一种高抑菌性发酵豆粕及其制备方法与流程

1.本发明涉及发酵饲料技术领域，具体涉及一种高抑菌性发酵豆粕及其制备方法。


背景技术：

2.2020年7月1日起，中国正式步入饲料后抗生素新时代，掀开了全新的历史篇章。时至今日，禁抗近一年以来，行业内各种功能性添加剂产品组合替抗方案如雨后春笋般不断涌现，五花八门，让人眼花缭乱，并在应对饲料禁抗后所带来的挑战方面发挥了重要的作用。然而除了目前大家比较关注的功能性添加剂替抗方案以外，关于功能性原料的替抗研究近年来也是行业当下关注的热点领域之一。
3.那么究竟哪些原料种类可以被归结为功能性原料的范畴呢？对此，目前行业内还没有统一的科学认定标准，但是通过生物发酵技术来开发饲料原料被公认为是功能性饲料原料的重点研究领域。
4.目前我国生物饲料产品年总产值近500亿元，并在以年均20％的速度递增，发展潜力十分巨大；生物发酵饲料业已得到市场的高度认可，产品多样化，包括发酵原料、发酵伴侣、发酵浓缩料、发酵全价料等产品。
5.生物发酵原料是以微生物、复合酶为生物饲料发酵剂菌种，将饲料原料转化为微生物菌体蛋白、生物活性小肽类氨基酸、微生物活性益生菌、复合酶制剂为一体生物发酵饲料。该产品绿色环保，除了有大量活性益生菌和其代谢产物可以替代饲用抗生素，能有效增强动物机体免疫抗病能力，起到“替抗”作用；还可提高饲料利用率，扩大饲料原料使用范围，减轻我国饲粮压力。
6.豆粕是大豆经过提取油脂后得到的副产物，因其含有丰富的蛋白质(含量：43～48％)、较平衡的氨基酸、多种矿物质营养成分以及其他植物性饲料易缺的赖氨酸(含量：2.5～2.8％)，被广泛应用在饲料行业。在饲料药物添加剂禁止使用的背景下，亟需一种不含抗生素但具有高抑菌性的豆粕的制备方法，且其能保持发酵豆粕本身的营养价值。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种高抑菌性发酵豆粕及其制备方法。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明的第一方面是提供一种高抑菌性发酵豆粕的制备方法，采用枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、假丝酵母菌三种菌种对豆粕进行混合发酵制备该高抑菌性发酵豆粕。
10.进一步地，上述制备方法包括如下步骤：
11.步骤一，原料处理：选择优质豆粕，经高温灭菌处理，冷却后作为发酵原料；
12.步骤二，微生物菌种培养：对枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、假丝酵母菌进行活化培养和扩大培养制备相应的发酵菌种子液；
13.步骤三，混合发酵：将枯草芽孢杆菌发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、假丝酵
母菌发酵种子液接种于上述灭菌后的豆粕中，搅拌均匀，并调节发酵水分含量40％-50％，在自然ph条件下进行固态发酵，发酵时间48-72h，发酵温度控制38-40℃；
14.步骤四，干燥粉碎：将发酵完成的发酵豆粕湿料进行低温干燥，粉碎打包，得到安全稳定、高抑菌性的发酵豆粕成品。
15.进一步地，步骤一中的高温灭菌的条件为121℃、20min。
16.进一步地，上述枯草芽孢杆菌发酵种子液的制备过程如下：
17.(1)一级枯草芽孢杆菌种子液的制备：
18.培养基：葡萄糖2％w/v，氯化钠1％w/v，蛋白胨0.5％，酵母浸出物0.5％w/v；自然ph，高压灭菌锅121℃灭菌20min，冷却；
19.培养条件：按照接种量为0.1％w/v接入枯草芽孢杆菌菌粉，37℃、180r/min培养24h；
20.(2)枯草芽孢杆发酵种子液的制备：
21.培养基：葡萄糖1％w/v，蛋白胨1％w/v，硫酸镁1.25％w/v，硫酸锰0.05％w/v，氯化钠1％w/v，磷酸二氢钠0.2％w/v，磷酸氢二钠0.2％w/v；ph 7.0，121℃灭菌20min，冷却；
22.培养条件：按照接种量为5％v/v一级凝结芽孢杆菌种子液，37℃、200r/min培养24h。
23.进一步地，上述植物乳杆菌发酵种子液的制备过程如下：
24.(1)一级植物乳杆菌种子液的制备：
25.培养基：蛋白胨1.5％w/v，牛肉膏1.5％w/v，葡萄糖2％w/v，酵母膏0.75％w/v，柠檬酸铵0.2％w/v，磷酸氢二钾0.2％，无水乙酸钠0.75％w/v，硫酸镁0.03％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温80 0.1％v/v；ph 7.0，121℃灭菌20min，冷却；
26.培养条件：37℃静置培养18h；
27.(2)二级植物乳杆菌种子液的制备：
28.培养基：蛋白胨1.5％w/v，牛肉膏1.5％w/v，葡萄糖2％w/v，酵母膏0.75％w/v，柠檬酸铵0.2％w/v，磷酸氢二钾0.2％，无水乙酸钠0.75％w/v，硫酸镁0.03％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温80 0.1％v/v；ph 7.0，121℃灭菌20min，冷却；
29.培养条件：按照接种量为5％v/v接种一级植物乳杆菌种子液，37℃静置培养24h；
30.(3)植物乳杆菌发酵种子液的制备：
31.培养基：蛋白胨1.5％w/v，牛肉膏1.5％w/v，葡萄糖2％w/v，酵母膏0.75％w/v，柠檬酸铵0.2％w/v，磷酸氢二钾0.2％，无水乙酸钠0.75％w/v，硫酸镁0.03％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温80 0.1％v/v；ph 7.0，121℃灭菌20min，冷却；
32.培养条件：按照接种量为5％v/v接种二级植物乳杆菌种子液，37℃静置培养24h。
33.进一步地，上述假丝酵母发酵种子液的制备过程如下：
34.(1)一级假丝酵母种子液的制备：
35.培养基：葡萄糖3％w/v，酵母膏1％w/v，蛋白胨1％w/v；ph 7.0，121℃灭菌20min，冷却；
36.培养条件：28-30℃、100r/min培养18h；
37.(2)二级假丝酵母种子液的制备：
38.培养基：葡萄糖3％w/v，酵母膏1％w/v，蛋白胨1％w/v；ph 7.0，121℃灭菌20min，
冷却；
39.培养条件：按5％v/v接种量接入一级假丝酵母种子液，28-30℃、100r/min培养18h；
40.(3)假丝酵母固体发酵种子液的制备：
41.培养基：葡萄糖3％w/v，酵母膏1％w/v，蛋白胨1％w/v，ph 7.0，121℃灭菌20min，冷却；
42.培养条件：按5％v/v接种量接入二级假丝酵母种子液，28-30℃、100r/min培养18h。
43.进一步地，上述步骤三中枯草芽孢杆菌发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、假丝酵母菌发酵种子液的接种量的比例为5:1:1。
44.进一步地，上述步骤三中枯草芽孢杆菌发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、假丝酵母菌发酵种子液的接种量分别为5％、1％、1％或10％、2％、2％。
45.本发明的第二方面是提供上述制备方法制备的高抑菌性发酵豆粕。
46.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
47.本发明提供的高抑菌性发酵豆粕的制备方法，采用枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、假丝酵母菌三种菌种混合发酵后的豆粕，营养成分及饲料品质显著提高，还能在完全避免添加抗生素的同时，提高饲料利用率，增强动物机体免疫力，提高动物的健康水平和生产性能。
附图说明
48.图1显示了本发明一实施例中高抑菌性发酵豆粕的抑菌性能。
具体实施方式
49.本发明提供了一种高抑菌性发酵豆粕及其制备方法，采用枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、假丝酵母菌三种菌种对豆粕进行混合发酵制备该高抑菌性发酵豆粕。基于上述三种菌种的以下性能：
50.枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生丰富代谢产物，包括生物活性物质、b族维生素、多种酶类酶类，这些代谢产物能调节肠道菌群平衡、提高饲料利用率、增强动物机体免疫力，从而提高动物的健康水平和生产性能。
51.植物乳杆菌是乳酸菌的一种，此菌的活菌数比较高，能大量的产酸，使产品的ph值稳定不升高；而且由于此菌是厌氧细菌(兼性好氧)，在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一类具有广谱抑菌能力的多肽，饲料中含有丰富乳酸杆菌素既可以抑制病原微生物的传播，也可以防止沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌污染，同时还可以调节动物肠道菌群平衡，而且乳酸杆菌素对动物无毒副作用、热稳定性好、且无抗原性，还可以被消化道内的蛋白酶分解成可被动物利用的氨基酸，同时还能很好的抑制粪便和残饵料的腐烂，改善畜舍环境，降低养殖成本。
52.假丝酵母菌含有动物生长发育所必需的各种营养物质，包括20多种氨基酸、丰富的b族维生素，能促进动物的新陈代谢、改善饲料品质、提高动物采食性。
53.基于上述性能并通过实验筛选和验证发现，经枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、假丝酵
母菌三种菌种混合发酵后的豆粕，营养成分及饲料品质显著提高，该产品绿色环保，除了有大量活性益生菌和其代谢产物可以替代饲用抗生素，能有效增强动物机体免疫抗病能力，起到“替抗”作用外；还可提高饲料利用率，增强动物机体免疫力，提高动物的健康水平和生产性能。
54.下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
55.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
56.实施例1
57.本实施例提供一种高抑菌性发酵豆粕，其制备方法包括如下步骤：
58.步骤1：原料处理：
59.选择优质豆粕，经121℃高温灭菌处理20min，冷却后作为发酵原料。
60.步骤2，微生物菌种培养：
61.(1)枯草芽孢杆菌发酵种子液制备：
62.一级枯草芽孢杆菌种子液的制备：葡萄糖2％w/v，氯化钠1％w/v，蛋白胨0.5％，酵母浸出物0.5％w/v，自然ph，高压灭菌锅121℃灭菌20min，冷却后接入0.1％w/v市售枯草芽孢杆菌菌粉，37℃、180r/min培养24h。
63.枯草芽孢杆发酵菌种子液的制备：葡萄糖1％w/v，蛋白胨1％w/v，硫酸镁1.25％w/v，硫酸锰0.05％w/v，氯化钠1％w/v，磷酸二氢钠0.2％w/v，磷酸氢二钠0.2％w/v，ph7.0，121℃灭菌20min，冷却后接入5％v/v的一级凝结芽孢杆菌种子液，37℃、200r/min培养24h。
64.(2)植物乳杆菌发酵种子液的制备：
65.一级植物乳杆菌种子液的制备：蛋白胨1.5％w/v，牛肉膏1.5％w/v，葡萄糖2％w/v，酵母膏0.75％w/v，柠檬酸铵0.2％w/v，磷酸氢二钾0.2％，无水乙酸钠0.75％w/v，硫酸镁0.03％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温80 0.1％v/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却后，将低温保藏的植物乳杆菌菌种接种此培养基，37℃静置培养18h。
66.二级植物乳杆菌种子液的制备：蛋白胨1.5％w/v，牛肉膏1.5％w/v，葡萄糖2％w/v，酵母膏0.75％w/v，柠檬酸铵0.2％w/v，磷酸氢二钾0.2％，无水乙酸钠0.75％w/v，硫酸镁0.03％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温80 0.1％v/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却后，将接种量为5％v/v的一级植物乳杆菌种子液接种此培养基，37℃静置培养24h。
67.植物乳杆菌发酵种子液的制备：蛋白胨1.5％w/v，牛肉膏1.5％w/v，葡萄糖2％w/v，酵母膏0.75％w/v，柠檬酸铵0.2％w/v，磷酸氢二钾0.2％，无水乙酸钠0.75％w/v，硫酸镁0.03％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温80 0.1％v/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却后，将接种量为5％v/v的二级植物乳杆菌种子液接种此培养基，37℃静置培养24h。
68.(3)假丝酵母发酵种子液的制备：
69.一级假丝酵母种子液的制备：葡萄糖3％w/v，酵母膏1％w/v，蛋白胨1％w/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却后，接种低温保藏的假丝酵母菌菌种，28-30℃、100r/min培养18h；
70.二级假丝酵母种子液的制备：葡萄糖3％w/v，酵母膏1％w/v，蛋白胨1％w/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却至30℃，按5％v/v接种量接入一级假丝酵母种子液，30℃、100r/
min培养18h。
71.假丝酵母固体发酵种子液的制备：葡萄糖3％w/v，酵母膏1％w/v，蛋白胨1％w/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却至30℃，按5％v/v接种量接入一级假丝酵母种子液，30℃、100r/min培养18h。
72.步骤3，混合发酵：
73.将枯草芽孢杆菌发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、假丝酵母菌发酵种子液接种于上述灭菌后的豆粕中，接种量分别为5％、1％、1％，搅拌均匀，并调节发酵水分含量40％-50％，在自然ph条件下进行固态发酵，发酵时间48-72h，发酵温度控制38-40℃。
74.步骤4，干燥粉碎：
75.将发酵完成的发酵豆粕湿料进行低温干燥，粉碎打包，得到安全稳定，高抑菌性的发酵豆粕成品。
76.所得成品外观浅黄色，有浓郁发酵香味，水分含量9.01％，粗蛋白含量51.16％，相对小肽含量18.74％，滴定酸含量5.08％，定量抗原含量45.61mg/g，抑菌时效≥10h。
77.实施例2
78.本实施例提供一种高抑菌性发酵豆粕，其制备方法包括如下步骤：
79.步骤1：原料处理：
80.选择优质豆粕，经121℃高温灭菌处理20min，冷却后作为发酵原料。
81.步骤2，微生物菌种培养：
82.(1)枯草芽孢杆菌发酵种子液制备：
83.一级枯草芽孢杆菌种子液的制备：葡萄糖2％w/v，氯化钠1％w/v，蛋白胨0.5％，酵母浸出物0.5％w/v，自然ph，高压灭菌锅121℃灭菌20min，冷却后接入0.1％w/v市售枯草芽孢杆菌菌粉，37℃、180r/min培养24h。
84.枯草芽孢杆发酵菌种子液的制备：葡萄糖1％w/v，蛋白胨1％w/v，硫酸镁1.25％w/v，硫酸锰0.05％w/v，氯化钠1％w/v，磷酸二氢钠0.2％w/v，磷酸氢二钠0.2％w/v，ph 7.0，121℃灭菌20min，冷却后接入5％v/v的一级凝结芽孢杆菌种子液，37℃、200r/min培养24h。
85.(2)植物乳杆菌发酵种子液的制备：
86.一级植物乳杆菌种子液的制备：蛋白胨1.5％w/v，牛肉膏1.5％w/v，葡萄糖2％w/v，酵母膏0.75％w/v，柠檬酸铵0.2％w/v，磷酸氢二钾0.2％，无水乙酸钠0.75％w/v，硫酸镁0.03％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温80 0.1％v/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却后，将低温保藏的植物乳杆菌菌种接种此培养基，37℃静置培养18h。
87.二级植物乳杆菌种子液的制备：蛋白胨1.5％w/v，牛肉膏1.5％w/v，葡萄糖2％w/v，酵母膏0.75％w/v，柠檬酸铵0.2％w/v，磷酸氢二钾0.2％，无水乙酸钠0.75％w/v，硫酸镁0.03％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温80 0.1％v/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却后，将接种量为5％v/v的一级植物乳杆菌种子液接种此培养基，37℃静置培养24h。
88.植物乳杆菌发酵种子液的制备：蛋白胨1.5％w/v，牛肉膏1.5％w/v，葡萄糖2％w/v，酵母膏0.75％w/v，柠檬酸铵0.2％w/v，磷酸氢二钾0.2％，无水乙酸钠0.75％w/v，硫酸镁0.03％w/v，硫酸锰0.025％w/v，吐温80 0.1％v/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却后，将接种量为5％v/v的二级植物乳杆菌种子液接种此培养基，37℃静置培养24h。
89.(3)假丝酵母发酵种子液的制备：
90.一级假丝酵母种子液的制备：葡萄糖3％w/v，酵母膏1％w/v，蛋白胨1％w/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却后，接种低温保藏的假丝酵母菌菌种，28-30℃、100r/min培养18h。
91.二级假丝酵母种子液的制备：葡萄糖3％w/v，酵母膏1％w/v，蛋白胨1％w/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却至30℃，按5％v/v接种量接入一级假丝酵母种子液，28-30℃、100r/min培养18h。
92.假丝酵母固体发酵种子液的制备：葡萄糖3％w/v，酵母膏1％w/v，蛋白胨1％w/v，ph 7.0，121℃灭菌20min。冷却至30℃，按5％v/v接种量接入二级假丝酵母种子液，28-30℃、100r/min培养18h。
93.步骤3，混合发酵：
94.将枯草芽孢杆菌发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、假丝酵母菌发酵种子液接种于上述灭菌后的豆粕中，接种量分别为10％、2％、2％，搅拌均匀，并调节发酵水分含量40％-45％，在自然ph条件下进行固态发酵，发酵时间48-60h，发酵温度控制35-38℃。
95.步骤4，干燥粉碎：
96.将发酵完成的发酵豆粕湿料进行低温干燥，粉碎打包，得到安全稳定，高抑菌性的发酵豆粕成品。
97.所得成品外观浅黄色，有浓郁发酵香味，水分含量8.85％，粗蛋白含量51.59％，相对小肽含量25.13％，滴定酸含量6.64％，定量抗原含量37.20mg/g，抑菌时效≥12h。
98.实施例3
99.本实施例对实施例1和实施例2提供的高抑菌性发酵豆粕成品进行效果分析，得到的数据如下表1和图1。
100.表1高抑菌性发酵豆粕效果分析
[0101][0102]
注：常规发酵豆粕采用申请号为cn 201410375339.x的现有专利中的方法制备获得。
[0103]
由上述数据可知，实施例1和2提供的发酵豆粕完全能够达到发酵豆粕的产品要求，且因为菌种选择的不同，发酵过程中产生的小肽和乳酸也均高于市场上现有发酵豆粕产品，且由于使用了大量自主筛选的微生物菌种，发酵过程中产生了大量的活性益生菌和乳酸杆菌素，对动物肠道的有害菌起到了很好的抑制作用，能够替代抗生素，更有效的促进动物肠道的微生态健康。
[0104]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。