一种新疆陆地棉品种指纹图谱的构建方法

1.本发明属于作物分子鉴定技术领域，具体涉及一种新疆陆地棉品种指纹图谱的构建方法。


背景技术：

2.由于分子生物学技术的发展，利用分子标记技术构建作物品种dna指纹图谱具有快速简便、检测准确的优点，已成为品种间鉴别、种子纯度检测的重要技术工具。如于1991年创立的ssr，相比于rflp、rapd和aflp，在dna指纹鉴定上具有很大的优势，多态性高，覆盖全基因组且数量多，已成为国际植物品种权保护组织进行dus测试选用的分子标记，已被广泛用于主要审定农作物水稻、小麦、大豆、玉米的指纹图谱数据库构建。
3.但是将其应用到棉花上时，尤其是在棉花dna指纹图谱构建技术中，pcr 扩增产物的分离与特异性检测是最关键的也是最难的一项。目前，在棉花dna 指纹图谱的构建过程中，pcr扩增产物的分离主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，存在费时费力，不能检测出特异性目标条带大小，难以满足大规模引物、多批次棉花品种的鉴定与比较。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新疆陆地棉品种指纹图谱的构建方法，基于毛细管电泳对棉花品种进行了ssr标记的筛选，实现数据在不同实验室之间整合和自动化的需求，弥补ssr分子标记技术的局限，填补聚丙烯酰胺凝胶电泳的不足；并且可用于大样本处理，处理精度高。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.一种新疆陆地棉品种指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：从已知的定位在染色体上的棉花ssr引物中筛选核心引物，利用所述核心引物对新疆审定陆地棉品种进行pcr扩增，扩增产物进行全自动毛细管电泳，得分子指纹图谱。
7.优选的，所述核心引物的筛选包括多态性标记的筛选和标记遗传多样性的筛选。
8.优选的，所述标记遗传多样性的筛选包括利用位点多态性信息含量进行筛选。
9.优选的，所述核心引物包括73对，分别为：hau3193、nau3736b、muss422a、 nbri_hq526730、nbri_hq527566、mon_cgr5007、mon_shin-1481、 mon_shin-1584、nau3419c、hau0875、hau2588、nbri_hq527820、 ck988221-pr-ss、nau7182、hau3371、gh107、bnl2865、mon_cgr5732、 hau1952b、mon_dpl0024、hau1496、mon_dpl0375c、dpl0238、mon_dpl0811b、mon_shin-1585、hau-snp113、nau6734、 mon_shin-1494b、bnl3031、nau5323、hau-snp085、mon_shin-0337a、 mghes31、mon_dpl0010、mon_cgr6012、mon_cgr6812、bnl2449、 hau4748、mon_dpl0521、mon_dpl0502、nau4022、nau3913、hau3071a、 nau3346b、nau5172、nau2985、nau3433、nau7049、hau2481、hau4022、 nau3827、mon_dpl0893、hau4483、nau2126、hau2846、bnl3043、 hau1968a、nau6997、mon_dpl0504a、ccri596a、dpl0062、hau2770、 hau0938、gh330、bnl2535b、ccri303、mon_cgr5447、nau2240、nau2631、 nau2713a、nau3298、nau3774
和nau4089。
10.优选的，新疆审定陆地棉品种包括新陆早系列棉花品种和新陆中系列棉花品种。
11.优选的，所述pcr扩增的体系以10μl计，包括：dna模板2.50μl、正向引物0.16μl、反向引物0.16μl、dntp 0.25μl、taqbuffer 1.00μl、mgcl20.80μl、 taq酶0.16μl和余量的ddh2o。
12.优选的，所述pcr扩增的程序包括：94℃预变性3min；94℃变性50sec， 58℃退火45sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。
13.优选的，所述核心引物在染色体上的距离分布为0～238.658cm，经所述pcr 扩增出的多态性条带大小介于75～400bp之间。
14.优选的，根据所述pcr扩增后的扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，对每对引物生成的不同的多态性做标记，计算位点多态性信息含量，根据每对引物在不同材料的基因型不同，构建dna分子指纹图谱。
15.本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的新疆陆地棉品种指纹图谱在品种鉴定中的应用。
16.有益效果：本发明提供了一种新疆陆地棉品种指纹图谱的构建方法，基于毛细管电泳对新疆审定的棉花陆地棉品种进行了ssr标记的筛选，能实现数据在不同实验室之间整合和自动化的需求，弥补了ssr分子标记技术的局限，填补了聚丙烯酰胺凝胶电泳的不足；毛细管电泳不需要经过染色、显影等复杂过程进行样品基因型分析，节省时间和利于大样本处理，便于品种真实性及纯度检测上的应用；毛细管电泳检测方法，依据待检品种目标峰的位置，与同一毛细管泳道的内标比较，通过荧光线直接读出目标dna特异目标条带大小，精确到1bp。本发明实施例中，基于毛细管电泳分别对2个系列新疆棉花陆地棉品种构建了 ssr分子指纹图谱，由于毛细管电泳扩增产物读取目标谱带能精确到1bp，所以对于品种在某一引物具有唯一特定谱带时，就可以鉴别该品种与其它品种，在进行品种dna指纹检测时，简便快捷且准确性高。
附图说明
17.图1为新陆早棉毛细管电泳dna指纹图谱；
18.图2为新陆中棉毛细管电泳dna指纹图谱。
具体实施方式
19.本发明提供了一种新疆陆地棉品种指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：从已知的定位在染色体上的棉花ssr引物中筛选核心引物，利用所述核心引物对新疆审定陆地棉品种进行pcr扩增，扩增产物进行全自动毛细管电泳，得分子指纹图谱。
20.本发明所述已知的定位在染色体上的棉花ssr引物包括华中农业大学已构建定位在染色体上包含5152个标记的遗传连锁图谱上的引物标记 (https://www.cottongen.org/data/download)。本发明优选对上述引物进行筛选，包括多态性标记的筛选和标记遗传多样性的筛选，其中多态性标记的筛选优选包括对选定的8份核心棉花品种(参见表1)基于毛细管电泳和100bp以上多态性条带读取，初步筛选出陆地棉有多态性标记436对；而后通过选择多态性高、稳定性好、定位在棉花26条染色体上且分布均匀的标
记引物225对，利用筛到的 225对引物在新疆陆地棉品种进行pcr扩增，检测到多种多态性基因型位点，通过计算标记间的pic值(位点多态性信息含量，polymorphism informationcontent)与数据分析，筛选多态性高，有效性好，标记的等位变异大，多态性指数高，有利于进行品种指纹图谱构建的核心ssr引物73对，分别为：hau3193、 nau3736b、muss422a、nbri_hq526730、nbri_hq527566、mon_cgr5007、 mon_shin-1481、mon_shin-1584、nau3419c、hau0875、hau2588、 nbri_hq527820、ck988221-pr-ss、nau7182、hau3371、gh107、bnl2865、 mon_cgr5732、hau1952b、mon_dpl0024、hau1496、mon_dpl0375c、 dpl0238、mon_dpl0811b、mon_shin-1585、hau-snp113、nau6734、 mon_shin-1494b、bnl3031、nau5323、hau-snp085、mon_shin-0337a、 mghes31、mon_dpl0010、mon_cgr6012、mon_cgr6812、bnl2449、 hau4748、mon_dpl0521、mon_dpl0502、nau4022、nau3913、hau3071a、 nau3346b、nau5172、nau2985、nau3433、nau7049、hau2481、hau4022、 nau3827、mon_dpl0893、hau4483、nau2126、hau2846、bnl3043、 hau1968a、nau6997、mon_dpl0504a、ccri596a、dpl0062、hau2770、 hau0938、gh330、bnl2535b、ccri303、mon_cgr5447、nau2240、nau2631、 nau2713a、nau3298、nau3774和nau4089。本发明优选利用软件powermakerv3.25计算所述pic值。
21.本发明所述新疆审定陆地棉品种优选包括新陆早系列棉花品种和新陆中系列棉花品种。本发明实施例中优选分别对70份新陆早品种和80份新陆中品种构建指纹图谱。
22.表1 8份代表新疆陆地棉品种遗传多样性的种质
[0023][0024]
表2新疆棉花品种筛选的ssr标记信息
[0025][0026]
表3 73对ssr标记在240份新疆棉花品种中的引物多态性信息
[0027]
[0028]
[0029][0030]
表4新陆早棉花品种信息
[0031]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]
[0037]
[0038][0039]
表5新陆中棉花品种信息
[0040]
[0041]
[0042]
[0043]
[0044]
[0045][0046]
本发明所述pcr扩增的体系以10μl计，优选包括：dna模板(10ng/μl) 2.50μl、正向引物(25μm)0.16μl、反向引物(25μm)0.16μl、dntp(10mm) 0.25μl、taq buffer(10
×
)1.00μl、mgcl
2 0.80μl、taq酶(5u/μl)0.16μl和余量的ddh2o。本发明所述pcr扩增的程序，优选包括：94℃预变性3min；94℃变性50sec，58℃退火45sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。本发明对所述dna模板的提取方法并没有特殊限定，优选参考白静的方法进行提取(白静.杂交棉品种ssr核心引物的筛选与真实性和纯度鉴定[m].华中农业大学,2011,45
–
50.)。经测定，所述核心引物在染色体上的距离分布为0～238.658cm，经所述pcr扩增出的多态性条带大小介于75～400bp之间。
[0047]
本发明优选将所述扩增产物在仪器fragment analyzer(fa)和zero agarosegel(zag)上进行全自动毛细管电泳45min，然后优选根据所述pcr扩增后的扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，对每对引物生成的不同的多态性做标记，计算位点多态性信息含量，根据每对引物在不同材料的基因型不同，构建dna分子指纹图谱。
[0048]
本发明在得到所述dna分子指纹图谱后，优选还包括验证上述构建的分子指纹图谱的可靠性与实用性。本发明在进行可靠性验证时，优选利用计算ssr 分子指纹图谱的置信概率、重复ssr指纹图谱核心ssr引物扫描品种，基于构建的分子指纹图谱初级数据库选择3份随机区试材料检测真实性与纯度。为了检验基于毛细管电泳构建的2份ssr分子指纹
图谱的重复性高低，本发明优选根据构建的ssr分子指纹图谱所用的ssr核心引物再一次筛选分析各个系列棉花品种差异性与多态性。为了检验基于毛细管电泳构建的4份ssr分子指纹图谱的重复性高低，本发明又根据构建的ssr分子指纹图谱所用的ssr核心引物再一次筛选分析各个系列棉花品种差异性与多态性。通过重复性实验可以发现，本发明基于毛细管电泳构建的ssr分子指纹图谱的可靠性高，有利于后续的品种鉴别与纯度鉴定。
[0049]
在本发明实施例中，对73对ssr核心引物对70份新陆早品种进行指纹分析。其中18份新陆早品种具有特异引物：xinluzao29、xinluzao8、xinluzao47、 xinluzao58分别具有3、2、2、2对特异引物，其余12个品种(xinluzao1、xinluzao9、 xinluzao22、xinluzao24、xinluzao57、xinluzao59、xinluzao61、xinluzao63、 xinluzao64、xinluzao65、xinluzao83、xinluzao84)具有一对特异引物。采用42 对引物组成的组合引物对52份新陆早棉花品种进行区分，45份棉花品种只需2 对引物的组合就可以区分出来，7份棉花品种(xinluzao3、xinluzao15、xinluzao17、 xinluzao18、xinluzao18、xinluzao39、xinluzao54)需要3对引物组合才能将其与其它品种区别开来。因此，结合18份新陆早品种的特征性引物和52份新陆早品种的组合引物，最少可以选用52对引物(bnl2449、bnl2535b、bnl3031、 bnl3043、ccri596a、ck988221-pr-ss、dpl0238、gh330、hau0875、hau0938、 hau1496、hau1952b、hau1968a、hau2481、hau2770、hau2846、hau3071a、 hau3193、hau4483、hau4748、hau-snp113、mghes31、mon_cgr5447、 mon_cgr5732、mon_cgr6012、mon_dpl0024、mon_dpl0375c、 mon_dpl0502、mon_dpl0811b、mon_shin-1481、mon_shin-1494b、 mon_shin-1584、mon_shin-1585、muss422a、nau2126、nau2240、 nau2631、nau2713a、nau3298、nau3346b、nau3419c、nau3433、nau3736b、 nau3913、nau4022、nau4089、nau5172、nau5323、nau6997、nau7182、 nbri_hq526730和nbri_hq527820)构建出70份新陆早品种的详细分子指纹图谱。52对引物分布在23条染色体上，引物在染色体上的距离分布在0～238.658 cm，扩增出的多态性条带大小介于75～400bp之间。
[0050]
本发明实施例中，在构建新陆中系列棉花品种指纹图谱时，采用73对核心 ssr引物对80份新陆中品种进行指纹分析，15份新陆中棉花品种具有特异引物，其中xinluzhong66具有15对特异引物，xinluzhong41具有6对特异性引物， xinluzhong67、xinluzhong74、xinluzhong76和xinluzhong79具有2对特异引物， 9个新陆中棉花品种(xinluzhong5、xinluzhong8、xinluzhong15、xinluzhong37、 xinluzhong50、xinluzhong55、xinluzhong62、xinluzhong78、xinluzhong86)只有1个特异引物。80份新陆中棉花品种中的15份新陆中棉花品种可以用特异引物一次性区分开，其余65份新陆中棉花品种需要组合引物实现该品种区分其它品种。采用41对引物组成的组合引物对65份新陆中棉花品种进行区分，其中 xinluzhong16、xinluzhong45和xinluzhong49需要3对引物组合才能区分，其余 62个新陆中棉花品种只需要2对引物组合就可以区分开来。因此，结合15份新陆中品种的特征性引物和65份新陆中品种的组合引物，最少可以选用51对引物 (bnl2449、bnl2865、bnl3031、bnl3043、ccri303、ccri596a、dpl0238、 gh330、hau0875、hau0938、hau1952b、hau2588、hau2846、hau3071a、 hau3193、hau4022、hau4483、hau-snp085、mghes31、mon_cgr5007、 mon_cgr5447、mon_cgr5732、mon_cgr6012、mon_cgr6812、 mon_dpl0010、mon_dpl0024、mon_dpl0375c、mon_dpl0502、 mon_dpl0521、mon_dpl0893、mon_shin-1481、mon_shin-1494b、 mon_shin-1584、mon_shin-1585、muss422a、nau2631、
nau2985、 nau3298、nau3346b、nau3433、nau3736b、nau3774、nau3913、nau4022、 nau4089、nau5172、nau6997、nau7049、nbri_hq526730、nbri_hq527566 和nbri_hq527820)构建80份新陆中品种的详细分子指纹图谱。51对引物分布在21条染色体上，引物在染色体上的距离分布在0～238.658cm，扩增出的多态性条带大小介于75～400bp之间。
[0051]
本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的新疆陆地棉品种指纹图谱在品种鉴定中的应用。
[0052]
基于本发明所述指纹图谱，可对目前的新疆陆地棉品种进行鉴定，如在实施例中，进行特异性引物鉴定或组合引物鉴定。其中特异性引物鉴定包括：标记 hau1952b在70份新陆早品种扩增出的多态性条带：319bp、305bp、254bp和 244bp，在片段249bp可以一次性鉴别出xinluzao47、xinluzao59、xinluzao77，其根据0-1读带的特征指纹信息分别为1000、0000、1110；组合引物鉴定包括：在新陆中系列棉花品种中，xinluzhong87，xinluzhong41在引物mon_shin-1585 具有2条多态性条带254bp和278bp，xinluzhong87在引物hau3193扩增出的220bp处没有特异性，而xinluzhong41在引物hau3193扩增出的220bp处有特异性，同时利用这2对组合引物可以成功鉴别出xinluzhong87。
[0053]
表6构建70份新陆早棉花品种的特异性引物信息表
[0054]
[0055]
[0056]
[0057][0058]
表7构建80份新陆中棉花品种的特异引物信息表
[0059]
[0060]
[0061]
[0062]
[0063][0064]
下面结合实施例对本发明提供的一种新疆陆地棉品种指纹图谱的构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0065]
实施例1
[0066]
1、参照白静的方法进行棉花总dna提取；
[0067]
2、ssr扩增产物检测；
[0068]
ssr-pcr反应体系(10μl)：dna模板(10ng/μl)2.50μl、正向引物(25μm) 0.16μl、反向引物(25μm)0.16μl、dntp(10mm)0.25μl、taq buffer(10
×
) 1.00μl、mgcl
2 0.80μl、taq酶(5u/μl)0.16μl和余量的ddh2o。
[0069]
pcr扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性50sec，58℃退火45sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存10min
[0070]
3、扩增产物在仪器fragment analyzer(fa)和zero agarose gel(zag)上进行全自动毛细管电泳45分钟。
[0071]
4、数据统计：根据pcr扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，对每对引物生成的不同的多态性做标记。
[0072]
5、利用软件powermaker v3.25计算位点多态性信息含量(polymorphisminformation content,pic)。
[0073]
6、根据每对引物在不同材料的基因型不同，构建dna分子指纹图谱，根据吴渝生等(吴渝生,杨文鹏,郑用琏.3个玉米杂交种和亲本ssr指纹图谱的构建 [j].作物学报,2003(04):496-500.)的作物品种指纹图谱出现概率的计算公式1/2
n (2为同一迁移位点的有无关系，n为等位基因的数目，2n则为检测n个等位基因时涉及的所有可能的品种个数)计算本研究构建的ssr指纹图谱的置信概率。
[0074]
(1)新陆早系列棉花品种指纹图谱的构建；
[0075]
①
通过标记遗传多样性分析，确定了多态性高、有效性好、等位变异大以及多态性指数高的73对ssr核心引物对70份新陆早品种进行指纹分析。其中18 份新陆早品种具有特异引物：xinluzao29、xinluzao8、xinluzao47、xinluzao58 分别具有3、2、2、2对特异引物，其余12个品种(xinluzao1、xinluzao9、xinluzao22、xinluzao24、xinluzao57、xinluzao59、xinluzao61、xinluzao63、xinluzao64、 xinluzao65、xinluzao83、xinluzao84)具有一对特异引物。
[0076]
②
采用42对引物组成的组合引物对52份新陆早棉花品种进行区分，45份棉花品种只需2对引物的组合就可以区分出来，7份棉花品种(xinluzao3、 xinluzao15、xinluzao17、
xinluzao18、xinluzao18、xinluzao39、xinluzao54) 需要3对引物组合才能将其与其它品种区别开来。
[0077]
因此，结合18份新陆早品种的特征性引物和52份新陆早品种的组合引物，最少可以选用52对引物构建出70份新陆早品种的详细分子指纹图谱。52对引物分布在23条染色体上，引物在染色体上的距离分布在0～238.658cm，扩增出的多态性条带大小介于75～400bp之间。
[0078]
(2)新陆中系列棉花品种指纹图谱的构建；
[0079]
采用73对核心ssr引物对80份新陆中品种进行指纹分析，15份新陆中棉花品种具有特异引物，其中xinluzhong66具有15对特异引物，xinluzhong41具有6对特异性引物，xinluzhong67、xinluzhong74、xinluzhong76和xinluzhong79 具有2对特异引物，9个新陆中棉花品种(xinluzhong5、xinluzhong8、xinluzhong15、 xinluzhong37、xinluzhong50、xinluzhong55、xinluzhong62、xinluzhong78、 xinluzhong86)只有1个特异引物。
[0080]
80份新陆中棉花品种中的15份新陆中棉花品种可以用特异引物一次性区分开，其余65份新陆中棉花品种需要组合引物实现该品种区分其它品种。采用41 对引物组成的组合引物对65份新陆中棉花品种进行区分，其中xinluzhong16、 xinluzhong45和xinluzhong49需要3对引物组合才能区分，其余62个新陆中棉花品种只需要2对引物组合就可以区分开来。
[0081]
因此，结合15份新陆中品种的特征性引物和65份新陆中品种的组合引物，最少可以选用51对引物构建80份新陆中品种的详细分子指纹图谱。51对引物分布在21条染色体上，引物在染色体上的距离分布在0～238.658cm，扩增出的多态性条带大小介于75～400bp之间。
[0082]
实施例2
[0083]
(1)特异性引物鉴定
[0084]
标记hau1952b在70份新陆早品种扩增出的多态性条带：319bp、305bp、 254bp和244bp，在片段249bp可以一次性鉴别出xinluzao47、xinluzao59、 xinluzao77，其根据0-1读带的特征指纹信息分别为1000、0000、1110。
[0085]
(2)组合引物鉴定
[0086]
在新陆中系列棉花品种中，xinluzhong87，xinluzhong41在引物 mon_shin-1585具有2条多态性条带254bp和278bp，xinluzhong87在引物hau3193扩增出的220bp处没有特异性，而xinluzhong41在引物hau3193扩增出的220bp处有特异性，同时利用这2对组合引物可以成功鉴别出 xinluzhong87。
[0087]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。