而且tdm只有在服药后方可实施，无法在服药前预测机体对药物的反应，药物的初始剂量难以确定。因此，单纯依靠tdm来进行他克莫司的个体化治疗显然是不够的，迫切需要寻找新的个体化治疗策略。
3.现有技术公开了遗传变异是导致药物效应个体间变异的最主要因素之一。通过研究遗传变异与药物反应的关系，可以根据基因型制定药物的初始剂量，也可以筛选药物反应敏感或无效的特定人群，进行个体化治疗，药物基因组学是个体化药物治疗发展的新台阶。
4.他克莫司发挥免疫抑制作用的机制有两种。一是被广泛研究的钙调磷酸酶(calcineurin，can)抑制机制，tac通过抑制can的活性发挥免疫抑制作用。二是通过干扰mapk信号通路介导免疫抑制作用。mapk信号通路是利用逐级磷酸化过程将信号放大传至细胞核内，调节转录因子的活性，调控相应基因的表达，进而引起细胞反应的一类重要信号通路，尤其在免疫系统细胞内发挥重要作用。mapk级联由3种激酶组成，分别为mapk激酶(map3ks或mekk)、mapk激酶(map2ks)和蛋白激酶(mapks)，它们通过蛋白磷酸化构成了一个连续的激活途径。mapk通路有3个不同的亚组：细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，erk)，c-jun n端激酶(c-jun n-terminal kinase，jnk)和p38通路。其中，他克莫司能够抑制p38和jnk信号传导，通过阻断p38和jnk通路可以阻止il-2等炎性基因的表达，从而发挥免疫抑制作用。研究表明，tac可以抑制map3k水平上游信号通路。根据文献报道和ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)序列数据，筛选出11个jnk和p38信号通路中map3k水平的基因，即mekk1、mekk2、mekk4、mlk1、mlk3、ask1、tao1、tao2、tpl2、tak1和zak1。与这些基因相关的遗传变异可能引起他克莫司药效的改变，检测他克莫司mapk信号通路基因的遗传变异对预测他克莫司药物反应具有重要的临床意义。
5.运行haploview 4.2软件(version 4.2，broad institute,cambridge,ma,usa)，在hapmap格式框(hapmap format)读取北京汉族人(han chinese in beijing，china，chb)数据。设置最小等位基因频率(minor allele frequency，maf)的最小值为0.1，重新判分(rescore markers)后，运行tagger工具，根据snp之间r2》0.8的原则选择标签单核苷酸多态性(tag-snps)。
6.药物在体内最终效应的发挥，受到多个环节的影响，包括药动学和药效学环节。而
no.:120的引物。
20.进一步地，步骤1中的pcr反应所采用的反应程序为：94℃3min；94℃30sec，56℃25sec，72℃30sec，40个循环；72℃3min。
21.进一步地，步骤2中的sap反应程序为：37℃40min，85℃5min。
22.进一步地，步骤2中的单碱基延伸反应条件为：94℃30sec；94℃5sec，52℃5sec，80℃5sec，40个循环；72℃3min。
23.进一步地，步骤3中纯化单碱基延伸反应产物的具体步骤为：
24.(1)取树脂在树脂刮板上均匀覆盖，放置20min；
25.(2)将步骤2中反应结束的孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μl去离子水，倒置在树脂板上面，然后反置将树脂板扣在孔板上，敲击使树脂落入孔板，封膜；
26.(3)翻转孔板20min，3500rpm、离心5min。
27.进一步地，上述单碱基延伸反应产物的序列分别为seq id no.:121～180。
28.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
29.本发明提供的方法操作简便、无需序列特异性探针，一张芯片可对384个样本进行多重检测，每个体系最多可实现40重反应，同时检测40个snp位点，通量可根据客户要求进行个性化调整，高通量，适用范围广，几十到成千上万个样本，同时检测几十到成百上千个位点；无需荧光标记，仅需合成普通引物，单个分析成本低；高灵活度，一张芯片上样本和位点检测匹配可随意选择；分析所需样本量少(10ng)，灵敏度高，检测精度高，snp检测准确率可达99.9％，为解释临床他克莫司药效的个体差异提供重要依据，指导他克莫司的临床个体化给药。
附图说明
30.图1是本发明一实施例中mlk1基因rs8006424位点aa型分型图；
31.图2是本发明一实施例中mlk1基因rs8006424位点ag型分型图；
32.图3是本发明一实施例中mlk1基因rs8006424位点gg型分型图。
具体实施方式
33.本发明提供了一种同时测定人他克莫司作用靶点——mapk信号通路的基因多态性的方法，包括如下步骤：
34.1、人全血基因组dna提取
35.用dna提取试剂盒提取全血基因组dna，并调整浓度为10-100ng/μl。
36.2、多重pcr反应
37.1)查找目的基因序列，针对突变位点，设计并合成pcr引物。
38.2)根据已抽提样品编制384孔反应表，注明每孔对应的dna样品的编号，所用引物。
39.3)按表在384孔板各孔中分别加入1μl dna模板，贴膜，2000rpm/10秒离心后备用。
40.4)按下表配制pcr反应液，每个反应体系(包括模板dna和pcr反应液)的总体积是5μl：
[0041][0042]
注：以上384孔反应液有4％过量。
[0043]
5)取一排12联管，每孔加入配置好的pcr反应液133μl，短暂离心后备用。
[0044]
6)用10μl排枪取12联管中pcr反应液4μl，加入已有1μl dna的384孔板中，使各孔终体积为5μl。
[0045]
7)将装有5μl反应液的384孔板短暂离心后放入pcr仪，运行pcr反应程序：94℃3min，40个循环(94℃30sec，56℃25sec，72℃30sec)，72℃3min。
[0046]
8)pcr反应程序结束后，将384孔板短暂离心后备用，可在4℃保存。
[0047]
3、sap处理
[0048]
1)配制sap反应液
[0049]
按以下表次序配制sap反应液
[0050][0051]
注：以上384孔反应液有4％过量。
[0052]
2)取一排12联管，将sap反应液以每孔66μl分装，短暂离心后，用10μl排枪分装于384孔pcr反应板，每孔加2μl，封膜、离心。
[0053]
3)将已加入sap反应液的384孔板放入pcr仪中，运行sap反应程序：37℃40min，85℃5min。
[0054]
4)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，可在4℃保存。
[0055]
4、延伸反应
[0056]
1)配制iplex反应试剂
[0057][0058]
注：以上384孔反应液有4％过量。
[0059]
2)取一排12联管，将iplex反应液以每孔66μl分装，短暂离心后，用10μl排枪分装于384孔pcr反应板，每孔加2μl，封膜、离心。将已加入iplex反应液的384孔板放入pcr仪中，运行延伸反应条件为：94℃30sec，40个循环(94℃5sec，52℃5sec，80℃5sec)，72℃3min。
[0060]
3)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，可在4℃保存。
[0061]
5、产物纯化
[0062]
1)取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min。
[0063]
2)将反应结束的384孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μl去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜。
[0064]
3)以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20min，3500rpm、5min离心后备用。
[0065]
6、质谱检测
[0066]
1)nanodispenser spectrochip芯片点样
[0067]
将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的massarray spectrochip芯片。
[0068]
2)massarray analyzer compact质谱检测
[0069]
将样品转移到spectrochip芯片后，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析。
[0070]
3)typer软件分析实验结果，获得分型数据。
[0071]
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0072]
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0073]
以下实施例中所用飞行质谱仪为massarraycompact system(sequenom公司)，型号pt009044。点样仪为massarray tm nanodispenser(samsung公司)。
[0074]
实施例1
[0075]
利用时间飞行质谱技术检测10例肝移植患者11个map3k基因共计60个snp位点的基因型，具体的步骤和结果如下：
[0076]
1、人全血基因组dna提取
[0077]
用dna提取试剂盒提取全血基因组dna，并调整浓度为10-100ng/μl。
[0078]
2、多重pcr反应
[0079]
1)查找目的基因序列，针对突变位点，设计并合成pcr引物。
[0080]
同时测定11个map3k基因的60个snp位点，设计的引物，见下表1。
[0081]
表1 11个map3ks基因中60个snp位点的基因型检测所用引物
[0082]
[0083][0084]
注：w1、w2、w3分别代表3个多重pcr反应体系。
[0085]
2)根据已抽提样品编制384孔反应表，注明每孔对应的dna样品的编号，所用引物。
[0086]
3)按表在384孔板各孔中分别加入1μl dna模板，贴膜，2000rpm/10秒离心后备用。
[0087]
4)按下表配制pcr反应液，每个反应体系(包括模板dna和pcr反应液)的总体积是5μl：
[0088][0089][0090]
注：以上384孔反应液有4％过量。
[0091]
分为3个反应体系进行多重pcr，具体分组见表1。
[0092]
5)取一排12联管，每孔加入配置好的pcr反应液133μl，短暂离心后备用。
[0093]
6)用10μl排枪取12联管中pcr反应液4μl，加入已有1μl dna的384孔板中，使各孔终体积为5μl。
[0094]
7)将装有5μl反应液的384孔板短暂离心后放入pcr仪，pcr反应程序为：94℃3min，40个循环(94℃30sec，56℃25sec，72℃30sec)，72℃3min。
[0095]
8)pcr反应程序结束后，将384孔板短暂离心后备用，可在4℃保存。
[0096]
3、sap处理
[0097]
1)配制sap反应液
[0098][0099]
注：以上384孔反应液有4％过量。
[0100]
2)取一排12联管，将sap反应液以每孔66μl分装，短暂离心后，用10μl排枪分装于384孔pcr反应板，每孔加2μl，封膜、离心。
[0101]
3)将已加入sap反应液的384孔板放入pcr仪中，运行反应程序：37℃40min，85℃5min。
[0102]
4)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，可在4℃保存。
[0103]
4、延伸反应
[0104]
1)配制iplex反应试剂
[0105][0106][0107]
注：以上384孔反应液有4％过量。
[0108]
2)取一排12联管，将iplex反应液以每孔66μl分装，短暂离心后，用10μl排枪分装于384孔pcr反应板，每孔加2μl，封膜、离心。将已加入iplex反应液的384孔板放入pcr仪中，运行反应程序：94℃30sec，40个循环(94℃5sec，52℃5sec，80℃5sec)，72℃3min。
[0109]
3)反应结束，将384孔板取出短暂离心备用，可在4℃保存。各位点单碱基延伸产物序列分别对应seq id no.:121～180。
[0110]
5、产物纯化
[0111]
1)取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min。
[0112]
2)将反应结束的384孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μl去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜。
[0113]
3)以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20min，3500rpm、5min离心后备用。
[0114]
6、质谱检测
[0115]
1)nanodispenserspectrochip芯片点样
[0116]
将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的massarrayspectrochip芯片。
[0117]
2)massarray analyzer compact质谱检测
[0118]
将样品转移到spectrochip芯片后，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3-5秒，全自动分析，以mlk1基因rs8006424位点为例，其分型图如图1-3。
[0119]
3)typer软件分析实验结果，获得分型数据。
[0120]
10例肝移植患者中，11个map3k基因的60个snp位点的基因型检测结果见下表2。
[0121]
表2 10例肝移植患者11个map3ks基因中60个snp位点的基因型检测结果
[0122]
[0123]
[0124][0125]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。