本申请要求2019年7月9日提交的美国临时申请号62/872,108的优先权权益，将其通过引用以其整体并入本文。电子提交的文本文件的说明将以电子方式随同提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入：计算机可读格式拷贝的序列表(文件名：TABI_007_01WO_SeqList_ST25.txt；记录日期2020年7月9日；文件大小147千字节)。
背景技术：
：距离第一种抗TNFalpha(TNFα)单克隆抗体(mAb)被批准用于减轻患有甲氨蝶呤难治性(methotrexate-refractive)类风湿性关节炎的患者的炎症，已经过去二十多年(Mantzaris2016，Moots,Curiale等人2018)。目前，存在几种被批准用于治疗炎性障碍的抗TNFα单克隆抗体。尽管在类风湿性关节炎、炎性肠病和多种自发性炎性障碍中取得成功，但仍然存在证据充分的与抗TNFα生物制剂的使用相关的风险(Taylor2010)。除了输注反应，还报告了其他严重不良事件，诸如血栓栓塞事件、狼疮样综合征、血管炎样事件和其他自身免疫问题(Jani,Dixon等人2018)。还看到增加的感染、增加的淋巴瘤和其他血液恶性肿瘤的风险、病毒引起的癌症、充血性心力衰竭和脱髓鞘事件。例如，在接受长期抗TNFα疗法的患者中通常报告结核病、水痘带状疱疹(varicella-zoster)(水痘(chickenpox))和带状疱疹(herpeszoster/shingles)的再激活。还发现了恶化的军团病的病例，以及包括新型流感和腺病毒感染在内的严重急性呼吸道病毒感染的报告。虽然并未完全理解或建立这些毒性中的一些的因果关系，但高度认可关于这些全身性安全问题，应谨慎使用抗TNFα生物制剂。鉴于现代个性化医学的时代，开发具有不同效力和安全性特征的新型药剂将允许这些疗法在患有不同炎性病症的患者中进行更好的剂量调整和最佳的使用。这尤其重要，因为目前的抗TNFα生物制剂很少带给患者完全和可持续的无疾病缓解，尽管有初始反应。事实上，有多达三分之一的通过抗TNFα生物制剂治疗的患者的反应不好(Owczarczyk-Saczonek,Owczarek等人2019)。虽然并不完全清楚确切的基本原理，但需要开发新型抗TNFα或组合抗细胞因子疗法以解决这些挑战，尤其是为了更好地鉴定和管理无反应者，开发阻断TNFR信号传导的选择性方面的更具选择性且有效的抗TNFα药剂，以及更好地递送这些药剂以保证TNFα在非患病组织中的正常生理效应。本公开文本解决了这种和其他需求。技术实现要素：本公开文本提供了具有特异性结合并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(IL-1β)二者的双重特异性的双特异性抗体及其抗原结合片段。可以通过本公开文本的双特异性抗体或其片段中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰的TNFα和IL-1β的活性包括(但不是通过限制的方式)中和其受体的TNFα和IL-1β激活等。作为非限制性例子，本公开文本提供了表4中列出的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体，所述双特异性抗体采用具有不同IgGFc的表2中列出的抗TNFα抗体和表3中列出的抗IL-1β抗体的组合。本公开文本提供了包含编码表4中列出的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体的多核苷酸序列的多核苷酸。本公开文本还提供了特异性结合肿瘤坏死因子α(TNFα)并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰肿瘤坏死因子α(TNFα)的至少一种活性的单克隆抗体及其抗原结合片段。可以通过本公开文本的抗体或其片段中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰的TNFα的活性包括(但不是通过限制的方式)中和其受体的TNFα激活等。作为非限制性例子，本公开文本提供了表2中列出的具有不同IgGFc的单克隆抗TNFα抗体。本公开文本还提供了包含编码表2中列出的单克隆抗TNFα抗体的多核苷酸序列的多核苷酸。本公开文本提供了特异性结合人白细胞介素1β(IL-1β)并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰人白细胞介素1β(IL-1β)的至少一种活性的单克隆抗体及其抗原结合片段。可以通过本公开文本的抗体或其片段中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰的IL-1β的活性包括(但不是通过限制的方式)中和其受体IL-1RI的IL-1β激活等。作为非限制性例子，本公开文本提供了表3中列出的具有不同IgGFc的单克隆抗IL-1β抗体。本公开文本还提供了包含编码表3中列出的单克隆抗IL-1β抗体的多核苷酸序列的多核苷酸。本公开文本还提供了一种通过受控的Fab臂交换从两种亲本抗体中产生对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体的方法，其中在一种亲本抗体上具有F405LFc突变并且在另一种亲本抗体上具有K409RFc突变。作为非限制性例子，本公开文本提供了一种通过受控的Fab臂交换产生表4中列出的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体采用具有不同IgGFc的表2中列出的抗TNFα抗体和表3中列出的抗IL-1β抗体的组合。本公开文本还提供了检测抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的形成的方法。所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体可以是全长IgG1、IgG2、IgG3、IgG4抗体，或者可以仅包含包括Fab、F(ab')2或scFv片段在内的抗原结合部分。可以修饰抗体骨架以影响功能，例如以消除残留的效应子功能。本公开文本还提供了当与野生型抗体相比时，具有延长的半衰期的抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体。通过将抗体的CH2和CH3结构域用选自以下的任一组突变工程化可以实现当与亲本野生型抗体相比时半衰期的延长：M252Y/S254T/T256E、M428L/N434S、T250Q/M428L、N434A和T307A/E380A/N434A，根据EU索引进行残基编号。本公开文本还提供了对在残基222-237(EU编号)之间或所述残基处切割野生型抗体的蛋白酶的蛋白水解降解具有增强的抗性的抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体。通过在缺失了G236的铰链区中用E233P/L234A/L235A突变工程化可以实现当与亲本野生型抗体相比时对蛋白水解降解的抗性，根据EU索引进行残基编号。本公开文本还提供了包含本公开文本的多核苷酸的载体。本公开文本还提供了包含本公开文本的载体的宿主细胞。本公开文本还提供了一种产生本公开文本的抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体的方法，所述方法包括在表达所述抗体的条件下培养本公开文本的宿主细胞，以及纯化所述抗体。本公开文本还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本公开文本的抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体以及药学上可接受的载体。本公开文本还提供了检测所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体的结合的方法。本公开文本还提供了通过所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体阻断TNFα和IL-1β与其受体的结合的方法。本公开文本还提供了通过所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体中和TNFα和IL-1β对其受体的功能活性的方法。本公开文本还提供了调节所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体的半衰期的方法。本公开文本还提供了调节所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体对蛋白水解降解的抗性的方法。本公开文本还提供了一种治疗自身免疫性/炎性疾病的方法。本公开文本还提供了本文提供的双特异性抗体在治疗所述自身免疫性/炎性疾病的方法中的用途；以及本文提供的双特异性抗体在制造用于所述自身免疫性/炎性疾病的药剂中的用途。受试者的示例性自身免疫性和/或炎性疾病包括但不限于以下：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、骨关节炎、强直性脊柱炎、白塞病、痛风、银屑病性关节炎、多发性硬化症、克罗恩结肠炎和炎性肠病，包括施用治疗有效量的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体。本公开文本还提供了一种治疗糖尿病、神经病、眼病、皮肤病的方法。本公开文本还提供了本文提供的双特异性抗体在治疗糖尿病、神经病、眼病和皮肤病的方法中的用途；以及本文提供的双特异性抗体在制造用于此类糖尿病、神经病、眼病和皮肤病的药剂中的用途。受试者的示例性疾病包括但不限于：II型糖尿病、帕金森病、年龄相关性黄斑变性、多神经病变、感觉周围神经病变、增生性糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变、压疮、暴发性1型糖尿病、视网膜血管炎、非感染性后葡萄膜炎、酒精中毒性神经病变，包括施用治疗有效量的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体。本公开文本还提供了一种治疗癌症的方法。本公开文本还提供了本文提供的双特异性抗体在治疗癌症的方法中的用途；以及本文提供的双特异性抗体在制造用于癌症的药剂中的用途。受试者的示例性癌症包括但不限于：多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、急性髓性白血病、女性乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和腹膜癌，包括施用治疗有效量的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体。调节TNFα和IL-1β二者可以改变肿瘤微环境，并且对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体和针对免疫肿瘤学靶标(诸如PD1)的抗体的组合使用可以提供治疗癌症的更有效的治疗功效。本公开文本还提供了一种治疗受试者的其他疾病和炎性病症的方法，所述其他疾病和炎性病症包括但不限于：慢性乙型肝炎、麻风病、萎缩性甲状腺炎、小肠肠病、坐骨神经病变和伤口愈合，所述方法包括施用治疗有效量的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体。本公开文本还提供了本文提供的双特异性抗体在治疗此类其他疾病和炎性病症的方法中的用途；以及本文提供的双特异性抗体在制造用于此类其他疾病和炎性障碍的药剂中的用途。附图说明图1：抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332的重链和轻链氨基酸序列。图2：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334的重链和轻链氨基酸序列。图3：抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332的重链和轻链氨基酸序列。图4：左侧两小图：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332的SDS-PAGE分析。右侧两小图：TAVO167127x14578、TAVO169127x14578、TAVO167128x14578和TAVO169128x14578(它们是用E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434SFc突变工程化并缺失了G236的抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体)以及相应的亲本抗体TAVO167127、TAVO169127、TAVO167128、TAVO169128和TAVO14578的SDS-PAGE分析。图5：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332与抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332(左列)以及抗TNFαIgG1抗体TAVO11934、抗IL-1βIgG1抗体TAVO12178与抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO11934x12178(右列)的阳离子交换色谱曲线。图6：展示与TNFα和IL-1β二者具有双重结合的抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332的形成的ELISA测定。图7：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332与人、恒河猴和小鼠TNFα的结合。图8：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332与人、恒河猴和小鼠IL-1β的结合。图9：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332中和人、恒河猴和小鼠TNFα对WEHI细胞的细胞毒性活性。图10：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332中和人、恒河猴和小鼠IL-1β驱动的IL-6从激活的MRC-5细胞中释放。图11：TNFα和IL-1β的HEK-Blue报告测定的原理的示意图(左侧小图)和在通过TNFα、IL-1β和TNFα/IL-1β刺激后报告基因表达的反应(右侧小图)。图12：在HEK-Blue报告测定中，抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332中和TNFα、IL-1β和TNFα/IL-1β驱动的报告基因激活。图13：在HEK-Blue报告测定中，抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x7378、TAVO11934x12032、TAVO11934x12178、TAVO14434x14578、TAVO167127x14578、TAVO169127x14578、TAVO167128x14578和TAVO169128x14578中和TNFα/IL-1β驱动的报告基因激活。图14：具有半衰期延长Fc突变的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12032和TAVO11934x12178以及缺乏此类突变的TAVO3334x5332和TAVO3334x7378在pH6.0下与小鼠FcRn的结合。图15：在通过IgG蛋白酶IdeZ和基质金属蛋白酶3(MMP3)消化后，具有蛋白水解降解抗性Fc突变的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO14434x14578及其亲本抗体TAVO14434和TAVO14578以及缺乏此类突变的TAVO3334x7378和TAVO11934x12178的重链完整性的SDS-PAGE分析。图16：在使用Tg1278/TNFKO小鼠的CAIA模型中，抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332在抑制关节炎表型方面的作用。左侧小图：测试化合物对实验Tg1278/TNFKO小鼠的关节炎得分的影响。到研究结束时，处理组中的平均关节炎疾病严重程度得分如下：PBS＝9.8±1.0，TAVO3334x53321mg/kg＝8.1±1.1，TAVO3334x53325mg/kg＝6.6±0.9，并且TAVO3334x533210mg/kg＝3.5±0.5；右侧小图：测试化合物对Tg1278/TNFKO小鼠的平均体重的影响。处理组中的平均体重如下：PBS＝21.7±0.2g，TAVO3334x53321mg/kg＝22.8±0.8g，TAVO3334x53325mg/kg＝23.5±0.06g，并且TAVO3334x533210mg/kg＝23.1±0.8g。误差条指示平均值的标准误差。图17A和图17B：通过将表达人TNFα或人IL-1β的NIH3T3细胞关节内注射到DBA-1小鼠的膝关节中诱导的膝关节肿胀。将1x104、5x104或25x104个NIH3T3:hTNFα细胞或NIH3T3:hIL-1β细胞注射到9-10周龄的雄性DBA-1小鼠的右膝中，同时为左膝注射相当数量的NIH3T3亲本细胞。在细胞注射后每天对两个膝关节进行卡尺测量，持续三天。对于NIH3T3:hTNFα细胞(图17A)或NIH3T3:hIL-1β细胞(图17B)，关节肿胀的变化表示为如由卡尺测量的右处理膝与左对照膝之间的平均差异。图18A、图18B和图18C：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178及其相关亲本抗体在正常小鼠中对膝关节肿胀的抑制。在第0天，在将炎性细胞混合物关节内注射到右膝或将对照细胞关节内注射到左膝前2小时，为雄性DBA-1小鼠腹膜内给药10mg/kg抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178、5mg/kg抗TNFα抗体TAVO11934和5mg/kg同种型对照抗体的混合物、5mg/kg抗IL-1β抗体TAVO12178和5mg/kg同种型对照抗体的混合物、或10mg/kg同种型对照抗体。炎性细胞由5x104个NIH3T3:hTNFα和5x104个NIH3T3:hIL-1β细胞组成，而对照细胞由10x104个NIH3T3细胞组成。在第-1天和注射后第1天、第2天、第3天对处理膝和对照膝进行卡尺测量。关节肿胀的变化表示为如由卡尺测量的右处理膝与左对照膝之间的平均差异(图18A)和3天内的平均AUC值(图18B)。也显示了动物到处理后第3天的体重变化(图18C)。结果表示平均值±平均值的标准误差，n＝3只小鼠/组。显著性指示为**，并且p值<0.005。具体实施方式定义将在本说明书中引用的所有出版物(包括但不限于披露文本和披露申请)仿佛完全阐述那样通过引用并入本文。应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在是限制性的。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在用于测试本公开文本的实践中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但本文描述了示例性的材料和方法。在描述和要求保护本公开文本时，将使用以下术语。除非上下文另有明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求中所用的，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，对“一种/一个细胞”的提及包括两种/个或更多种/个细胞的组合，等等。“抗体”意在是广义的，并且包括免疫球蛋白分子，包括单克隆抗体(包括鼠、人、人源化和嵌合单克隆抗体)、抗体片段、双特异性或多特异性抗体、二聚、四聚或多聚抗体、单链抗体、结构域抗体；以及免疫球蛋白分子的包含所需特异性的抗原结合位点的任何其他修饰构型。“全长抗体分子”由通过二硫键相互连接的两条重链(HC)和两种轻链(LC)以及其多聚体(例如IgM)组成。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3组成)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR区段构成，按照以下顺序从氨基至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。“互补决定区(CDR)”是抗体中的“抗原结合位点”。CDR可以使用多种术语定义：(i)互补决定区(CDR)(VH中的三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和VL中的三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3))是基于序列变异性(Wu等人(1970)JExpMed132:211-50；Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,马里兰州贝塞斯达,1991)。(ii)“高变区”、“HVR”或“HV”(VH中的三个(H1、H2、H3)和VL中的三个(L1、L2、L3))是指如通过Chothia和Lesk所定义的在结构上高度可变的抗体可变结构域的区域(Chothia等人(1987)JMolBiol196:901-17)。国际免疫遗传学(InternationalImMunoGeneTics，IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。在CDR、HV与IMGT描绘之间的对应关系描述于Lefranc等人(2003)DevCompImmunol27:55-77中。除非在本说明书中另有明确说明，否则如本文所用的术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括通过同上(Kabat、Chothia或IMGT)所述的任一种方法所定义的CDR。可以将免疫球蛋白根据重链恒定区氨基酸序列分配至五个主要类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步细分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以将任何脊椎动物物种的抗体轻链基于其恒定区的氨基酸序列分配至两种明显不同的类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))之一。“抗体片段”是指这样的免疫球蛋白分子部分，其保留重链和/或轻链抗原结合位点(诸如重链互补决定区(HCDR)1、2和3，轻链互补决定区(LCDR)1、2和3)、重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。抗体片段包括熟知的Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段以及由一个VH结构域组成的结构域抗体(dAb)。VH和VL结构域可以经由合成接头连接在一起以形成多种类型的单链抗体设计，其中VH/VL结构域可以分子内配对或在VH和VL结构域由单独的单链抗体构建体表达的情况下分子间配对以形成一价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双抗体；例如描述于国际披露公开号WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804和WO1992/01047中。“单克隆抗体”是指这样的抗体群体，其中在每条重链和每条轻链中具有单一氨基酸组成，除了可能的熟知的改变，诸如从抗体重链去除C末端赖氨酸。单克隆抗体通常结合一个抗原表位，除了双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可以在抗体群体内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，或者一价的、二价的或多价的。双特异性抗体包括在术语单克隆抗体内。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体或抗体片段。“分离的抗体”涵盖被分离至更高纯度的抗体，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的抗体。“人源化抗体”是指这样的抗体，其中抗原结合位点衍生自非人物种并且可变区框架衍生自人免疫球蛋白序列。人源化抗体可以包括在框架中的取代，使得框架可以不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。“人抗体”是指具有这样的重链和轻链可变区的抗体，其中框架和抗原结合位点二者均衍生自人来源的序列并且优化为当向人类受试者施用时具有最小的免疫反应。如果抗体含有恒定区或恒定区的一部分，则恒定区也衍生自人来源的序列。除非另有明确说明，否则在整个说明书中氨基酸残基在抗体恒定区中的编号是根据EU索引，如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,马里兰州贝塞斯达(1991)中所述。本文使用常规的单字母和三字母氨基酸密码，如表1所示。表1本文提供的多肽、核酸、融合蛋白和其他组合物可以涵盖与本文提供的氨基酸序列或DNA序列具有所述的百分比同一性的多肽、核酸、融合蛋白等。术语“同一性”是指如通过比对并且比较两种或更多种多肽分子或者两种或更多种核酸分子的序列所确定的所述序列之间的关系。“百分比同一性”、“百分比同源性”、“序列同一性”或“序列同源性”等意指在比较的分子中氨基酸之间或核苷酸之间的相同残基的百分比，并且基于所比较的最小的分子的尺寸计算。对于这些计算，优选地通过特定的数学模型或计算程序(即，“算法”)解决比对中的空位(如果有的话)。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括以下文献中所述的那些：ComputationalMolecularBiology,(Lesk,A.M.编辑),1988,纽约:OxfordUniversityPress；BiocomputingInformaticsandGenomeProjects,(Smith,D.W.编辑),1993,纽约:AcademicPress；ComputerAnalysisofSequenceData,第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑),1994,新泽西州:HumanaPress；vonHeinje,G.,1987,SequenceAnalysisinMolecularBiology,纽约:AcademicPress；SequenceAnalysisPrimer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑),1991,纽约:M.StocktonPress；以及Carillo等人,1988,SIAMJ.AppliedMath.48:1073。在计算百分比同一性时，通常以得到各序列间最大匹配的方式比对所比较的序列。哺乳动物IgG重链的恒定区域序列按顺序指定为CH1-铰链-CH2-CH3。IgG的“铰链”、“铰链区”或“铰链结构域”通常被定义为包括Glu216并且在人IgG1的Pro230处终止，根据EU索引；但是在功能上，链的柔性部分可以被认为包括称为上铰链区和下铰链区的另外的残基(诸如从Glu216至Gly237)，并且下铰链指的是Fc区的残基233至239，FcγR结合通常归因此处。其他IgG同种型的铰链区可以通过放置第一个和最后一个半胱氨酸残基从而形成重链间S-S键来与IgG1序列对齐。尽管如根据EU索引编号的边界可以略微变化，但CH1结构域与VH结构域相邻并且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端，并且包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基末端)恒定区，例如从约EU位置118-215。Fc结构域从氨基酸231延伸到氨基酸447；CH2结构域从约Ala231至Lys340或Gly341；并且CH3从约Gly341或Gln342至Lys447。CH1区的IgG重链恒定区的残基在Lys处终止。含Fc结构域的分子至少包含抗体恒定区的CH2和CH3结构域，并且因此至少包含IgG重链恒定区的从约Ala231至Lys447的区域。含Fc结构域的分子可以任选地包含至少部分铰链区。“表位”是指抗体特异性结合的抗原部分。表位通常由化学活性(诸如极性、非极性或疏水性)表面分组的部分(诸如氨基酸或多糖侧链)组成，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以由形成构象空间单元的连续和/或不连续的氨基酸构成。对于不连续的表位，通过蛋白质分子的折叠，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸在三维空间中近距离靠近。抗体“表位”取决于用于鉴定表位的方法。如本文所用的“前导序列”包括可以由哺乳动物细胞处理的任何信号肽，包括人B2M前导序列。此类序列是本领域熟知的。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸以及具有经修饰的肽骨架的多肽。所述术语还包括具有多肽的共翻译(例如，信号肽切割)和翻译后修饰的多肽，所述修饰例如像二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解切割等。此外，如本文所用，“多肽”是指包括对天然序列的修饰(诸如缺失、添加和取代(如应是本领人员已知的在本质上通常是保守的))的蛋白质，只要蛋白质维持所需活性即可。这些修饰可能是刻意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(诸如通过产生蛋白质的宿主的突变、或由于PCR扩增或其他重组DNA方法引起的错误)。如本文所用的描述核酸分子的术语“重组”意指基因组、cDNA、病毒、半合成和/或合成来源的多核苷酸，所述多核苷酸凭借其来源或操纵不与其在自然界中与之缔和的多核苷酸序列的全部或一部分缔和。如关于蛋白质或多肽所用的术语“重组”是指通过重组多核苷酸的表达产生的多肽。如关于宿主细胞或病毒所用的术语“重组”是指已经引入了重组多核苷酸的宿主细胞或病毒。在本文中也使用重组来指代关于这样的材料(例如，细胞、核酸、蛋白质或载体)，所述材料已经通过引入异源材料(例如，细胞、核酸、蛋白质或载体)进行修饰。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，包括核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。此术语仅指代分子的一级结构。“载体”是指能够在生物系统内被复制或可以在此类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有这样的元件(诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记)，其发挥功能以便于在利用能够复制载体的生物组分的生物系统(诸如细胞、病毒、动物、植物)和重构的生物系统中复制或维持这些多核苷酸。载体多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA分子、cDNA或这些的杂交体。“表达载体”是指这样的载体，其可以在生物系统或重构的生物系统中用于指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列编码的多肽的翻译。“价”是指指定数量的对抗原具有特异性的结合位点在分子中的存在。因此，术语“一价”、“二价”、“四价”和“六价”分别是指一个、两个、四个和六个对抗原具有特异性的结合位点在分子中的存在。如本文所用，关于核酸序列、蛋白质或多肽所用的术语“异源”意指这些分子不天然存在于衍生出异源核酸序列、蛋白质或多肽的细胞中。例如，编码插入不是人细胞的细胞中的人多肽的核酸序列是在该特定的背景下的异源核酸序列。然而，异源核酸可以衍生自不同的生物体或动物物种，此类核酸不需要衍生自异源的单独的生物体物种。例如，在一些情况下，合成的核酸序列或由其编码的多肽对于引入它的细胞可能是异源的，因为细胞先前不含合成的核酸。因此，合成的核酸序列或由其编码的多肽对人细胞可以被认为是异源的，例如，即使合成的核酸序列或由其编码的多肽的一种或多种组分最初衍生自人细胞。如本文所用，“宿主细胞”表示以单细胞实体培养的体内或体外真核细胞或来自多细胞生物体(例如，细胞系)的细胞，所述真核细胞可以被用作或已经被用作核酸(例如，包含编码本公开文本的多聚多肽的核苷酸序列的表达载体)的受体，并且包括已经由核酸进行遗传修饰的原始细胞的后代。应理解，由于天然、偶然或刻意突变，单个细胞的后代的形态或者基因组或总DNA互补体可能不一定与原始亲本完全相同。“重组宿主细胞”(也称为“遗传修饰的宿主细胞”)是已经引入异源核酸(例如，表达载体)的宿主细胞。例如，凭借将异源核酸(例如，对真核宿主细胞外源的外来核酸或通常在真核宿主细胞中不存在的重组核酸)引入合适的真核宿主细胞中来对遗传修饰的真核宿主细胞进行遗传修饰。“特异性结合(specificbinding)”或“特异性结合(specificallybinds)”或“结合”是指与其他抗原相比，抗体与特异性抗原以更大的亲和力结合。通常，当结合的平衡解离常数(KD)是约1×10-8M或更小，例如约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小或者约1×10-12M或更小，通常KD是与非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的KD的至少一百分之一时，抗体“特异性结合”。可以使用标准程序测量KD。如本文所有，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得所需的药理和/或生理作用。所述作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不利影响而言可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物(例如，人)的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患疾病但尚未被诊断为患有所述疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即遏止其发展；以及(c)缓解疾病，即导致疾病消退。在本文中可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于鼠(例如，大鼠、小鼠)、兔类动物(例如，兔)、非人灵长类动物、人、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊)等。“治疗有效量”或“有效量”是指当施用至哺乳动物或其他受试者用于治疗疾病时足以影响对于疾病的这种治疗的一种药剂的量或两种药机的合并量。“治疗有效量”将根据一种或多种药剂、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。在进一步描述本公开文本之前，应理解，本公开文本并不限于所描述的特定实施方案，因为此类实施方案当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在是限制性的，因为本公开文本的范围将仅受所附权利要求的限制。抗TNFα抗体由于其抗肿瘤细胞特性而最初发现的肿瘤坏死因子α(TNFα)后来已经被证明可介导炎症反应和调节免疫功能(Aggarwal2003)。TNFα由巨噬细胞、免疫细胞和粒细胞产生，并且在细胞表面上表达为膜蛋白，所述膜蛋白经由ADAM-17的蛋白水解切割而被迅速释放。可溶性TNFα的活性形式是经由两种受体TNFRI和TNFRII进行信号传导的同三聚体。虽然TNFα的正常功能是有益的，但不受控制的TNFα的过量产生可能导致慢性疾病(Feldmann,Brennan等人2004)。英夫利昔单抗(cA2)是由Centocor/Janssen开发的由人轻链和重链恒定结构域以及鼠轻链和重链可变结构域组成的嵌合抗体。已经证明英夫利昔单抗可以高特异性和亲和力结合TNFα，从而中和TNFα的生物功能。英夫利昔单抗已经完成临床试验，并且获得了克罗恩病(1998)、类风湿性关节炎(1999)、强直性脊柱炎(2004)、银屑病性关节炎(2005)、溃疡性结肠炎(2005)、斑块型银屑病(2006)的监管批准。特别地，在类风湿性关节炎中英夫利昔单抗的作用机制已经是证据充分的(Monaco,Nanchahal等人2015)。由Abbott/Abbvie开发的阿达木单抗(D2E7)是由通过噬菌体展示技术优化的人重链和轻链可变结构域组成的工程化的人单克隆抗体。阿达木单抗的作用机制与英夫利昔单抗非常类似(Kaymakcalan,Sakorafas等人2009)。从2002年开始，阿达木单抗已经被批准用于与英夫利昔单抗相同的适应症，外加多关节型幼年特发性关节炎、化脓性汗腺炎和葡萄膜炎。培赛利珠单抗(CDP-870)是由UCB开发的靶向TNFα的抗体片段。它是由与分别与人重链CH1和轻链恒定结构域附接的人可变框架序列相互拼接的鼠重链和轻链可变序列组成的人源化的Fab片段。附接聚乙二醇部分以延长分子的血清半衰期。非常像英夫利昔单抗和阿达木单抗，培赛利珠单抗结合TNFα并且中和TNFα的作用，然而它缺乏Fc结构域并且因此缺乏Fc依赖性延长的半衰期和潜在的细胞裂解。从2008年开始，培赛利珠单抗已经获得了克罗恩病、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎和斑块型银屑病的监管批准。JanssenBiotech开发了第四种抗TNFα戈利木单抗它是在人抗体转基因小鼠中产生的全人抗体(Shealy,Cai等人2010)。戈利木单抗具有与英夫利昔单抗、阿达木单抗和培赛利珠单抗类似的作用机制。戈利木单抗在2009年获得了类风湿性关节炎、银屑病性关节炎和强直性脊柱炎的初步监管批准，并且在2013年获得了溃疡性结肠炎的进一步批准。作为具有特异性结合并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(IL-1β)二者的双重特异性的双特异性抗体及其抗原结合片段的一部分，本文描述了特异性结合肿瘤坏死因子α(TNF-α)并且中和TNF-α对其受体的功能活性的人单克隆抗体和抗原结合片段。可以通过本公开文本的抗体或其片段中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰的TNFα的活性包括(但不是通过限制的方式)中和其受体的TNFα激活等。在一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段可以通过与直接参与TNFα的靶向活性的TNFα的表位结合来中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰TNFα的活性。在另一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段可以通过与不直接参与TNFα的靶向活性的TNFα的表位结合来中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰TNFα的活性，但是与其结合的抗体或片段在空间上或在构象上抑制、阻断、消除、降低或干扰TNFα的靶向活性。在又另一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段与不直接参与TNFα的靶向活性的TNFα的表位结合(即，非阻断抗体)，但是与其结合的抗体或片段导致TNFα的清除增强。作为非限制性例子，本公开文本提供了九个抗TNFα抗体重链可变结构域序列，指定为ADA-H、ADA-H1、ADA-H1X、ADA-H2、ADA-H2X、ADA-H3、ADA-H3X、ADAH4、ADAH4X，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、NO.2、NO.3、NO4、NO5、NO6、NO7、NO8、NO9所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含含有与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8或9具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域的抗TNFα抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了三个抗TNFα抗体轻链可变结构域序列，指定为ADA-L、ADA-L1、ADA-L2，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.10、NO.11、NO.12所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含含有与SEQIDNO:10、11或12具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域的抗TNFα抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了具有含F405L突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H的抗TNFα抗体重链序列，指定为EAC33，其中氨基酸序列如SEQIDNO.13所示。本公开文本还提供了具有含L234A、L235A、F405L、M428L、N434S突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H、ADA-H1、ADA-H1X、ADA-H2、ADA-H2X、ADA-H3、ADA-H3X、ADA-H4、ADA-H4X的九个抗TNFα抗体重链序列，分别指定为EAC119、EAC129、EAC130、EAC131、EAC132、EAC133、EAC134、EAC135、EAC136，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.14、NO.15、NO.16、NO17、NO18、NO19、NO20、NO21、NO22所示。本公开文本还提供了具有含E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434S突变并缺失了G236的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H、ADA-H1X、ADA-H2X、ADA-H3X、ADA-H4X的五个抗TNFα抗体重链序列，分别指定为EAC144、EAC166、EAC167、EAC168、EAC169，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.23、NO.24、NO.25、NO26、NO27所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的重链氨基酸序列的抗TNFα抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了基于轻链可变结构域ADA-L、ADA-L1、ADA-L2的抗TNFα抗体轻链序列，分别指定为EAC34、EAC127、EAC128，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.28、NO29、NO30所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:28、29或30具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的轻链氨基酸序列的抗TNFα抗体。作为非限制性例子，通过将上述抗TNFα抗体重链序列和抗TNFα抗体轻链序列配对，本公开文本提供了表2中列出的具有不同IgGFc的抗TNFα抗体，所述抗体采用不同重链可变结构域和不同轻链可变结构域的组合。表2.抗TNFα抗体抗IL-1β抗体IL-1β是充当感染和炎症期间外周免疫反应的介质的促炎细胞因子。IL-1β最初以前体肽(pro-IL-1β)的形式合成，所述前体肽被胱天蛋白酶-1以炎性体复合物形式切割，并且被分泌到细胞外间隙中。IL-1β可以由多种细胞类型释放。存在两种IL-1受体IL-1RI和IL-1RII。IL-1β通过受体IL-1RI对靶细胞发挥其作用。调节异常的IL-1β活性是自身免疫性疾病所特有的，并且可能由于细胞因子的异常增加或IL-1RI内源性拮抗剂的定性或定量缺陷而发生。IL-1β特别牵涉在几种自发性炎性疾病中。卡那单抗(Ilaris，ACZ885)是由Novartis开发的靶向白细胞介素1β的人单克隆抗体。其作用模式是基于IL-1β信号传导的中和。在2009年卡那单抗被批准用于治疗过冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)，并且随后在2016年被批准用于三种另外的罕见且严重的自发性炎性疾病(Gram2016)。吉伏珠单抗(Gevokizumab)(XOMA052)是由XOMA开发的另一种靶向IL-1β的单克隆抗体。声称吉伏珠单抗是调节性治疗抗体，其通过降低对其IL-1RI:IL-1RAcP信号传导复合物的亲和力来调节IL-1β生物活性(Issafras,Corbin等人2013)。近年来，已经发现IL-1β与动脉粥样硬化斑块发展的几个步骤以及其他心血管疾病改变形式相关(McCarty和Frishman2014)。假设这些炎性化学品可能阻止心脏从先前心脏病发作的损伤中康复。在2017年，卡那单抗的III期临床试验显示心脏病发作、中风和心血管疾病的合并死亡降低15％。此外，所述试验还显示了肺癌发病率和死亡率的显著降低。作为具有特异性结合并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(IL-1β)二者的双重特异性的双特异性抗体及其抗原结合片段的一部分，本文描述了特异性结合人白细胞介素1β(IL-1β)并且中和IL-1β对其受体IL-1RI的功能活性的新型人单克隆抗体和抗原结合片段。在一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段可以通过与直接参与IL-1β的靶向活性的IL-1β的表位结合来中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰IL-1β的活性。在另一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段可以通过与不直接参与IL-1β的靶向活性的IL-1β的表位结合来中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰IL-1β的活性，但是与其结合的抗体或片段在空间上或在构象上抑制、阻断、消除、降低或干扰IL-1β的靶向活性。在又另一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段与不直接参与IL-1β的靶向活性的IL-1β的表位结合(即，非阻断抗体)，但是与其结合的抗体或片段导致IL-1β的清除增强。作为非限制性例子，本公开文本提供了三个抗IL-1β抗体重链可变结构域序列，指定为Ab5H3、Ab8H1、Ab9H1，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.31、NO.32、NO.33所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含含有与SEQIDNO:31、32或33具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域的抗IL-1β抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了三个抗IL-1β抗体轻链可变结构域序列，指定为Ab5L、Ab8L3、Ab9L1，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.34、NO.35、NO.36所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含含有与SEQIDNO:34、35或36具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域的抗IL-1β抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了具有含K409R突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab5H3、Ab8H1、Ab9H1的三个抗IL-1β抗体重链序列，指定为EAC53、EAC73、EAC80，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.37、NO.38、NO.39所示。本公开文本还提供了具有含L234A、L235A、K409R、M428L、N434S突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab5H3和Ab8H1的两个抗IL-1β抗体重链序列，指定为EAC120和EAC121，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.40和NO.41所示。本公开文本还提供了具有含E233P、L234A、L235A、K409R、M428L、N434S突变并缺失了G236的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab8H1和Ab9H1的两个抗IL-1β抗体重链序列，指定为EAC145和EAC161，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.42和NO.43所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:37、38、39、40、41、42或43具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的重链氨基酸序列的抗IL-1β抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了基于轻链可变结构域Ab5L、Ab8L3、Ab9L1的三个抗IL-1β抗体轻链序列，指定为EAC32、EAC78、EAC83，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.44、NO.45、NO.46所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:44、45或46具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的轻链氨基酸序列的抗IL-1β抗体。作为非限制性例子，通过将上述抗IL-1β抗体重链序列和抗IL-1β抗体轻链序列配对，本公开文本提供了表3中列出的具有不同IgGFc的示例性抗IL-1β抗体，所述抗体采用不同重链可变结构域和不同轻链可变结构域的组合。表3.抗IL1β抗体本公开文本还提供了本文提供的抗IL1β和抗TNFα抗体的混合物。例如，本公开文本提供了包含任一种或多种本文提供的抗IL1β抗体与任一种或多种本文提供的抗TNFα抗体的组合物。例如，在实施方案中，本公开文本提供了包含含有重链可变结构域和轻链可变结构域的抗IL1β抗体或其片段以及对TNFα具有特异性的抗体或其片段的组合物，所述重链可变结构域包含与SEQIDNO:31、32或33具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含与SEQIDNO:34、35或36具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性或100％序列同一性的氨基酸序列。在实施方案中，本公开文本还提供了使用抗体的此类混合物的方法。抗TNFα和IL-1β双特异性抗体双特异性抗体是在制药行业的新发展，并且它们可以识别两种不同的靶标，在本质上通常是加性的或协同的(Labrijn,Janmaat等人2019)。这种双重特异性允许两种不同信号传导途径的同时抑制以及不同致病介质的双重靶向。这种方法可能会改善针对自身免疫性疾病以及其他炎性病症的治疗选择。双特异性抗体或片段可以具有几种构型。例如，双特异性抗体可以类似单个抗体(或抗体片段)，但是具有两个不同的抗原结合位点(可变区)，并且可以是二价的或一价的。多种双特异性抗体形式是普通技术人员已知的。双特异性抗体形式包括例如全IgG样双特异性抗体(诸如使用本文所述的受控的Fab臂交换技术产生的那些)、杵臼(knob-in-hole)抗体、抗体、具有一个Fc区和两个scFv部分的scFv2-Fc双特异性抗体(例如，ADAPTIRTM)、基于双特异性T细胞接合器(BiTE)的抗体(诸如BiTE/ScFv2)、基于双亲和重靶向抗体(DART)的双特异性抗体(包括具有或不具有Fc部分的DART结合区)、DNL-Fab3双特异性抗体、scFv-HAS-scFv双特异性抗体和DVD-Ig双特异性抗体。TNFα和IL-1β二者是充当感染和炎症期间外周免疫反应的介质的促炎细胞因子。然而，TNFα和IL-1β二者的过量产生与许多类型的医学问题的起始和进展相关，所述医学问题包括：自身免疫性/炎性疾病；糖尿病、神经病、眼病、皮肤病病症；多种类型的癌症；内分泌功能障碍；以及正常伤口愈合的破坏。因此，中和TNFα和IL-1β二者的活性可以为这些炎性疾病或由过量的TNFα和IL-1β引起的任何其他障碍提供治疗方法。本公开文本汇集了在特定细胞类型中可以提供双重TNFα和IL-1β细胞因子中和的新重新工程化的双重特异性的抗TNFα和IL-1β抗体。此外，应用于新型双特异性抗体的另外的抗体工程化经由对FcR的不同亲和力还提供了改变的体内半衰期、更好的安全性特征以及效应子功能。这为可能会具有不同需求的患有不同炎性病症的患者不仅提供了功效的协同作用，而且还提供了更好的剂量调整。因此，本公开文本提供了具有特异性结合并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(IL-1β)二者的双重特异性的双特异性抗体及其抗原结合片段。可以通过本公开文本的双特异性抗体或其片段中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰的TNFα和IL-1β的活性包括(但不是通过限制的方式)中和其受体的TNFα和IL-1β激活等。作为非限制性例子，本公开文本提供了由九个抗TNFα抗体重链可变结构域序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述九个抗TNFα抗体重链可变结构域序列指定为ADA-H、ADA-H1、ADA-H1X、ADA-H2、ADA-H2X、ADA-H3、ADA-H3X、ADAH4、ADAH4X，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、NO.2、NO.3、NO4、NO5、NO6、NO7、NO8、NO9所示。在实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合片段包含含有与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8或9具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的抗TNFα抗体重链可变结构域。作为非限制性例子，本公开文本提供了由三个抗TNFα抗体轻链可变结构域序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述三个抗TNFα抗体轻链可变结构域序列指定为ADA-L、ADA-L1、ADA-L2，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.10、NO.11、NO.12所示。在实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合片段包含含有与SEQIDNO:10、11或12具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的抗TNFα抗体轻链可变结构域。作为非限制性例子，本公开文本提供了由具有含F405L突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H的抗TNFα抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述抗TNFα抗体重链序列指定为EAC33，其中氨基酸序列如SEQIDNO.13所示。本公开文本还提供了由具有含L234A、L235A、F405L、M428L、N434S突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H、ADA-H1、ADA-H1X、ADA-H2、ADA-H2X、ADA-H3、ADA-H3X、ADA-H4、ADA-H4X的九个抗TNFα抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述九个抗TNFα抗体重链序列分别指定为EAC119、EAC129、EAC130、EAC131、EAC132、EAC133、EAC134、EAC135、EAC136，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.14、NO.15、NO.16、NO17、NO18、NO19、NO20、NO21、NO22所示。本公开文本还提供了由具有含E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434S突变并缺失了G236的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H、ADA-H1X、ADA-H2X、ADA-H3X、ADA-H4X的五个抗TNFα抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述五个抗TNFα抗体重链序列分别指定为EAC144、EAC166、EAC167、EAC168、EAC169，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.23、NO.24、NO.25、NO26、NO27所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的重链氨基酸序列的双特异性抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了由基于轻链可变结构域ADA-L、ADA-L1、ADA-L2的抗TNFα抗体轻链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述抗TNFα抗体轻链序列分别指定为EAC34、EAC127、EAC128，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.28、NO29、NO30所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:28、29或30具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的轻链氨基酸序列的双特异性抗体。作为非限制性例子，通过将上述抗TNFα抗体重链序列和抗TNFα抗体轻链序列配对，本公开文本提供了由表2中列出的具有不同IgGFc的抗TNFα抗体构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述抗体采用不同重链可变结构域和不同轻链可变结构域的组合。作为非限制性例子，本公开文本提供了由三个抗IL-1β抗体重链可变结构域序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述三个抗IL-1β抗体重链可变结构域序列指定为Ab5H3、Ab8H1、Ab9H1，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.31、NO.32、NO.33所示。在实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合片段包含含有与SEQIDNO:31、32或33具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的抗IL-1β抗体重链可变结构域。作为非限制性例子，本公开文本提供了由三个抗IL-1β抗体轻链可变结构域序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述三个抗IL-1β抗体轻链可变结构域序列指定为Ab5L、Ab8L3、Ab9L1，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.34、NO.35、NO.36所示。在实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合片段包含含有与SEQIDNO:34、35或36具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的抗IL-1β抗体轻链可变结构域。作为非限制性例子，本公开文本提供了由具有含K409R突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab5H3、Ab8H1、Ab9H1的三个抗IL-1β抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述三个抗IL-1β抗体重链序列指定为EAC53、EAC73、EAC80，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.37、NO.38、NO.39所示。本公开文本还提供了由具有含L234A、L235A、K409R、M428L、N434S突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab5H3和Ab8H1的两个抗IL-1β抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述两个抗IL-1β抗体重链序列指定为EAC120和EAC121，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.40和NO.41所示。本公开文本还提供了由具有含E233P、L234A、L235A、K409R、M428L、N434S突变并缺失了G236的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab8H1和Ab9H1的两个抗IL-1β抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述两个抗IL-1β抗体重链序列指定为EAC145和EAC161，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.42和NO.43所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:37、38、39、40、41、42或43具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的重链氨基酸序列的双特异性抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了由基于轻链可变结构域Ab5L、Ab8L3、Ab9L1的三个抗IL-1β抗体轻链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述三个抗IL-1β抗体轻链序列指定为EAC32、EAC78、EAC83，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.44、NO.45、NO.46所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:44、45或46具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的轻链氨基酸序列的双特异性抗体。作为非限制性例子，通过将上述抗IL-1β抗体重链序列和抗IL-1β抗体轻链序列配对，本公开文本提供了由表3中列出的具有不同IgGFc的抗IL-1β抗体构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述抗体采用不同重链可变结构域和不同轻链可变结构域的组合。作为非限制性例子，本公开文本提供了表4中列出的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体，所述双特异性抗体采用具有不同IgGFc的表2中列出的抗TNFα抗体和表3中列出的抗IL-1β抗体的组合。表4.抗TNFα和IL-1β双特异性抗体抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的组合物本公开文本的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体涵盖保留与TNFα和IL-1β二者特异性结合的能力的抗原结合片段。如本文所用的抗原结合片段可以包括抗体的任何3个或更多个连续氨基酸(例如，4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、8个或更多个或甚至10个或更多个连续氨基酸)，并且涵盖Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)片段，或单独的轻链或重链可变区或其部分。这些片段缺乏完整抗体的Fc片段，从循环中清除地较快，并且与完整抗体相比可以具有更少的非特异性组织结合。这些片段可以使用熟知的方法从完整抗体产生，例如通过用酶(诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段))进行蛋白水解切割而产生。TNFα和IL-1β结合片段还可以涵盖由重链抗体(HCAb)的VH结构域组成的结构域抗体(dAb)片段。在骆驼科动物中发现的免疫球蛋白的一些同种型中存在常规抗体的H2L2结构的例外。功能性VHH可以通过直接克隆来自免疫的骆驼科动物的B细胞的VHH基因从而产生重组VHH而通过免疫的骆驼科动物的HCAb的蛋白水解切割获得，或者从天然或合成文库获得。具有所需抗原特异性的VHH也可以通过噬菌体展示方法获得。TNFα和IL-1β结合片段还可以涵盖双抗体，所述双抗体是这样的二价抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但是使用足够短以致不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。TNFα和IL-1β结合片段还可以涵盖与TNFα和IL-1β二者结合的单链抗体片段(scFv)。scFv包含与抗体轻链可变区(VL)可操作地连接的抗体重链可变区(VH)，其中重链可变区和轻链可变区一起或单独地形成结合TNFα和IL-1β的结合位点。此类TNFα和IL-1β结合片段可以通过本领域已知的方法和由氨基酸Gly和Ser构成的柔性蛋白质接头制备，所述方法例如像抗体分子的重链和轻链可变部分的合成或PCR介导的扩增。克隆所得的DNA片段以用于在大肠杆菌(E.coli)或哺乳动物细胞中表达。从宿主细胞中纯化表达的TNFα和IL-1β结合片段。本公开文本的TNFα和IL-1β结合抗体和片段涵盖包含两条重链和两条轻链的全长抗体。TNFα和IL-1β结合抗体可以是人抗体或人源化抗体。人源化抗体包括嵌合抗体和CDR移植抗体。嵌合抗体是包括与人恒定区连接的非人抗体可变区的抗体。CDR移植抗体是包括与来自人“受体”抗体的框架区连接的来自非人“供体”抗体的CDR的抗体。示例性人抗体或人源化抗体包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD抗体。本发明的抗体可以属于任何类别(IgG、IgM、IgE、IgGA、IgD等)或同种型，并且可以包含κ或λ轻链。例如，人抗体可以包含IgGFc结构域，诸如同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的至少一种。在一些情况下，IgGFc结构域包含与作为SEQIDNO:47的IgG1Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，IgGFc结构域包含与作为SEQIDNO:48的IgG2Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，IgGFc结构域包含与作为SEQIDNO:49的IgG3Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，IgGFc结构域包含与作为SEQIDNO:50的IgG4Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。可以将S228P突变做到IgG4抗体中以增强IgG4稳定性。本发明的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体可以包含经修饰的Fc区，其中经修饰的Fc区相对于野生型Fc区包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中，本发明的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体提供有经修饰的Fc区，其中在生物环境中当与亲本野生型抗体相比时，修饰天然存在的Fc区以延长抗体的半衰期，例如血清半衰期或通过体外测定测量的半衰期。可以单独或组合做出的示例性突变是T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R突变。在某些实施方案中，通过在作为SEQIDNO:51的IgG1Fc中用M252Y/S254T/T256E突变工程化可以实现半衰期的延长，根据EU索引进行残基编号(Dall'Acqua,Kiener等人2006)。在某些实施方案中，通过在作为SEQIDNO:52的IgG1Fc中用M428L/N434S突变工程化也可以实现半衰期的延长(Zalevsky,Chamberlain等人2010)。在某些实施方案中，通过在作为SEQIDNO:53的IgG1Fc中用T250Q/M428L突变工程化也可以实现半衰期的延长(Hinton,Xiong等人2006)。在某些实施方案中，通过在作为SEQIDNO:54的IgG1Fc中用N434A突变工程化也可以实现半衰期的延长(Shields,Namenuk等人2001)。在某些实施方案中，通过在作为SEQIDNO:55的IgG1Fc中用T307A/E380A/N434A突变工程化也可以实现半衰期的延长(Petkova,Akilesh等人2006)。可以在小鼠的PK研究中评价相对于具有天然IgGFc的抗体Fc工程化对抗体的半衰期延长的影响。在一些实施方案中，本发明的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体提供有经修饰的Fc区，其中修饰天然存在的Fc区以增强抗体对在残基222-237(EU编号)之间或所述残基处切割野生型抗体的蛋白酶的蛋白水解降解的抗性。在某些实施方案中，通过在缺失了G236的铰链区中用E233P/L234A/L235A突变工程化可以实现当与作为SEQIDNO:56的亲本野生型抗体相比时对蛋白水解降解的抗性，根据EU索引进行残基编号(Kinder,Greenplate等人2013)。在不需要效应子功能的情况下，可以进一步工程化本公开文本的抗体以在抗体Fc中引入至少一个突变，所述至少一个突变降低抗体与激活Fcγ受体(FcγR)的结合和/或降低Fc效应子功能(诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP))。可以突变以降低抗体与激活FcγR的结合并且随后降低效应子功能的Fc位置是例如以下文献中所述的那些：(Xu,Alegre等人2000)(Vafa,Gilliland等人2014)(Bolt,Routledge等人1993)(Chu,Vostiar等人2008)(Shields,Namenuk等人2001)。具有最小的ADCC、ADCP、CDC、Fc介导的细胞激活的Fc突变也已经被描述为IgG1、IgG2和IgG4的σ突变(Tam,McCarthy等人2017)。可以单独或组合做出的示例性突变是在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S突变。可以做出以降低ADCC的示例性组合突变是在IgG1上的L234A/L235A、在IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、在IgG4上的F234A/L235A、在IgG4上的S228P/F234A/L235A、在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A、在IgG2上的V234A/G237A、在IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、在IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S、在IgG1上的S267E/L328F、在IgG1上的L234F/L235E/D265A、在IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、在IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和在IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。也可以使用杂交体IgG2/4Fc结构域，诸如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。进一步包含保守修饰的本公开文本的抗体在本公开文本的范围内。“保守修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。保守取代是氨基酸被具有类似侧链的氨基酸残基替代的那些。具有类似侧链的氨基酸残基的家族是定义明确的，并且包括具有以下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳香族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂肪族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基也可以被丙氨酸取代，如先前已经针对丙氨酸扫描诱变所述。对本公开文本的抗体的氨基酸取代可以通过已知方法(例如通过PCR诱变)进行(美国公开号4,683,195)。可替代地，可以例如使用编码11种氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)的随机(NNK)或非随机密码子(例如，DVK密码子)产生变体文库。可以使用本文所述的测定来测试所得抗体变体的特征。本公开文本的抗体可以通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(诸如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂化)等过程进行翻译后修饰。此类修饰可以在体内或在体外发生。例如，本公开文本的抗体可以与聚乙二醇缀合(PEG化)，以改善其药代动力学特征。缀合可以通过本领域技术人员已知的技术进行。已经证明治疗性抗体与PEG的缀合可增强药效学同时不干扰功能。可以修饰本公开文本的抗体以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或在本公开文本的范围内的其他所希望的生物或生物物理特性。抗体的稳定性受到多种因素的影响，所述因素包括(1)影响其固有稳定性的单独结构域的核心填充；(2)对HC和LC配对产生影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用；(3)掩埋极性和带电残基；(4)极性和带电残基的H键合网；以及(5)在其他分子内和分子间力之间的表面电荷和极性残基分布(Worn和Pluckthun2001)。可以基于抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定潜在的结构不稳定残基，并且可以通过在所鉴定的残基中产生和评价具有突变的变体来测试所述残基对抗体稳定性的影响。增加抗体稳定性的方法之一是提高如通过差示扫描量热法(DSC)测量的热转化中点(Tm)。通常，蛋白质Tm与其稳定性相关并且与其对在溶液中解折叠和变性以及依赖于蛋白质解折叠的趋势的降解过程的易感性逆相关。许多研究已经发现了如通过DSC测量为热稳定性的配制品的物理稳定性与通过其他方法测量的物理稳定性的排名之间的相关性。配制品研究表明FabTm对相应mAb的长期物理稳定性具有影响。本公开文本的抗体可以在Fc区中具有氨基酸取代，所述氨基酸取代可以改善制造和药物稳定性。IgG1的例子是在铰链221-DKTHTC-226中的H224S(或H224Q)(Eu编号)，其彻底阻断诱导的切割；并且对于IgG4，S228P突变阻断半抗体交换。本公开文本的抗体可以包含另外的氨基酸序列，所述另外的氨基酸序列可以用作抑制性结构域以在识别和结合至其抗原方面掩盖抗体，并且因此抗体以无活性或前抗体存在。可以通过经由例如位点特异性蛋白酶去除抑制性结构域序列，将前抗体转化为活性抗体。无活性前抗体可以全身地具有降低的毒性，但是可以在蛋白酶丰富的疾病位点处激活以达到治疗效果。抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的产生从在IgGFc中分别具有F405L和K409R(EU编号)突变的两种亲本抗体通过称为受控的Fab臂交换的方法产生双特异性抗体(Labrijn,Meesters等人2014)。受控的Fab臂交换反应是CH3结构域的二硫键异构化反应和解离-缔合的结果。首先，产生两种亲本抗体，一种携带F405LFc突变，并且一种携带K409RFc突变。还原亲本抗体的铰链区中的重链二硫键，并且分离亲本抗体的重链。相对于同二聚化，F405L和K409R突变有利于重链的异二聚化。因此，亲本抗体之一的所得的游离半胱氨酸与第二亲本抗体的半胱氨酸残基形成重链间二硫键。所得的产物是异二聚化的抗体，其中一半来自一种亲本抗体，并且另一半来自另一种亲本抗体。在本公开文本中，通过受控的Fab臂交换由具有F405LFc突变的针对TNFα的一种亲本抗体与具有K409RFc突变的针对IL-1β的另一种亲本抗体产生对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体。在本公开文本的亲本抗体上的F405L和K409R突变可以在人Fc、非人灵长类动物Fc、鼠Fc结构域等上工程化。在本公开文本的亲本抗体上的F405L和K409R突变可以在人IgG1Fc、人IgG2Fc、人IgG3Fc、人IgG4Fc等上工程化。在一些情况下，具有F405L突变的Fc结构域包含与作为SEQIDNO:57的具有F405L突变的IgG1Fc具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，具有K409R突变的Fc结构域包含与作为SEQIDNO:58的具有K409R突变的IgG1Fc具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。可以通过促进Fc异二聚化的其他Fc突变和工程化方法产生本公开文本的抗TNFαxIL1β双特异性抗体，所述方法包括但不限于杵臼和静电匹配的相互作用。在杵臼策略(参见例如，国际公开号WO2006/028936，通过引用并入)中，可以将在人IgG中形成CH3结构域的界面的选定的氨基酸在影响CH3结构域相互作用的位置处突变以促进异二聚体形成。将具有小侧链的氨基酸(臼)引入亲本抗体的一个Fc结构域中，并且将具有大侧链的氨基酸(杵)引入亲本抗体的另一个Fc结构域中。在两条重链共表达后，由于具有“臼”的重链与具有“杵”的重链的优先相互作用，形成异二聚体。形成杵和臼的示例性CH3取代对包括：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。在静电匹配的相互作用策略中，可以工程化突变以在一个CH3界面处产生带正电的残基并且在第二CH3界面处产生带负电的残基，如US2010/0015133A1；US2009/0182127A1；US2010/028637A1或US2011/0123532A1中所述。重链的异二聚化可以通过两个突变的Fc之间的静电匹配的相互作用形成。双特异性抗体的形成可以通过ELISA测定来评估。在本公开文本中，将IL-1β包被在ELISA板上，然后添加双特异性抗体和TNFα。在洗涤非特异性结合后，通过抗TNFα抗体然后通过HRP缀合的二抗检测TNFα的存在。由于只有双特异性抗体能够用双臂同时结合TNFα和IL1β时，因此通过ELISA信号反映双特异性抗体的形成。如果在两种亲本抗体的生物物理特性方面存在可检测的差异，则也可以通过分析型HPLC评估双特异性抗体的形成。pI的差异可以在阳离子交换色谱上产生两种亲本抗体的两个单独的峰，并且双特异性抗体可以迁移为之间的峰。疏水性的差异可以在疏水相互作用色谱上产生两种亲本抗体的两个单独的峰，并且双特异性抗体可以迁移为之间的峰。分析型HPLC不仅证明了双特异性抗体的形成，而且还允许定量形成的双特异性抗体的百分比。亲本抗TNFα和抗IL-1β抗体的表达和纯化本公开文本的抗TNFα和抗IL-1β亲本抗体和片段可以由单一核酸(例如，包含编码抗体的轻链和重链多肽的核苷酸序列的单一核酸)编码，或者由两种或更多种单独的核酸(其中的每种编码抗体或抗体片段的不同部分)编码。可以将核酸插入载体(例如，核酸表达载体和/或靶向载体)中。此类载体可以以多种方式使用，例如用于在细胞或转基因动物中表达抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或抗体片段。通常选择在将使用载体的宿主细胞中具有功能的载体。编码抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或片段的核酸分子可以在原核、酵母、昆虫(杆状病毒系统)和/或真核宿主细胞中扩增/表达。宿主细胞的选择将部分取决于抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或片段是否进行翻译后修饰(例如，糖基化和/或磷酸化)。如果是这样的话，优选酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。表达载体通常含有一种或多种以下组分：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、用于分泌的前导序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区和可选择标记元件。作为非限制性例子，本公开文本提供了包含SEQIDNO:59、60、61或62的多核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸序列分别编码抗TNFα抗体重链EAC33、抗TNFα抗体轻链EAC34、抗IL-1β抗体重链EAC53和抗IL-1β抗体轻链EAC32。在大多数情况下，在抗TNFα和抗IL-1β抗体或片段的N末端处工程化前导序列或信号序列以引导其分泌。抗TNFα和抗IL-1β抗体或片段从宿主细胞的分泌将导致信号肽从抗体或片段中去除。因此，成熟抗体或片段将缺乏任何前导序列或信号序列。在一些情况下，诸如在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化的情况下，可以操纵多种前序列以改善糖基化或产率。例如，可以改变信号肽的肽酶切割位点，或者添加也可能影响糖基化的前序列。本公开文本进一步提供了包含本公开文本的核酸或载体的细胞(例如，分离的或纯化的细胞)。所述细胞可以是能够用本公开文本的核酸或载体转化以便产生由此编码的多肽的任何类型的细胞。为了表达抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或片段，将如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中，使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。将核酸和载体引入分离的细胞中和转化的宿主细胞的体外培养和选择的方法是本领域已知的，并且包括使用氯化钙介导的转化、转导、缀合、三亲本杂交、DEAE、葡聚糖介导的转染、感染、与脂质体膜融合、用DNA包被的微弹高速轰击、直接显微注射至单个细胞和电穿孔。在将本公开文本的核酸或载体引入细胞中后，将细胞在适用于表达编码序列的条件下培养。然后可以从细胞中分离抗体、抗原结合片段或抗体的一部分。在某些实施方案中，可以将一起编码抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或其抗原结合片段的两种或更多种载体引入细胞中。已经分泌到细胞培养基中的抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或片段的纯化可以使用多种技术完成，所述技术包括亲和、免疫亲和或离子交换色谱，分子筛色谱，制备型凝胶电泳或等电点聚焦，色谱聚焦和高压液相色谱。例如，可以通过用蛋白A(其选择性结合Fc区)的亲和色谱纯化包含Fc区的抗体。修饰形式的抗体或抗原结合片段可以用在其羧基或氨基末端处的亲和标签(诸如六组氨酸)或其他小肽(诸如FLAG或myc)制备，并且通过一步亲和柱纯化。例如，多组氨酸以高亲和力和特异性与镍结合，因此镍的亲和柱(诸如镍柱)可以用于纯化多组氨酸标记的选择性结合剂。在一些情况下，可以采用多于一个的纯化步骤。抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的结合和功能活性本公开文本涵盖与TNFα和IL-1β选择性结合的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体，因为它们以比对其他抗原更高的亲和力与TNFα和IL-1β结合。抗TNFα和IL-1β双特异性抗体和片段可以与人TNFα和IL-1β选择性结合，而且还与非人TNFα和IL-1β可检测地结合。例如，所述抗体或片段可以与啮齿动物TNFα和IL-1β、灵长类动物TNFα和IL-1β、犬TNFα和IL-1β、和兔TNFα和IL-1β、或豚鼠TNFα和IL-1β中的一种或多种结合。可替代地或另外地，TNFα和IL-1β结合抗体可以对重组人TNFα和IL-1β以及内源性人TNFα和IL-1β具有相同或基本上相同的效力。本领域详细描述了体外和基于细胞的测定用于确定TNFα和IL-1β与其受体的结合。例如，可以通过以下方式来确定TNFα和IL-1β与其受体的结合：固定TNFα和IL-1β结合抗体，用固定化的抗体鳌合TNFα和IL-1β，并且确定TNFα和IL-1β是否与抗体结合，并且使可溶性形式的受体与结合的TNFα和IL-1β/抗体复合物接触并且确定可溶性受体是否与复合物结合。所述方案还可以包括使可溶性受体与固定化的抗体接触，然后与TNFα和IL-1β接触，以确认可溶性受体不与固定化的抗体结合。可以使用仪器进行此方案以用于结合相互作用的动力学分析。还可以采用这种方案来确定抗体或其他分子是允许还是阻断TNFα和IL-1β与其受体的结合。对于其他结合测定，可以通过在存在或不存在TNFα和IL-1β抗体的情况下比较TNFα和IL-1β与受体的结合来确定允许或阻断TNFα和IL-1β与其受体的结合。在测定读出方面阻断被鉴定为与含有相应缓冲剂或稀释剂但是不含抗TNFα和IL-1β抗体的对照样品相比，在存在抗TNFα和IL-1β抗体的情况下TNFα和IL-1β与受体的结合的指定降低。测定读出可以定性地观察，以指示存在或不存在阻断，或者可以定量地观察，以指示由于抗体或片段的存在导致的结合降低的百分比或倍数。当TNFα和IL-1β结合双特异性抗体基本上阻断TNFα和IL-1β与受体的结合时，与在不存在所述抗体或片段的情况下相同浓度的TNFα和IL-1β与受体的结合相比，TNFα和IL-1β与受体的结合降低至少10倍、可替代地至少约20倍、可替代地至少约50倍、可替代地至少约100倍、可替代地至少约1000倍、可替代地至少约10000倍或更多。根据本公开文本的用于所述用途的优选的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体通常以高亲和力(例如，如用BIACORE确定的)(例如像对TNFα和IL-1β的平衡结合解离常数(KD)为约10nM或更小、约5nM或更小、约1nM或更小、约500pM或更小、或更优选地约250pM或更小、约100pM或更小、约50pM或更小、约25pM或更小、约10pM或更小、约5pM或更小、约3pM或更小、约1pM或更小、约0.75pM或更小、约0.5pM或更小或者约0.3pM或更小)与人TNFα和IL-1β结合。本公开文本的抗体或片段可以例如以约10nM或更小、约5nM或更小、约2nM或更小、约1nM或更小、约0.75nM或更小、约0.5nM或更小、约0.4nM或更小、约0.3nM或更小或甚至约0.2nM或更小的EC50与TNFα和IL-1β结合，如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定的。优选地，本公开文本的抗体或抗体片段不与除TNFα和IL-1β之外的任何靶标交叉反应。例如，本发明的抗体和片段可以与IL-1β结合，但是不与IL-1α可检测地结合，或者相对于与IL-1α的结合，在与IL-1β的结合方面具有至少约100倍(例如，至少约150倍、至少约200倍或甚至至少约250倍)的选择性。本公开文本还涵盖与TNFα和IL-1β结合的中和抗体或其中和片段，以便中和TNFα和IL-1β的生物活性。可以通过TNFα和IL-1β生物活性的一种或多种指标(诸如在报告测定中TNFα和IL-1β刺激的报告基因表达、TNFα和IL-1β刺激的IL-6从人成纤维细胞或其他细胞中的释放、TNFα和IL-1β诱导的T辅助细胞的增殖)的测定来评估TNFα和IL-1β的生物活性的中和。还可以通过小鼠关节炎模型在体内评估TNFα和IL-1β的生物活性的中和。优选地，本公开文本的TNFα和IL-1β结合抗体和片段中和与TNFα和IL-1β所结合的受体的信号传导功能联系的TNFα和IL-1β的生物活性。本发明的抗体或片段可以是与影响TNFα和IL-1β的生物活性的TNFα和IL-1β表位特异性结合的中和抗体或片段。本发明的抗体或片段可以与TNFα和IL-1β的中和敏感表位结合。当TNFα和IL-1β的中和敏感表位被本发明的抗体或片段之一结合时，结果是含有所述表位的TNFα和IL-1β的生物活性的丧失。药物组合物根据本公开文本的用于所述用途的TNFα和IL-1β结合抗体和抗体片段可以被配制为组合物，尤其是药物组合物，用于本文所述的方法。此类组合物包含治疗或预防有效量的本公开文本的TNFα和IL-1β结合抗体或抗体片段与合适的载体(例如，药学上可接受的药剂)的混合。通常，本公开文本的TNFα和IL-1β结合抗体和抗体片段被充分纯化以用于在被配制为药物组合物之前向动物施用。药学上可接受的药剂包括载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、助悬剂、溶剂、填充剂、疏松剂、缓冲剂、递送媒介物、张度剂、助溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂和表面活性剂。所述组合物可以呈液体形式或者冻干或冷冻干燥形式，并且可以包括一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或疏松剂。组合物可以适用于肠胃外施用。示例性组合物适用于通过熟练技术人员可用的任何途径(诸如关节内、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、病灶内、直肠内、经皮、口服和吸入途径)注射或输注到动物中。本文所述的药物组合物可以以在特定局部(local)环境中提供局部(local)浓度的产物(例如，推注、储库效应、局部(topical))持续释放和/或增加的稳定性或半衰期的方式被配制用于受控或持续递送。使用方法本公开文本提供了本文提供的双特异性抗TNFα和IL-1β抗体治疗将经历常规抗TNFα疗法或抗IL-1β疗法的患者的用途。示例性适应症包括类风湿性关节炎、炎性肠病和其他全身炎性病症。双特异性抗体增强每种单独的抗细胞因子疗法的反应性和/或最小化所述疗法的毒性。在实施方案中，与相应的单克隆抗体相比，可以以更低的有效剂量给予双特异性抗体，从而最小化潜在的毒性。此外，归功于具有最佳Fc工程化的双特异性抗TNFα和IL-1β抗体的较长半衰期的较低给药连同较不频繁给药可以导致较低的免疫原性风险，因此可能需要更长时间形成抗药物抗体。使用双重TNFα和IL-1β抑制剂抗体的考虑是从TNFα和IL-1β二者均具有强烈存在的疾病状态的数据挖掘获得的。下文描述了与两种细胞因子具有高靶标-疾病相关性的选定的例子(https://www.targetvalidation.org/)。在痛风中，已经证明尿酸可促进人单核细胞中的IL-1β分泌。还已知TNFα刺激诱导前IL-1βmRNA表达。Yokose等人证明了通过用TNFα引发人的嗜中性粒细胞，这将在痛风关节中促进尿酸介导的IL-1β分泌。因此，这些发现还指出了在患有痛风性关节炎的患者中这种双重TNFα和IL-1β抑制的效用(Yokose,Sato等人2018)。创伤后关节炎是严重关节创伤的常见继发性并发症。随着疾病的进展，它最终可能导致骨关节炎。在创伤后关节炎兔动物模型中，Tang等人表明同时沉默IL-1β和TNFα二者(经由RNA干扰)导致软骨损伤和关节退行性变大大减少。共治疗组还显示出与创伤关节损伤相关的症状的更大缓解(Tang,Hao等人2015)。因此，创伤后关节炎也将是此新型双特异性抗体的另一种关键适应症。此双重特异性抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的另一个重要的潜在用途是在伤口愈合方面。血管生成是伤口愈合的重要步骤，并且它受内皮细胞功能的影响。已知Cdc42在内皮细胞功能和血管发育中起关键作用。已经发现Cdc42的耗竭通过在伤口床中增加IL-1β和TNF-α的方式导致伤害愈合不良。通过同时阻断IL-1β和TNFα二者，这可能会使Cdc42的功能正常化，并且因此潜在地加快伤口愈合的速度(Xu,Lv等人2019)。此外，已经证明神经性疼痛(诸如坐骨神经痛)对抗TNFα疗法有反应(Hess,Axmann等人2011)。也已经证明老的TNF合成抑制剂姜黄素和沙利度胺可有效地降低神经性疼痛(Li,Zhang等人2013)。事实上，已知类风湿性关节炎患者在抗TNFα疗法后，在他们的关节损伤得到改善很久以前，他们很快感觉到好转(Taylor2010)。还已知细胞因子IL-1β是炎症和神经性疼痛的关键因子。因此，双重特异性抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的这种新型披露将在管理这种病症中具有巨大潜力。存在指向同时IL-1β和TNFα抑制的效用的许多其他文献资料。例如，帕金森病显示出具有升高组分的IL-1β和TNFα二者(Leal,Casabona等人2013，Erekat和Al-Jarrah2018)。另一方面，慢性乙型肝炎感染与来自IL-1β和TNFα增加的严重炎症相关(Lou,Hou等人2013，Wu,Kanda等人2016)。因此，双重特异性抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的这种新型披露可以为帕金森病和慢性乙型肝炎感染提供新型治疗方法。许多化学疗法或癌症靶向疗法已经与这样的病症相关，所述病症已知为主要经由升高的IL-1β和TNFα介导的癌症治疗相关症状(CTRS)。使用双重抑制剂来抑制这些细胞因子(诸如本公开文本)可以具有加快这些患者从痛苦中康复的潜力(Smith,Leo等人2014)。最后，还已经在乳腺癌中发现TNFα和IL-1β二者的升高(Martinez-Reza,Diaz等人2019)。事实上，已知炎性细胞因子(包括TNFα和IL-1β二者)存在于肿瘤微环境中以促进癌症生长和疾病进展(Kuratnik,Senapati等人2012，Kobayashi,Vali等人2016)。调节TNFα和IL-1β二者可能会改变肿瘤微环境。因此，本公开文本的针对TNFα和IL-1β二者的双特异性抗体也可以具有在癌症治疗中作为采用其他标准护理抗癌剂的辅助疗法的作用。此外，对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体和针对免疫肿瘤学靶标(诸如PD1)的抗体的组合使用可以提供治疗不同类型的癌症的更有效的治疗功效。为了治疗神经障碍，可以采用Fc工程化以促进抗TNFα和IL-1β双特异性抗体对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力增加，然后这将允许跨越血脑屏障进行Ig-Ab胞吞转运(Sockolosky,Tiffany等人2012，Xiao和Gan2013)。同样，允许便利扩散到这些构建体中的蛋白质融合体可以增加跨越血脑屏障的转运。这将促进在CNS内治疗性抗体介导的TNFα和IL-1β中和用于脑内的炎性病症(诸如中风、阿尔茨海默病或其他慢性神经障碍)的潜力。除了治疗用途，本发明的抗体和片段还可以用于使用常规免疫测定(诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学)检测TNFα和IL-1β(例如，在生物样品诸如血清或血浆中)的诊断方法中。用于检测生物样品中的TNFα和IL-1β的方法可以包括以下步骤：使生物样品与一种或多种本发明的抗体或片段接触，以及检测与TNFα和IL-1β结合的抗体或片段或者未结合的抗体或片段，从而检测生物样品中的TNFα和IL-1β。所述抗体或片段可以用可检测物质直接或间接标记以促进结合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。实施例提供以下实施例以更详细地描述本公开文本。它们旨在说明而非限制本公开文本。实施例1：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的产生通过称为受控的Fab臂交换的方法由两种亲本抗体(指定为TAVO3334的抗人TNFα抗体和指定为TAVO5332的抗人IL-1β抗体)产生针对TNFα和IL-1β二者的双特异性抗体，在本公开文本中指定为TAVO3334x5332(图1)。抗人TNFα抗体TAVO3334在其IgG1Fc中具有F405L突变(图2)并且抗人IL-1β抗体TAVO5332在其IgG1Fc中具有K409R突变(图3)，以促进双特异性抗体形成。为了产生亲本抗体，根据转染试剂盒说明书(ThermoScientific)，将编码TAVO3334和TAVO5332的重链和轻链的质粒共转染到Expi293F细胞中。转染后五天将细胞离心，并且使上清液通过0.2μm过滤器。通过在蛋白A琼脂糖柱(GEHealthcareLifeSciences)上的亲和层析纯化上清液中的表达的抗体。将纯化的抗体通过透析缓冲液交换到DPBS(pH7.2)中，并且通过280nm处的紫外吸光度确定蛋白质浓度。对于受控的Fab臂交换，将等摩尔量的两种亲本抗体混合在一起，并且在存在75mM2-巯基乙胺(2-MEA)的情况下还原5小时。将反应混合物针对DPBS透析以允许双特异性抗体形成。通过类似的过程，也通过受控的Fab臂交换产生了在这些实施例中采用的其他形式的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体。使亲本抗体TAVO5332和TAVO3334以及双特异性抗体TAVO3334x5332经受SDS-PAGE分析(图4)。在还原条件下，所有三种抗体均具有预期分子量的重链和轻链。在非还原条件下，所有三种抗体均迁移为具有大约150kDa分子量的主要蛋白质条带。也对TAVO167127x14578、TAVO169127x14578、TAVO167128x14578和TAVO169128x14578(它们是用E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434SFc突变工程化并缺失了G236的抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体)以及相应的亲本抗体TAVO167127、TAVO169127、TAVO167128、TAVO169128和TAVO14578进行了类似的SDS-PAGE分析。在还原和非还原条件下均获得预期的蛋白质条带，这表明这些广泛的Fc突变不会影响这些抗体的结构完整性(图4)。实施例2：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的形成的确认通过阳离子交换(CEX)色谱评估抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332的形成。将20μg的抗体加载到BioSCX离子交换柱(Agilent)上。TAVO3334的峰出现在6.841分钟处，而TAVO5332的峰出现在5.137分钟处(图5)。TAVO3334x5332的主要蛋白质条带的峰在5.936分钟处迁移。曲线下面积(AUC)的进一步计算表明97％的亲本抗体通过Fab臂交换形成双特异性抗体(图5)。类似地，当评估抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178和相关的亲本抗体时，TAVO11934的峰出现在6.861分钟处，而TAVO12178的峰出现在4.725分钟处(图5)。TAVO11934x12178的主要蛋白质条带的峰在5.783分钟处迁移。AUC的进一步计算表明96％的亲本抗体通过Fab臂交换形成TAVO11934x12178双特异性抗体(图5)。还通过基于ELISA的结合测定评估双特异性抗体的形成。在此测定中，将人IL-1β包被在板上，然后添加双特异性抗体TAVO3334x5332和TNFα。在洗涤非特异性结合后，通过抗TNFα检测抗体然后通过HRP缀合的二抗(Biolegend)检测TNFα的存在。观察到双特异性抗体TAVO3334x5332剂量依赖性地介导TNFα和IL1β二者的结合(图6)。通过将小鼠IL-1β包被在板上也进行了类似的ELISA测定。一致地，观察到双特异性抗体TAVO3334x5332而不是两种亲本抗体TAVO3334和TAVO5332的混合物对人TNFα的剂量依赖性募集(图6)。此数据表明了能够用双臂同时结合TNFα和IL-1β的双特异性抗体的形成。实施例3：双特异性抗体及其相应的亲本抗体对TNFα和IL-1β的结合亲和力采用基于ELISA的结合测定来评价双特异性抗体TAVO3334x5332及其亲本抗体TAVO5332和TAVO3334与来自不同物种的TNFα和IL1β的结合。在此测定中，将1μg/mL重组人TNFα或IL-1β(R&Dsystems)包被在ELISA板上。将渐增浓度的TAVO3334x5332、TAVO5332和TAVO3334抗体施加到板上，并且通过HRP缀合的抗人二抗检测它们与重组人TNFα或IL-1β的结合。观察到抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332以与抗TNFα抗体TAVO3334类似的效力剂量依赖性地结合来自人、恒河猴和小鼠的TNFα，而抗IL-1β抗体TAVO5332没有显示出结合活性(图7)。另一方面，抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332也以与抗IL-1β抗体TAVO5332类似的效力剂量依赖性地结合来自人、恒河猴和小鼠的IL-1β，而抗TNFα抗体TAVO3334没有显示出结合活性(图8)。实施例4：双特异性抗体及其相应的亲本抗体对TNFα活性的中和TNFα对鼠纤维肉瘤WEHI细胞系具有细胞毒效应。开发了基于WEHI细胞的细胞毒性测定以评估TAVO3334x5332及其亲本抗体对TNFα介导的细胞毒性的中和的影响。在此测定中，将渐增量的测试抗体连同10ng/mLTNFα一起施加到WEHI细胞上。通过MTT测定来定量WEHI细胞的细胞毒性。观察到抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332以相对于抗TNFα抗体TAVO3334不到二分之一的效力剂量依赖性地中和来自人和恒河猴的TNFα的细胞毒性活性，而抗IL1β抗体TAVO5332没有显示出功能活性(图9)。然而，尽管具有良好的结合亲和力，但抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332和抗TNFα抗体TAVO3334均没有显示出对小鼠TNFα的功能中和活性。实施例5：双特异性抗体及其相应的亲本抗体对IL-1β活性的中和IL-1β可以驱动人肺成纤维细胞细胞系MRC-5的激活并且刺激IL-6释放。采用基于MRC-5细胞的测定来评价TAVO3334x5332及其亲本抗体在阻断由分别来自人、恒河猴和小鼠的IL-1β驱动的IL-6释放中的作用。将渐增量的抗体连同IL-1β(人和恒河猴为1ng/ml，并且小鼠为10ng/ml)一起施加到在96孔板的每个孔中的5,000个MRC-5细胞中。在过夜孵育后，通过IL-6测定试剂盒(R&Dsystems)定量IL-6产生。观察到抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332及其抗IL-1β亲本抗体TAVO5332可以剂量依赖性地抑制由来自人、恒河猴和小鼠的IL-1β诱导的IL-6释放，而抗TNFα抗体TAVO3334没有显示出功能活性(图10)。在中和IL-1β活性方面，抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332与其抗IL-1β亲本抗体TAVO5332相比显示出略微降低的效力(<2分之一)。实施例6：双特异性抗体及其相应的亲本抗体对TNFα和IL-1β活性二者的中和TNFα和IL-1β二者的功能活性可以通过HEK-Blue报告测定来评估。在此测定中，HEK-Bluenull1-v细胞(Invivogen)可以通过触发导致NF-κB激活的信号传导级联对TNFα和IL-1β刺激做出反应，并且通过激活SEAP报告基因表达对分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的随后产生做出反应(图11)。使用此测定评价HEK-Bluenull1-v报告细胞系对TNFα和IL-1β的反应。观察到TNFα或IL-1β可以剂量依赖性地诱导报告基因表达，其中EC50分别为5ng/mL和0.5ng/mL(图11)。将TNFα和IL-1β二者添加到细胞中可以引发加性效应，其中报告基因表达的激活更高并且EC50为1.25ng/mL。然后采用HEK-Blue报告测定来评价抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332及其亲本抗体阻断由TNFα、IL-1β或TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因表达。将渐增量的抗体连同TNFα和/或IL-1β一起施加到HEK-Blue报告细胞中。在过夜孵育后，定量SEAP报告基因表达。观察到抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332与抗TNFα抗体TAVO3334类似地剂量依赖性地抑制TNFα介导的报告基因激活，而抗IL1β抗体TAVO5332没有显示出功能活性(图12)。抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332也以与抗IL-1β抗体TAVO5332类似的效力剂量依赖性地抑制IL-1β介导的报告基因激活，而抗TNFα抗体TAVO3334没有显示出功能活性(图12)。也采用相同的测定来评价双特异性抗体及其亲本抗体阻断由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活。观察到抗TNFα抗体TAVO3334和抗IL-1β抗体TAVO5332二者均可以剂量依赖性地抑制由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活；然而，它们只能部分阻断由两种细胞因子驱动的报告基因激活(图12)。相比之下，抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332以全功效剂量依赖性地阻断由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活。此数据证明了双特异性抗体对两种细胞因子的功能活性。除了TAVO3334x5332，还采用HEK-Blue报告测定来评价其他抗TNFα和IL-1β双特异性抗体阻断由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活。观察到TAVO3334x7378、TAVO11934x12032、TAVO11934x12178、TAVO14434x14578、TAVO167127x14578、TAVO169127x14578、TAVO167128x14578和TAVO169128x14578全部均可以以全功效剂量依赖性地抑制由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活(图13)。实施例7：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的Fc工程化以延长半衰期和降低效应子功能为了改善抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的PK特征，可以将Fc突变引入IgG1抗体中以延长抗体半衰期。特别地，已经证明M428L/N434S突变可通过增加FcRn结合亲和力来延长抗体半衰期(Booth,Ramakrishnan等人2018)。此外，L234A/L235AFc突变可以消除IgG1抗体的ADCC和CDC效应子功能(Hezareh,Hessell等人2001)。因此，产生在其IgG1Fc中具有L234A、L235A、M428L、N434S(AALS)突变的两种抗TNFα和IL-1β双特异性抗体，指定为TAVO11934x12032和TAVO11934x12178。为了研究Fc工程化抗体是否具有改善的FcRn结合亲和力，在基于ELISA的结合测定中评估TAVO11934x12032及其具有野生型IgG1的对应抗体TAVO3334x5332与小鼠FcRn的结合。将1ug/mL重组小鼠FcRn(R&Dsystems)包被在ELISA板上。将渐增浓度的TAVO11934x12032和TAVO3334x5332抗体施加到板上，并且通过HRP缀合的抗人二抗检测在pH6.0下它们与重组FcRn的结合。观察到具有M428L/N434SFc突变的TAVO11934x12032可以以与缺乏此类半衰期延长突变的TAVO3334x5332相比更好的效力和功效结合FcRn(图14)。还用具有或不具有半衰期延长突变的另一对抗TNFα和IL-1β双特异性抗体进行了FcRn结合测定。类似地，观察到具有FcM428L/N434S突变的TAVO11934x12178可以以与缺乏此类半衰期延长突变的TAVO3334x7378相比更好的效力和功效结合FcRn(图14)。为了确定M428L/N434S突变是否可以延长抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的循环半衰期，将在食蟹猴PK模型中测试TAVO11934x12032。在第0天，基于体重，将TAVO11934x12032经3分钟以1.0ml/kg的体积以4mg/kg作为静脉内输注施用至雄性幼稚食蟹猴。在给药前以及在给药后1h、2h和多个时间直到第35天，将全血收集进EDTA-K2收集管中。将血浆通过在4℃下以3500xg离心10分钟分离，然后转移到微量离心管中以在-80℃下储存。将通过标准ELISA方法测量血浆样品以检测人IgG。将使用Winnonlin6.4软件分析PK数据。基于已公布的数据和我们先前的具有此类M428L/N434SFc突变的另一种抗体(其具有26天左右的半衰期)的研究，预测TAVO11934x12032将在猴中具有比正常人IgG长得多的循环半衰期。实施例8：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的Fc工程化以对蛋白酶降解具有抗性为了改善抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的体内稳定性，可以将Fc突变引入IgG1抗体中以增强抗体对蛋白水解降解的抗性。许多蛋白酶可以在残基222-237(EU编号)之间或所述残基处切割野生型IgG抗体。通过在缺失了G236的IgG1抗体的铰链区中用E233P、L234A、L235A突变工程化可以实现对蛋白水解降解的抗性，根据EU索引进行残基编号(Kinder,Greenplate等人2013)。为了赋予抗TNFα和IL1β双特异性抗体最佳的特性，将一系列Fc突变(包括E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434S突变和G236缺失)引入表4中列出的许多抗TNFα和IL-1β双特异性抗体中。此组突变包括增强抗体对蛋白水解降解的抗性的Fc突变，连同延长抗体半衰期的M428L/N434S突变和消除ADCC和CDC效应子功能的L234A/L235A突变。为了研究用这些Fc突变工程化的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体是否对蛋白水解降解具有改善的抗性，使一组具有不同IgG1Fc突变的抗体在37℃下经受半小时的重组IgG蛋白酶IdeZ(NewEnglandBiolabs)消化，然后在还原条件下进行SDS-PAGE分析以评估重链的完整性。观察到用E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434SFc突变工程化并缺失了G236的抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO14434x14578具有完整的抗TNFα重链条带和抗IL-1β重链条带，它们在凝胶上具有靠近的迁移(图15)。类似地，具有相同组的Fc突变的其亲本抗体TAVO14434和TAVO14578也对IdeZ的蛋白水解降解有抗性。然而，抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x7378(它在其IgG1Fc中没有突变)和TAVO11934x12178(它在其IgG1Fc中具有L234A、L235A、M428L、N434S(AALS)突变)均不能抵抗IdeZ的消化，并且抗TNFα重链条带和抗IL-1β重链条带二者均消失(图15)。这表明E233P、L234A、L235AFc突变和G236缺失可以促进抗TNFα和IL-1β双特异性抗体对IdeZ降解的抗性。除了IgG蛋白酶IdeZ，还使具有不同IgG1Fc突变的相同组的抗体在37℃下经受24小时的重组基质金属蛋白酶3MMP3(EnzoLifeSciences)消化，然后在还原条件下进行SDS-PAGE以评估重链的完整性。观察到抗TNFα重链在MMP3消化后保持完整，不管它的IgG1Fc是否具有蛋白水解抗性突变(图15)。然而，抗IL-1β重链条带在TAVO3334x7378(它在其IgG1Fc中没有突变)中消失，但是在TAVO14434x14578(它是用E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434SFc突变工程化并缺失了G236的抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体)和TAVO11934x12178(它在其IgG1Fc中具有L234A、L235A、M428L、N434S(AALS)突变)中保持完整(图15)。这表明需要在铰链区下的Fc突变以促进抗TNFα和IL-1β双特异性抗体对MMP3降解的抗性。在HEK-Blue报告测定中评价这些广泛的Fc突变是否可以影响抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的功能活性。如图13所示，TAVO14434x14578、TAVO167127x14578、TAVO169127x14578、TAVO167128x14578和TAVO169128x14578(它们全部均用E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434SFc突变工程化并缺失了G236)可以以全功效和与没有此类突变的相应的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体类似的效力剂量依赖性地抑制由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活。实施例9：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体在胶原抗体诱导的关节炎模型中的体内功效在胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型中评价抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332在炎症中的功效(Moore,Allden等人,2014)。通过施用抗胶原单克隆抗体混合物和随后施用脂多糖(LPS)建立CAIA模型。CAIA的特征在于类似于在RA中观察到的炎症、关节翳形成和骨侵蚀。据报道，CAIA病理学是TNFα和IL-1β依赖性的，同时已经证明用抗TNFα或抗IL1β抗体阻断可改善病理学(Bendele,Chlipala等人,2000)。由于抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332不能中和小鼠TNFα活性(即使对小鼠TNFα具有良好的结合亲和力)，因此使用希腊的Biomedcode提供的Tg1278/TNFKO小鼠进行研究。Tg1278/TNFKO小鼠缺乏鼠TNFα并且对于在正常生理对照下表达的人TNFα转基因的多个拷贝是杂合的。Tg1278/TNFKO小鼠表现出正常的发育，并且没有明显的病理学。在8至10周龄Tg1278/TNFKO雄性小鼠中诱导CAIA，所述小鼠在第0天接受腹膜内注射(i.p.)致关节炎抗体混合物(ArthritoMab,MDBiosciences)，然后在第3天接受i.p.注射LPS。在CAIA诱导后，每周两次给药PBS或3种剂量浓度的TAVO3334x5332(1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg)，持续两周。测量关节炎的临床得分、四肢的组织病理学和体重，并且将其作为读出收集。研究结果表明到诱导后第14天，PBS处理组显示明显增加的体内关节炎得分，这证明了关节炎病理学的诱导。与阴性对照PBS处理组相比，用1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的TAVO3334x5332处理以剂量依赖性方式抑制关节炎表型(图16，左侧小图)。到给药后第14天，与PBS关节炎得分相比，10mg/kg、5mg/kg和1mg/kg剂量分别将关节炎得分抑制了65％、32％和17％。此外，与用PBS处理的小鼠(其经14天显示出显著的7％体重减轻)相比，用TAVO3334x5332给药的小鼠显示出最小的体重减轻(图16，右侧小图)。总体而言，研究结果提供了TAVO3334x5332在Tg1278/TNFKO小鼠中诱导的CAIA模型中有预防关节炎症状的治疗效果的证据。实施例10：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体在膝关节炎症模型中的体内功效还开发了膝关节炎症小鼠模型以评价抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178在正常小鼠中的体内功效。在将连续分泌的来自转染的小鼠NIH3T3细胞的人TNFα和IL-1β注射到其中一个膝关节后诱导此模型中的关节炎症，因为人TNFα和IL-1β二者均可以激活小鼠中的同源受体以诱导炎症。此模型允许研究抗TNFα和IL-1β抗体，所述抗体可以中和人细胞因子的作用，但是缺乏与鼠细胞因子的交叉反应性。对于此模型的开发，将衍生自DBA-1小鼠背景的鼠成纤维细胞细胞系NIH3T3用表达人TNFα或IL-1β的构建体转染，并且因此建立了稳定表达这两种细胞因子中任一种的两种NIH3T3细胞系。通过ELISA试剂盒(Biolegend)定量从已建立的稳定细胞系分泌的人TNFα和IL-1β的量。观察到一百万个NIH3T3:hTNFα细胞可以在24小时的时间段内分泌10-30nghTNFα，同时已建立的NIH3T3:hIL1β细胞可以分泌5-10nghIL-1β。此外，在这些细胞因子的HEK-Blue报告测定(Invivogen)中，从稳定的NIH3T3细胞系分泌的TNFα和IL-1β二者均可以激活报告基因表达，这确认了两种分泌的细胞因子的功能活性。为了评估已建立的细胞系在诱导膝关节炎症中的效用，将1x104、5x104或25x104个NIH3T3:hTNFα细胞或NIH3T3:hIL-1β细胞注射到9-10周龄的雄性DBA-1小鼠的右膝中，同时为左膝注射相当数量的NIH3T3亲本细胞。在细胞注射后每天对两个膝关节进行卡尺测量持续三天，并且将细胞因子诱导的膝关节炎症定量为处理右膝与未处理左膝之间的卡尺测量值差异。观察到在细胞注射后三天的时间里，从注射的细胞分泌的hTNFα和hIL-1β二者均可以以细胞数量依赖性方式诱导膝关节炎症增加(图17)。为了研究抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178及其相关的亲本抗体的体内功效，将这些测试制品连同同种型对照抗体一起腹膜内给药至DBA-1小鼠，两小时后，向小鼠给予关节内(IA)注射5x104个NIH3T3:hTNFα细胞与5x104个NIH3T3:hIL-1β细胞的混合物至右膝关节，以及10x104个NIH3T3亲本细胞至左膝关节作为对照。在第-1天以及注射后第1天、第2天和第3天，对双膝进行卡尺测量，并且将膝关节炎症定量为处理右膝与未处理左膝之间的卡尺测量值差异。观察到与同种型对照组相比，以10mg/kg给药的TAVO11934x12178显著地抑制由人TNFα和IL-1β诱导的膝关节炎症(图18A)。通过曲线下面积(AUC)计算，与同种型对照抗体处理的膝(AUC＝0.72±0.06mmx天数)相比，到第3天在TAVO11934x12178双特异性抗体处理的膝中的肿胀显著地(p值<0.005)降低(AUC＝0.25±0.05mmx天数)(图18B)。然而，当以5mg/kg(其与双特异性抗体的摩尔浓度相当)给药时的亲本抗TNFα抗体TAVO11934和亲本抗IL-1β抗体TAVO12178二者均不能诱导与双特异性抗体TAVO11934x12178相同程度的膝关节炎症抑制(TAVO11934的AUC＝0.52±0.18mmx天数，并且TAVO12178的AUC＝0.43±0.06mmx天数)，尽管抑制相对于同种型对照处理的小鼠仍然是显著的(图18A，图18B)。除了膝关节炎症，还观察到用抗TNFα和抗IL-1β抗体给药的小鼠具有最小的体重减轻，而用同种型对照抗体处理的小鼠显示出更显著的体重减轻(图18C)。这些结果证明抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178可以中和人TNFα和人IL-1β二者在诱导膝关节炎症中的生物活性，而单独的抗TNFα抗体或抗IL-1β抗体可以仅通过阻断两种细胞因子中的仅一种而显示出部分功效。序列本文提供了本文提供的实施方案中包括的某些序列的代表性列表。表5.序列参考文献Aggarwal,B.B.(2003).\"SignallingpathwaysoftheTNFsuperfamily:adouble-edgedsword.\"NatRevImmunol3(9):745-756.BendeleA.M.,E.S.Chlipala,J.Scherrer,et.al.,(2002)“Combinationbenefitoftreatmentwiththecytokineinhibitorsinterleukin-1receptorantagonistandpegylatedsolubletumornecrosisfactorreceptortypeIinanimalmodelsofrheumatoidarthritis”.ArthritisRheumatol.43(12):2648-2659.Bolt,S.,E.Routledge,I.Lloyd,L.Chatenoud,H.Pope,S.D.Gorman,M.ClarkandH.Waldmann(1993).\"Thegenerationofahumanized,non-mitogenicCD3monoclonalantibodywhichretainsinvitroimmunosuppressiveproperties.\"EurJImmunol23(2):403-411.Chu,S.Y.,I.Vostiar,S.Karki,G.L.Moore,G.A.Lazar,E.Pong,P.F.Joyce,D.E.SzymkowskiandJ.R.Desjarlais(2008).\"InhibitionofBcellreceptor-mediatedactivationofprimaryhumanBcellsbycoengagementofCD19andFcgammaRIIbwithFc-engineeredantibodies.\"MolImmunol45(15):3926-3933.Dall'Acqua,W.F.,P.A.KienerandH.Wu(2006).\"PropertiesofhumanIgG1sengineeredforenhancedbindingtotheneonatalFcreceptor(FcRn).\"JBiolChem281(33):23514-23524.Erekat,N.andM.D.Al-Jarrah(2018).\"Interleukin-1BetaandTumorNecrosisFactorAlphaUpregulationandNuclearFactorKappaBActivationinSkeletalMusclefromaMouseModelofChronic/ProgressiveParkinsonDisease.\"MedSciMonit24:7524-7531.Feldmann,M.,F.M.Brennan,E.Paleolog,A.Cope,P.Taylor,R.Williams,J.WoodyandR.N.Maini(2004).\"Anti-TNFalphatherapyofrheumatoidarthritis:whatcanwelearnaboutchronicdisease？\"NovartisFoundSymp256:53-69；discussion69-73,106-111,266-109.Gram,H.(2016).\"PreclinicalcharacterizationandclinicaldevelopmentofILARIS((R))(canakinumab)forthetreatmentofautoinflammatorydiseases.\"CurrOpinChemBiol32:1-9.Hess,A.,R.Axmann,J.Rech,S.Finzel,C.Heindl,S.Kreitz,M.Sergeeva,M.Saake,M.Garcia,G.Kollias,R.H.Straub,O.Sporns,A.Doerfler,K.BruneandG.Schett(2011).\"BlockadeofTNF-alpharapidlyinhibitspainresponsesinthecentralnervoussystem.\"ProcNatlAcadSciUSA108(9):3731-3736.Hezareh,M.,A.J.Hessell,R.C.Jensen,JG.VandeWinkelandP.W.Parren.(2001).“EffectorfunctionactivitiesofapanelofmutantsofabroadlyneutralizingantibodyagainsthumanimmunodeficiencyvirusType1.”JVirol.75(24):1261-8.Hinton,P.R.,J.M.Xiong,M.G.Johlfs,M.T.Tang,S.KellerandN.Tsurushita(2006).\"AnengineeredhumanIgG1antibodywithlongerserumhalf-life.\"JImmunol176(1):346-356.Huang,C.C.,C.H.Chiou,S.C.Liu,S.L.Hu,C.M.Su,C.H.TsaiandC.H.Tang(2019).\"MelatoninattenuatesTNF-alphaandIL-1betaexpressioninsynovialfibroblastsanddiminishescartilagedegradation:Implicationsforthetreatmentofrheumatoidarthritis.\"JPinealRes66(3):e12560.Issafras,H.,J.A.Corbin,I.D.GoldfineandM.K.Roell(2013).\"Detailedmechanisticanalysisofgevokizumab,anallostericanti-IL-1betaantibodywithdifferentialreceptor-modulatingproperties.\"JPharmacolExpTher348(1):202-215.Jani,M.,W.G.DixonandH.Chinoy(2018).\"Drugsafetyandimmunogenicityoftumournecrosisfactorinhibitors:thestorysofar.\"Rheumatology57(11):1896-1907.Kaymakcalan,Z.,P.Sakorafas,S.Bose,S.Scesney,L.Xiong,D.K.Hanzatian,J.SalfeldandE.H.Sasso(2009).\"Comparisonsofaffinities,avidities,andcomplementactivationofadalimumab,infliximab,andetanerceptinbindingtosolubleandmembranetumornecrosisfactor.\"ClinImmunol131(2):308-316.Kinder,M.,A.R.Greenplate,K.D.Grugan,K.L.Soring,K.A.Heeringa,S.G.McCarthy,G.Bannish,M.Perpetua,F.Lynch,R.E.Jordan,W.R.Strohl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aactctttaagggccgaggacaccgccgtgtacttctgcgctcgtaat300cgttacgaccccccttggtttgtggactggggccaaggtactttagtgacagtgagcagc360gccagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg420ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg480tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca540ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc600tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagccc660aaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggggga720ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccct780gaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactgg840tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac900agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaag960gagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc1020aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggag1080atgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatc1140gccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg1200ctggactccgacggctccttcttcctctacagcagactcaccgtggacaagagcaggtgg1260cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg1320cagaagagcctctccctgtctccgggtaaa1350<210>62<211>642<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码EAC32的多核苷酸序列<400>62gacatccagatgacccagagcacatcctctttatccgccagcgtgggcgacagagtgacc60atcacttgtcgtgccagccaagatatcagcaactatttaagctggtaccagcagaagccc120ggcaaggccgtgaagctgctgatctactacaccagcaagctgcacagcggcgtgcctagc180agattcagcggcagcggaagcggcaccgactacactttaaccatcagctctttacagcaa240gaagacttcgccacctacttctgtttacaaggtaagatgctgccttggaccttcggccaa300ggtaccaagctggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca360tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctat420cccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccag480gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacg540ctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggc600ctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt642当前第1页12当前第1页12
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：距离第一种抗TNFalpha(TNFα)单克隆抗体(mAb)被批准用于减轻患有甲氨蝶呤难治性(methotrexate-refractive)类风湿性关节炎的患者的炎症，已经过去二十多年(Mantzaris2016，Moots,Curiale等人2018)。目前，存在几种被批准用于治疗炎性障碍的抗TNFα单克隆抗体。尽管在类风湿性关节炎、炎性肠病和多种自发性炎性障碍中取得成功，但仍然存在证据充分的与抗TNFα生物制剂的使用相关的风险(Taylor2010)。除了输注反应，还报告了其他严重不良事件，诸如血栓栓塞事件、狼疮样综合征、血管炎样事件和其他自身免疫问题(Jani,Dixon等人2018)。还看到增加的感染、增加的淋巴瘤和其他血液恶性肿瘤的风险、病毒引起的癌症、充血性心力衰竭和脱髓鞘事件。例如，在接受长期抗TNFα疗法的患者中通常报告结核病、水痘带状疱疹(varicella-zoster)(水痘(chickenpox))和带状疱疹(herpeszoster/shingles)的再激活。还发现了恶化的军团病的病例，以及包括新型流感和腺病毒感染在内的严重急性呼吸道病毒感染的报告。虽然并未完全理解或建立这些毒性中的一些的因果关系，但高度认可关于这些全身性安全问题，应谨慎使用抗TNFα生物制剂。鉴于现代个性化医学的时代，开发具有不同效力和安全性特征的新型药剂将允许这些疗法在患有不同炎性病症的患者中进行更好的剂量调整和最佳的使用。这尤其重要，因为目前的抗TNFα生物制剂很少带给患者完全和可持续的无疾病缓解，尽管有初始反应。事实上，有多达三分之一的通过抗TNFα生物制剂治疗的患者的反应不好(Owczarczyk-Saczonek,Owczarek等人2019)。虽然并不完全清楚确切的基本原理，但需要开发新型抗TNFα或组合抗细胞因子疗法以解决这些挑战，尤其是为了更好地鉴定和管理无反应者，开发阻断TNFR信号传导的选择性方面的更具选择性且有效的抗TNFα药剂，以及更好地递送这些药剂以保证TNFα在非患病组织中的正常生理效应。本公开文本解决了这种和其他需求。技术实现要素：本公开文本提供了具有特异性结合并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(IL-1β)二者的双重特异性的双特异性抗体及其抗原结合片段。可以通过本公开文本的双特异性抗体或其片段中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰的TNFα和IL-1β的活性包括(但不是通过限制的方式)中和其受体的TNFα和IL-1β激活等。作为非限制性例子，本公开文本提供了表4中列出的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体，所述双特异性抗体采用具有不同IgGFc的表2中列出的抗TNFα抗体和表3中列出的抗IL-1β抗体的组合。本公开文本提供了包含编码表4中列出的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体的多核苷酸序列的多核苷酸。本公开文本还提供了特异性结合肿瘤坏死因子α(TNFα)并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰肿瘤坏死因子α(TNFα)的至少一种活性的单克隆抗体及其抗原结合片段。可以通过本公开文本的抗体或其片段中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰的TNFα的活性包括(但不是通过限制的方式)中和其受体的TNFα激活等。作为非限制性例子，本公开文本提供了表2中列出的具有不同IgGFc的单克隆抗TNFα抗体。本公开文本还提供了包含编码表2中列出的单克隆抗TNFα抗体的多核苷酸序列的多核苷酸。本公开文本提供了特异性结合人白细胞介素1β(IL-1β)并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰人白细胞介素1β(IL-1β)的至少一种活性的单克隆抗体及其抗原结合片段。可以通过本公开文本的抗体或其片段中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰的IL-1β的活性包括(但不是通过限制的方式)中和其受体IL-1RI的IL-1β激活等。作为非限制性例子，本公开文本提供了表3中列出的具有不同IgGFc的单克隆抗IL-1β抗体。本公开文本还提供了包含编码表3中列出的单克隆抗IL-1β抗体的多核苷酸序列的多核苷酸。本公开文本还提供了一种通过受控的Fab臂交换从两种亲本抗体中产生对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体的方法，其中在一种亲本抗体上具有F405LFc突变并且在另一种亲本抗体上具有K409RFc突变。作为非限制性例子，本公开文本提供了一种通过受控的Fab臂交换产生表4中列出的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体采用具有不同IgGFc的表2中列出的抗TNFα抗体和表3中列出的抗IL-1β抗体的组合。本公开文本还提供了检测抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的形成的方法。所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体可以是全长IgG1、IgG2、IgG3、IgG4抗体，或者可以仅包含包括Fab、F(ab')2或scFv片段在内的抗原结合部分。可以修饰抗体骨架以影响功能，例如以消除残留的效应子功能。本公开文本还提供了当与野生型抗体相比时，具有延长的半衰期的抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体。通过将抗体的CH2和CH3结构域用选自以下的任一组突变工程化可以实现当与亲本野生型抗体相比时半衰期的延长：M252Y/S254T/T256E、M428L/N434S、T250Q/M428L、N434A和T307A/E380A/N434A，根据EU索引进行残基编号。本公开文本还提供了对在残基222-237(EU编号)之间或所述残基处切割野生型抗体的蛋白酶的蛋白水解降解具有增强的抗性的抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体。通过在缺失了G236的铰链区中用E233P/L234A/L235A突变工程化可以实现当与亲本野生型抗体相比时对蛋白水解降解的抗性，根据EU索引进行残基编号。本公开文本还提供了包含本公开文本的多核苷酸的载体。本公开文本还提供了包含本公开文本的载体的宿主细胞。本公开文本还提供了一种产生本公开文本的抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体的方法，所述方法包括在表达所述抗体的条件下培养本公开文本的宿主细胞，以及纯化所述抗体。本公开文本还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本公开文本的抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体以及药学上可接受的载体。本公开文本还提供了检测所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体的结合的方法。本公开文本还提供了通过所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体阻断TNFα和IL-1β与其受体的结合的方法。本公开文本还提供了通过所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体中和TNFα和IL-1β对其受体的功能活性的方法。本公开文本还提供了调节所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体的半衰期的方法。本公开文本还提供了调节所述抗TNFα和抗IL-1β单克隆抗体和双特异性抗体对蛋白水解降解的抗性的方法。本公开文本还提供了一种治疗自身免疫性/炎性疾病的方法。本公开文本还提供了本文提供的双特异性抗体在治疗所述自身免疫性/炎性疾病的方法中的用途；以及本文提供的双特异性抗体在制造用于所述自身免疫性/炎性疾病的药剂中的用途。受试者的示例性自身免疫性和/或炎性疾病包括但不限于以下：类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、骨关节炎、强直性脊柱炎、白塞病、痛风、银屑病性关节炎、多发性硬化症、克罗恩结肠炎和炎性肠病，包括施用治疗有效量的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体。本公开文本还提供了一种治疗糖尿病、神经病、眼病、皮肤病的方法。本公开文本还提供了本文提供的双特异性抗体在治疗糖尿病、神经病、眼病和皮肤病的方法中的用途；以及本文提供的双特异性抗体在制造用于此类糖尿病、神经病、眼病和皮肤病的药剂中的用途。受试者的示例性疾病包括但不限于：II型糖尿病、帕金森病、年龄相关性黄斑变性、多神经病变、感觉周围神经病变、增生性糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变、压疮、暴发性1型糖尿病、视网膜血管炎、非感染性后葡萄膜炎、酒精中毒性神经病变，包括施用治疗有效量的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体。本公开文本还提供了一种治疗癌症的方法。本公开文本还提供了本文提供的双特异性抗体在治疗癌症的方法中的用途；以及本文提供的双特异性抗体在制造用于癌症的药剂中的用途。受试者的示例性癌症包括但不限于：多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、急性髓性白血病、女性乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和腹膜癌，包括施用治疗有效量的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体。调节TNFα和IL-1β二者可以改变肿瘤微环境，并且对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体和针对免疫肿瘤学靶标(诸如PD1)的抗体的组合使用可以提供治疗癌症的更有效的治疗功效。本公开文本还提供了一种治疗受试者的其他疾病和炎性病症的方法，所述其他疾病和炎性病症包括但不限于：慢性乙型肝炎、麻风病、萎缩性甲状腺炎、小肠肠病、坐骨神经病变和伤口愈合，所述方法包括施用治疗有效量的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体。本公开文本还提供了本文提供的双特异性抗体在治疗此类其他疾病和炎性病症的方法中的用途；以及本文提供的双特异性抗体在制造用于此类其他疾病和炎性障碍的药剂中的用途。附图说明图1：抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332的重链和轻链氨基酸序列。图2：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334的重链和轻链氨基酸序列。图3：抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332的重链和轻链氨基酸序列。图4：左侧两小图：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332的SDS-PAGE分析。右侧两小图：TAVO167127x14578、TAVO169127x14578、TAVO167128x14578和TAVO169128x14578(它们是用E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434SFc突变工程化并缺失了G236的抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体)以及相应的亲本抗体TAVO167127、TAVO169127、TAVO167128、TAVO169128和TAVO14578的SDS-PAGE分析。图5：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332与抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332(左列)以及抗TNFαIgG1抗体TAVO11934、抗IL-1βIgG1抗体TAVO12178与抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO11934x12178(右列)的阳离子交换色谱曲线。图6：展示与TNFα和IL-1β二者具有双重结合的抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332的形成的ELISA测定。图7：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332与人、恒河猴和小鼠TNFα的结合。图8：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332与人、恒河猴和小鼠IL-1β的结合。图9：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332中和人、恒河猴和小鼠TNFα对WEHI细胞的细胞毒性活性。图10：抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332中和人、恒河猴和小鼠IL-1β驱动的IL-6从激活的MRC-5细胞中释放。图11：TNFα和IL-1β的HEK-Blue报告测定的原理的示意图(左侧小图)和在通过TNFα、IL-1β和TNFα/IL-1β刺激后报告基因表达的反应(右侧小图)。图12：在HEK-Blue报告测定中，抗TNFαIgG1抗体TAVO3334、抗IL-1βIgG1抗体TAVO5332以及抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332中和TNFα、IL-1β和TNFα/IL-1β驱动的报告基因激活。图13：在HEK-Blue报告测定中，抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x7378、TAVO11934x12032、TAVO11934x12178、TAVO14434x14578、TAVO167127x14578、TAVO169127x14578、TAVO167128x14578和TAVO169128x14578中和TNFα/IL-1β驱动的报告基因激活。图14：具有半衰期延长Fc突变的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12032和TAVO11934x12178以及缺乏此类突变的TAVO3334x5332和TAVO3334x7378在pH6.0下与小鼠FcRn的结合。图15：在通过IgG蛋白酶IdeZ和基质金属蛋白酶3(MMP3)消化后，具有蛋白水解降解抗性Fc突变的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO14434x14578及其亲本抗体TAVO14434和TAVO14578以及缺乏此类突变的TAVO3334x7378和TAVO11934x12178的重链完整性的SDS-PAGE分析。图16：在使用Tg1278/TNFKO小鼠的CAIA模型中，抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO3334x5332在抑制关节炎表型方面的作用。左侧小图：测试化合物对实验Tg1278/TNFKO小鼠的关节炎得分的影响。到研究结束时，处理组中的平均关节炎疾病严重程度得分如下：PBS＝9.8±1.0，TAVO3334x53321mg/kg＝8.1±1.1，TAVO3334x53325mg/kg＝6.6±0.9，并且TAVO3334x533210mg/kg＝3.5±0.5；右侧小图：测试化合物对Tg1278/TNFKO小鼠的平均体重的影响。处理组中的平均体重如下：PBS＝21.7±0.2g，TAVO3334x53321mg/kg＝22.8±0.8g，TAVO3334x53325mg/kg＝23.5±0.06g，并且TAVO3334x533210mg/kg＝23.1±0.8g。误差条指示平均值的标准误差。图17A和图17B：通过将表达人TNFα或人IL-1β的NIH3T3细胞关节内注射到DBA-1小鼠的膝关节中诱导的膝关节肿胀。将1x104、5x104或25x104个NIH3T3:hTNFα细胞或NIH3T3:hIL-1β细胞注射到9-10周龄的雄性DBA-1小鼠的右膝中，同时为左膝注射相当数量的NIH3T3亲本细胞。在细胞注射后每天对两个膝关节进行卡尺测量，持续三天。对于NIH3T3:hTNFα细胞(图17A)或NIH3T3:hIL-1β细胞(图17B)，关节肿胀的变化表示为如由卡尺测量的右处理膝与左对照膝之间的平均差异。图18A、图18B和图18C：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178及其相关亲本抗体在正常小鼠中对膝关节肿胀的抑制。在第0天，在将炎性细胞混合物关节内注射到右膝或将对照细胞关节内注射到左膝前2小时，为雄性DBA-1小鼠腹膜内给药10mg/kg抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178、5mg/kg抗TNFα抗体TAVO11934和5mg/kg同种型对照抗体的混合物、5mg/kg抗IL-1β抗体TAVO12178和5mg/kg同种型对照抗体的混合物、或10mg/kg同种型对照抗体。炎性细胞由5x104个NIH3T3:hTNFα和5x104个NIH3T3:hIL-1β细胞组成，而对照细胞由10x104个NIH3T3细胞组成。在第-1天和注射后第1天、第2天、第3天对处理膝和对照膝进行卡尺测量。关节肿胀的变化表示为如由卡尺测量的右处理膝与左对照膝之间的平均差异(图18A)和3天内的平均AUC值(图18B)。也显示了动物到处理后第3天的体重变化(图18C)。结果表示平均值±平均值的标准误差，n＝3只小鼠/组。显著性指示为**，并且p值<0.005。具体实施方式定义将在本说明书中引用的所有出版物(包括但不限于披露文本和披露申请)仿佛完全阐述那样通过引用并入本文。应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在是限制性的。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在用于测试本公开文本的实践中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但本文描述了示例性的材料和方法。在描述和要求保护本公开文本时，将使用以下术语。除非上下文另有明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求中所用的，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，对“一种/一个细胞”的提及包括两种/个或更多种/个细胞的组合，等等。“抗体”意在是广义的，并且包括免疫球蛋白分子，包括单克隆抗体(包括鼠、人、人源化和嵌合单克隆抗体)、抗体片段、双特异性或多特异性抗体、二聚、四聚或多聚抗体、单链抗体、结构域抗体；以及免疫球蛋白分子的包含所需特异性的抗原结合位点的任何其他修饰构型。“全长抗体分子”由通过二硫键相互连接的两条重链(HC)和两种轻链(LC)以及其多聚体(例如IgM)组成。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(由结构域CH1、铰链、CH2和CH3组成)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR区段构成，按照以下顺序从氨基至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。“互补决定区(CDR)”是抗体中的“抗原结合位点”。CDR可以使用多种术语定义：(i)互补决定区(CDR)(VH中的三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)和VL中的三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3))是基于序列变异性(Wu等人(1970)JExpMed132:211-50；Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,马里兰州贝塞斯达,1991)。(ii)“高变区”、“HVR”或“HV”(VH中的三个(H1、H2、H3)和VL中的三个(L1、L2、L3))是指如通过Chothia和Lesk所定义的在结构上高度可变的抗体可变结构域的区域(Chothia等人(1987)JMolBiol196:901-17)。国际免疫遗传学(InternationalImMunoGeneTics，IMGT)数据库(http://www_imgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。在CDR、HV与IMGT描绘之间的对应关系描述于Lefranc等人(2003)DevCompImmunol27:55-77中。除非在本说明书中另有明确说明，否则如本文所用的术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括通过同上(Kabat、Chothia或IMGT)所述的任一种方法所定义的CDR。可以将免疫球蛋白根据重链恒定区氨基酸序列分配至五个主要类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步细分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以将任何脊椎动物物种的抗体轻链基于其恒定区的氨基酸序列分配至两种明显不同的类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))之一。“抗体片段”是指这样的免疫球蛋白分子部分，其保留重链和/或轻链抗原结合位点(诸如重链互补决定区(HCDR)1、2和3，轻链互补决定区(LCDR)1、2和3)、重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)。抗体片段包括熟知的Fab、F(ab')2、Fd和Fv片段以及由一个VH结构域组成的结构域抗体(dAb)。VH和VL结构域可以经由合成接头连接在一起以形成多种类型的单链抗体设计，其中VH/VL结构域可以分子内配对或在VH和VL结构域由单独的单链抗体构建体表达的情况下分子间配对以形成一价抗原结合位点，诸如单链Fv(scFv)或双抗体；例如描述于国际披露公开号WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804和WO1992/01047中。“单克隆抗体”是指这样的抗体群体，其中在每条重链和每条轻链中具有单一氨基酸组成，除了可能的熟知的改变，诸如从抗体重链去除C末端赖氨酸。单克隆抗体通常结合一个抗原表位，除了双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可以在抗体群体内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，或者一价的、二价的或多价的。双特异性抗体包括在术语单克隆抗体内。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体或抗体片段。“分离的抗体”涵盖被分离至更高纯度的抗体，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的抗体。“人源化抗体”是指这样的抗体，其中抗原结合位点衍生自非人物种并且可变区框架衍生自人免疫球蛋白序列。人源化抗体可以包括在框架中的取代，使得框架可以不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。“人抗体”是指具有这样的重链和轻链可变区的抗体，其中框架和抗原结合位点二者均衍生自人来源的序列并且优化为当向人类受试者施用时具有最小的免疫反应。如果抗体含有恒定区或恒定区的一部分，则恒定区也衍生自人来源的序列。除非另有明确说明，否则在整个说明书中氨基酸残基在抗体恒定区中的编号是根据EU索引，如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,马里兰州贝塞斯达(1991)中所述。本文使用常规的单字母和三字母氨基酸密码，如表1所示。表1本文提供的多肽、核酸、融合蛋白和其他组合物可以涵盖与本文提供的氨基酸序列或DNA序列具有所述的百分比同一性的多肽、核酸、融合蛋白等。术语“同一性”是指如通过比对并且比较两种或更多种多肽分子或者两种或更多种核酸分子的序列所确定的所述序列之间的关系。“百分比同一性”、“百分比同源性”、“序列同一性”或“序列同源性”等意指在比较的分子中氨基酸之间或核苷酸之间的相同残基的百分比，并且基于所比较的最小的分子的尺寸计算。对于这些计算，优选地通过特定的数学模型或计算程序(即，“算法”)解决比对中的空位(如果有的话)。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括以下文献中所述的那些：ComputationalMolecularBiology,(Lesk,A.M.编辑),1988,纽约:OxfordUniversityPress；BiocomputingInformaticsandGenomeProjects,(Smith,D.W.编辑),1993,纽约:AcademicPress；ComputerAnalysisofSequenceData,第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑),1994,新泽西州:HumanaPress；vonHeinje,G.,1987,SequenceAnalysisinMolecularBiology,纽约:AcademicPress；SequenceAnalysisPrimer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑),1991,纽约:M.StocktonPress；以及Carillo等人,1988,SIAMJ.AppliedMath.48:1073。在计算百分比同一性时，通常以得到各序列间最大匹配的方式比对所比较的序列。哺乳动物IgG重链的恒定区域序列按顺序指定为CH1-铰链-CH2-CH3。IgG的“铰链”、“铰链区”或“铰链结构域”通常被定义为包括Glu216并且在人IgG1的Pro230处终止，根据EU索引；但是在功能上，链的柔性部分可以被认为包括称为上铰链区和下铰链区的另外的残基(诸如从Glu216至Gly237)，并且下铰链指的是Fc区的残基233至239，FcγR结合通常归因此处。其他IgG同种型的铰链区可以通过放置第一个和最后一个半胱氨酸残基从而形成重链间S-S键来与IgG1序列对齐。尽管如根据EU索引编号的边界可以略微变化，但CH1结构域与VH结构域相邻并且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端，并且包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基末端)恒定区，例如从约EU位置118-215。Fc结构域从氨基酸231延伸到氨基酸447；CH2结构域从约Ala231至Lys340或Gly341；并且CH3从约Gly341或Gln342至Lys447。CH1区的IgG重链恒定区的残基在Lys处终止。含Fc结构域的分子至少包含抗体恒定区的CH2和CH3结构域，并且因此至少包含IgG重链恒定区的从约Ala231至Lys447的区域。含Fc结构域的分子可以任选地包含至少部分铰链区。“表位”是指抗体特异性结合的抗原部分。表位通常由化学活性(诸如极性、非极性或疏水性)表面分组的部分(诸如氨基酸或多糖侧链)组成，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以由形成构象空间单元的连续和/或不连续的氨基酸构成。对于不连续的表位，通过蛋白质分子的折叠，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸在三维空间中近距离靠近。抗体“表位”取决于用于鉴定表位的方法。如本文所用的“前导序列”包括可以由哺乳动物细胞处理的任何信号肽，包括人B2M前导序列。此类序列是本领域熟知的。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸以及具有经修饰的肽骨架的多肽。所述术语还包括具有多肽的共翻译(例如，信号肽切割)和翻译后修饰的多肽，所述修饰例如像二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解切割等。此外，如本文所用，“多肽”是指包括对天然序列的修饰(诸如缺失、添加和取代(如应是本领人员已知的在本质上通常是保守的))的蛋白质，只要蛋白质维持所需活性即可。这些修饰可能是刻意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(诸如通过产生蛋白质的宿主的突变、或由于PCR扩增或其他重组DNA方法引起的错误)。如本文所用的描述核酸分子的术语“重组”意指基因组、cDNA、病毒、半合成和/或合成来源的多核苷酸，所述多核苷酸凭借其来源或操纵不与其在自然界中与之缔和的多核苷酸序列的全部或一部分缔和。如关于蛋白质或多肽所用的术语“重组”是指通过重组多核苷酸的表达产生的多肽。如关于宿主细胞或病毒所用的术语“重组”是指已经引入了重组多核苷酸的宿主细胞或病毒。在本文中也使用重组来指代关于这样的材料(例如，细胞、核酸、蛋白质或载体)，所述材料已经通过引入异源材料(例如，细胞、核酸、蛋白质或载体)进行修饰。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，包括核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。此术语仅指代分子的一级结构。“载体”是指能够在生物系统内被复制或可以在此类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有这样的元件(诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记)，其发挥功能以便于在利用能够复制载体的生物组分的生物系统(诸如细胞、病毒、动物、植物)和重构的生物系统中复制或维持这些多核苷酸。载体多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA分子、cDNA或这些的杂交体。“表达载体”是指这样的载体，其可以在生物系统或重构的生物系统中用于指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列编码的多肽的翻译。“价”是指指定数量的对抗原具有特异性的结合位点在分子中的存在。因此，术语“一价”、“二价”、“四价”和“六价”分别是指一个、两个、四个和六个对抗原具有特异性的结合位点在分子中的存在。如本文所用，关于核酸序列、蛋白质或多肽所用的术语“异源”意指这些分子不天然存在于衍生出异源核酸序列、蛋白质或多肽的细胞中。例如，编码插入不是人细胞的细胞中的人多肽的核酸序列是在该特定的背景下的异源核酸序列。然而，异源核酸可以衍生自不同的生物体或动物物种，此类核酸不需要衍生自异源的单独的生物体物种。例如，在一些情况下，合成的核酸序列或由其编码的多肽对于引入它的细胞可能是异源的，因为细胞先前不含合成的核酸。因此，合成的核酸序列或由其编码的多肽对人细胞可以被认为是异源的，例如，即使合成的核酸序列或由其编码的多肽的一种或多种组分最初衍生自人细胞。如本文所用，“宿主细胞”表示以单细胞实体培养的体内或体外真核细胞或来自多细胞生物体(例如，细胞系)的细胞，所述真核细胞可以被用作或已经被用作核酸(例如，包含编码本公开文本的多聚多肽的核苷酸序列的表达载体)的受体，并且包括已经由核酸进行遗传修饰的原始细胞的后代。应理解，由于天然、偶然或刻意突变，单个细胞的后代的形态或者基因组或总DNA互补体可能不一定与原始亲本完全相同。“重组宿主细胞”(也称为“遗传修饰的宿主细胞”)是已经引入异源核酸(例如，表达载体)的宿主细胞。例如，凭借将异源核酸(例如，对真核宿主细胞外源的外来核酸或通常在真核宿主细胞中不存在的重组核酸)引入合适的真核宿主细胞中来对遗传修饰的真核宿主细胞进行遗传修饰。“特异性结合(specificbinding)”或“特异性结合(specificallybinds)”或“结合”是指与其他抗原相比，抗体与特异性抗原以更大的亲和力结合。通常，当结合的平衡解离常数(KD)是约1×10-8M或更小，例如约1×10-9M或更小、约1×10-10M或更小、约1×10-11M或更小或者约1×10-12M或更小，通常KD是与非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)结合的KD的至少一百分之一时，抗体“特异性结合”。可以使用标准程序测量KD。如本文所有，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得所需的药理和/或生理作用。所述作用就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不利影响而言可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物(例如，人)的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在可能易患疾病但尚未被诊断为患有所述疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即遏止其发展；以及(c)缓解疾病，即导致疾病消退。在本文中可互换使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于鼠(例如，大鼠、小鼠)、兔类动物(例如，兔)、非人灵长类动物、人、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如，马、牛、绵羊、猪、山羊)等。“治疗有效量”或“有效量”是指当施用至哺乳动物或其他受试者用于治疗疾病时足以影响对于疾病的这种治疗的一种药剂的量或两种药机的合并量。“治疗有效量”将根据一种或多种药剂、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。在进一步描述本公开文本之前，应理解，本公开文本并不限于所描述的特定实施方案，因为此类实施方案当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在是限制性的，因为本公开文本的范围将仅受所附权利要求的限制。抗TNFα抗体由于其抗肿瘤细胞特性而最初发现的肿瘤坏死因子α(TNFα)后来已经被证明可介导炎症反应和调节免疫功能(Aggarwal2003)。TNFα由巨噬细胞、免疫细胞和粒细胞产生，并且在细胞表面上表达为膜蛋白，所述膜蛋白经由ADAM-17的蛋白水解切割而被迅速释放。可溶性TNFα的活性形式是经由两种受体TNFRI和TNFRII进行信号传导的同三聚体。虽然TNFα的正常功能是有益的，但不受控制的TNFα的过量产生可能导致慢性疾病(Feldmann,Brennan等人2004)。英夫利昔单抗(cA2)是由Centocor/Janssen开发的由人轻链和重链恒定结构域以及鼠轻链和重链可变结构域组成的嵌合抗体。已经证明英夫利昔单抗可以高特异性和亲和力结合TNFα，从而中和TNFα的生物功能。英夫利昔单抗已经完成临床试验，并且获得了克罗恩病(1998)、类风湿性关节炎(1999)、强直性脊柱炎(2004)、银屑病性关节炎(2005)、溃疡性结肠炎(2005)、斑块型银屑病(2006)的监管批准。特别地，在类风湿性关节炎中英夫利昔单抗的作用机制已经是证据充分的(Monaco,Nanchahal等人2015)。由Abbott/Abbvie开发的阿达木单抗(D2E7)是由通过噬菌体展示技术优化的人重链和轻链可变结构域组成的工程化的人单克隆抗体。阿达木单抗的作用机制与英夫利昔单抗非常类似(Kaymakcalan,Sakorafas等人2009)。从2002年开始，阿达木单抗已经被批准用于与英夫利昔单抗相同的适应症，外加多关节型幼年特发性关节炎、化脓性汗腺炎和葡萄膜炎。培赛利珠单抗(CDP-870)是由UCB开发的靶向TNFα的抗体片段。它是由与分别与人重链CH1和轻链恒定结构域附接的人可变框架序列相互拼接的鼠重链和轻链可变序列组成的人源化的Fab片段。附接聚乙二醇部分以延长分子的血清半衰期。非常像英夫利昔单抗和阿达木单抗，培赛利珠单抗结合TNFα并且中和TNFα的作用，然而它缺乏Fc结构域并且因此缺乏Fc依赖性延长的半衰期和潜在的细胞裂解。从2008年开始，培赛利珠单抗已经获得了克罗恩病、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、强直性脊柱炎和斑块型银屑病的监管批准。JanssenBiotech开发了第四种抗TNFα戈利木单抗它是在人抗体转基因小鼠中产生的全人抗体(Shealy,Cai等人2010)。戈利木单抗具有与英夫利昔单抗、阿达木单抗和培赛利珠单抗类似的作用机制。戈利木单抗在2009年获得了类风湿性关节炎、银屑病性关节炎和强直性脊柱炎的初步监管批准，并且在2013年获得了溃疡性结肠炎的进一步批准。作为具有特异性结合并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(IL-1β)二者的双重特异性的双特异性抗体及其抗原结合片段的一部分，本文描述了特异性结合肿瘤坏死因子α(TNF-α)并且中和TNF-α对其受体的功能活性的人单克隆抗体和抗原结合片段。可以通过本公开文本的抗体或其片段中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰的TNFα的活性包括(但不是通过限制的方式)中和其受体的TNFα激活等。在一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段可以通过与直接参与TNFα的靶向活性的TNFα的表位结合来中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰TNFα的活性。在另一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段可以通过与不直接参与TNFα的靶向活性的TNFα的表位结合来中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰TNFα的活性，但是与其结合的抗体或片段在空间上或在构象上抑制、阻断、消除、降低或干扰TNFα的靶向活性。在又另一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段与不直接参与TNFα的靶向活性的TNFα的表位结合(即，非阻断抗体)，但是与其结合的抗体或片段导致TNFα的清除增强。作为非限制性例子，本公开文本提供了九个抗TNFα抗体重链可变结构域序列，指定为ADA-H、ADA-H1、ADA-H1X、ADA-H2、ADA-H2X、ADA-H3、ADA-H3X、ADAH4、ADAH4X，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、NO.2、NO.3、NO4、NO5、NO6、NO7、NO8、NO9所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含含有与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8或9具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域的抗TNFα抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了三个抗TNFα抗体轻链可变结构域序列，指定为ADA-L、ADA-L1、ADA-L2，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.10、NO.11、NO.12所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含含有与SEQIDNO:10、11或12具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域的抗TNFα抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了具有含F405L突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H的抗TNFα抗体重链序列，指定为EAC33，其中氨基酸序列如SEQIDNO.13所示。本公开文本还提供了具有含L234A、L235A、F405L、M428L、N434S突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H、ADA-H1、ADA-H1X、ADA-H2、ADA-H2X、ADA-H3、ADA-H3X、ADA-H4、ADA-H4X的九个抗TNFα抗体重链序列，分别指定为EAC119、EAC129、EAC130、EAC131、EAC132、EAC133、EAC134、EAC135、EAC136，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.14、NO.15、NO.16、NO17、NO18、NO19、NO20、NO21、NO22所示。本公开文本还提供了具有含E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434S突变并缺失了G236的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H、ADA-H1X、ADA-H2X、ADA-H3X、ADA-H4X的五个抗TNFα抗体重链序列，分别指定为EAC144、EAC166、EAC167、EAC168、EAC169，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.23、NO.24、NO.25、NO26、NO27所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的重链氨基酸序列的抗TNFα抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了基于轻链可变结构域ADA-L、ADA-L1、ADA-L2的抗TNFα抗体轻链序列，分别指定为EAC34、EAC127、EAC128，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.28、NO29、NO30所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:28、29或30具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的轻链氨基酸序列的抗TNFα抗体。作为非限制性例子，通过将上述抗TNFα抗体重链序列和抗TNFα抗体轻链序列配对，本公开文本提供了表2中列出的具有不同IgGFc的抗TNFα抗体，所述抗体采用不同重链可变结构域和不同轻链可变结构域的组合。表2.抗TNFα抗体抗IL-1β抗体IL-1β是充当感染和炎症期间外周免疫反应的介质的促炎细胞因子。IL-1β最初以前体肽(pro-IL-1β)的形式合成，所述前体肽被胱天蛋白酶-1以炎性体复合物形式切割，并且被分泌到细胞外间隙中。IL-1β可以由多种细胞类型释放。存在两种IL-1受体IL-1RI和IL-1RII。IL-1β通过受体IL-1RI对靶细胞发挥其作用。调节异常的IL-1β活性是自身免疫性疾病所特有的，并且可能由于细胞因子的异常增加或IL-1RI内源性拮抗剂的定性或定量缺陷而发生。IL-1β特别牵涉在几种自发性炎性疾病中。卡那单抗(Ilaris，ACZ885)是由Novartis开发的靶向白细胞介素1β的人单克隆抗体。其作用模式是基于IL-1β信号传导的中和。在2009年卡那单抗被批准用于治疗过冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)，并且随后在2016年被批准用于三种另外的罕见且严重的自发性炎性疾病(Gram2016)。吉伏珠单抗(Gevokizumab)(XOMA052)是由XOMA开发的另一种靶向IL-1β的单克隆抗体。声称吉伏珠单抗是调节性治疗抗体，其通过降低对其IL-1RI:IL-1RAcP信号传导复合物的亲和力来调节IL-1β生物活性(Issafras,Corbin等人2013)。近年来，已经发现IL-1β与动脉粥样硬化斑块发展的几个步骤以及其他心血管疾病改变形式相关(McCarty和Frishman2014)。假设这些炎性化学品可能阻止心脏从先前心脏病发作的损伤中康复。在2017年，卡那单抗的III期临床试验显示心脏病发作、中风和心血管疾病的合并死亡降低15％。此外，所述试验还显示了肺癌发病率和死亡率的显著降低。作为具有特异性结合并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(IL-1β)二者的双重特异性的双特异性抗体及其抗原结合片段的一部分，本文描述了特异性结合人白细胞介素1β(IL-1β)并且中和IL-1β对其受体IL-1RI的功能活性的新型人单克隆抗体和抗原结合片段。在一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段可以通过与直接参与IL-1β的靶向活性的IL-1β的表位结合来中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰IL-1β的活性。在另一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段可以通过与不直接参与IL-1β的靶向活性的IL-1β的表位结合来中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰IL-1β的活性，但是与其结合的抗体或片段在空间上或在构象上抑制、阻断、消除、降低或干扰IL-1β的靶向活性。在又另一个实施方案中，本公开文本的抗体或其片段与不直接参与IL-1β的靶向活性的IL-1β的表位结合(即，非阻断抗体)，但是与其结合的抗体或片段导致IL-1β的清除增强。作为非限制性例子，本公开文本提供了三个抗IL-1β抗体重链可变结构域序列，指定为Ab5H3、Ab8H1、Ab9H1，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.31、NO.32、NO.33所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含含有与SEQIDNO:31、32或33具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域的抗IL-1β抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了三个抗IL-1β抗体轻链可变结构域序列，指定为Ab5L、Ab8L3、Ab9L1，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.34、NO.35、NO.36所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含含有与SEQIDNO:34、35或36具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域的抗IL-1β抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了具有含K409R突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab5H3、Ab8H1、Ab9H1的三个抗IL-1β抗体重链序列，指定为EAC53、EAC73、EAC80，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.37、NO.38、NO.39所示。本公开文本还提供了具有含L234A、L235A、K409R、M428L、N434S突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab5H3和Ab8H1的两个抗IL-1β抗体重链序列，指定为EAC120和EAC121，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.40和NO.41所示。本公开文本还提供了具有含E233P、L234A、L235A、K409R、M428L、N434S突变并缺失了G236的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab8H1和Ab9H1的两个抗IL-1β抗体重链序列，指定为EAC145和EAC161，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.42和NO.43所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:37、38、39、40、41、42或43具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的重链氨基酸序列的抗IL-1β抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了基于轻链可变结构域Ab5L、Ab8L3、Ab9L1的三个抗IL-1β抗体轻链序列，指定为EAC32、EAC78、EAC83，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.44、NO.45、NO.46所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:44、45或46具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的轻链氨基酸序列的抗IL-1β抗体。作为非限制性例子，通过将上述抗IL-1β抗体重链序列和抗IL-1β抗体轻链序列配对，本公开文本提供了表3中列出的具有不同IgGFc的示例性抗IL-1β抗体，所述抗体采用不同重链可变结构域和不同轻链可变结构域的组合。表3.抗IL1β抗体本公开文本还提供了本文提供的抗IL1β和抗TNFα抗体的混合物。例如，本公开文本提供了包含任一种或多种本文提供的抗IL1β抗体与任一种或多种本文提供的抗TNFα抗体的组合物。例如，在实施方案中，本公开文本提供了包含含有重链可变结构域和轻链可变结构域的抗IL1β抗体或其片段以及对TNFα具有特异性的抗体或其片段的组合物，所述重链可变结构域包含与SEQIDNO:31、32或33具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述轻链可变结构域包含与SEQIDNO:34、35或36具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％序列同一性或100％序列同一性的氨基酸序列。在实施方案中，本公开文本还提供了使用抗体的此类混合物的方法。抗TNFα和IL-1β双特异性抗体双特异性抗体是在制药行业的新发展，并且它们可以识别两种不同的靶标，在本质上通常是加性的或协同的(Labrijn,Janmaat等人2019)。这种双重特异性允许两种不同信号传导途径的同时抑制以及不同致病介质的双重靶向。这种方法可能会改善针对自身免疫性疾病以及其他炎性病症的治疗选择。双特异性抗体或片段可以具有几种构型。例如，双特异性抗体可以类似单个抗体(或抗体片段)，但是具有两个不同的抗原结合位点(可变区)，并且可以是二价的或一价的。多种双特异性抗体形式是普通技术人员已知的。双特异性抗体形式包括例如全IgG样双特异性抗体(诸如使用本文所述的受控的Fab臂交换技术产生的那些)、杵臼(knob-in-hole)抗体、抗体、具有一个Fc区和两个scFv部分的scFv2-Fc双特异性抗体(例如，ADAPTIRTM)、基于双特异性T细胞接合器(BiTE)的抗体(诸如BiTE/ScFv2)、基于双亲和重靶向抗体(DART)的双特异性抗体(包括具有或不具有Fc部分的DART结合区)、DNL-Fab3双特异性抗体、scFv-HAS-scFv双特异性抗体和DVD-Ig双特异性抗体。TNFα和IL-1β二者是充当感染和炎症期间外周免疫反应的介质的促炎细胞因子。然而，TNFα和IL-1β二者的过量产生与许多类型的医学问题的起始和进展相关，所述医学问题包括：自身免疫性/炎性疾病；糖尿病、神经病、眼病、皮肤病病症；多种类型的癌症；内分泌功能障碍；以及正常伤口愈合的破坏。因此，中和TNFα和IL-1β二者的活性可以为这些炎性疾病或由过量的TNFα和IL-1β引起的任何其他障碍提供治疗方法。本公开文本汇集了在特定细胞类型中可以提供双重TNFα和IL-1β细胞因子中和的新重新工程化的双重特异性的抗TNFα和IL-1β抗体。此外，应用于新型双特异性抗体的另外的抗体工程化经由对FcR的不同亲和力还提供了改变的体内半衰期、更好的安全性特征以及效应子功能。这为可能会具有不同需求的患有不同炎性病症的患者不仅提供了功效的协同作用，而且还提供了更好的剂量调整。因此，本公开文本提供了具有特异性结合并中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(IL-1β)二者的双重特异性的双特异性抗体及其抗原结合片段。可以通过本公开文本的双特异性抗体或其片段中和、抑制、阻断、消除、降低或干扰的TNFα和IL-1β的活性包括(但不是通过限制的方式)中和其受体的TNFα和IL-1β激活等。作为非限制性例子，本公开文本提供了由九个抗TNFα抗体重链可变结构域序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述九个抗TNFα抗体重链可变结构域序列指定为ADA-H、ADA-H1、ADA-H1X、ADA-H2、ADA-H2X、ADA-H3、ADA-H3X、ADAH4、ADAH4X，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、NO.2、NO.3、NO4、NO5、NO6、NO7、NO8、NO9所示。在实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合片段包含含有与SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8或9具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的抗TNFα抗体重链可变结构域。作为非限制性例子，本公开文本提供了由三个抗TNFα抗体轻链可变结构域序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述三个抗TNFα抗体轻链可变结构域序列指定为ADA-L、ADA-L1、ADA-L2，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.10、NO.11、NO.12所示。在实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合片段包含含有与SEQIDNO:10、11或12具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的抗TNFα抗体轻链可变结构域。作为非限制性例子，本公开文本提供了由具有含F405L突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H的抗TNFα抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述抗TNFα抗体重链序列指定为EAC33，其中氨基酸序列如SEQIDNO.13所示。本公开文本还提供了由具有含L234A、L235A、F405L、M428L、N434S突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H、ADA-H1、ADA-H1X、ADA-H2、ADA-H2X、ADA-H3、ADA-H3X、ADA-H4、ADA-H4X的九个抗TNFα抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述九个抗TNFα抗体重链序列分别指定为EAC119、EAC129、EAC130、EAC131、EAC132、EAC133、EAC134、EAC135、EAC136，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.14、NO.15、NO.16、NO17、NO18、NO19、NO20、NO21、NO22所示。本公开文本还提供了由具有含E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434S突变并缺失了G236的IgG1Fc的基于重链可变结构域ADA-H、ADA-H1X、ADA-H2X、ADA-H3X、ADA-H4X的五个抗TNFα抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述五个抗TNFα抗体重链序列分别指定为EAC144、EAC166、EAC167、EAC168、EAC169，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.23、NO.24、NO.25、NO26、NO27所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的重链氨基酸序列的双特异性抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了由基于轻链可变结构域ADA-L、ADA-L1、ADA-L2的抗TNFα抗体轻链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述抗TNFα抗体轻链序列分别指定为EAC34、EAC127、EAC128，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.28、NO29、NO30所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:28、29或30具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的轻链氨基酸序列的双特异性抗体。作为非限制性例子，通过将上述抗TNFα抗体重链序列和抗TNFα抗体轻链序列配对，本公开文本提供了由表2中列出的具有不同IgGFc的抗TNFα抗体构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述抗体采用不同重链可变结构域和不同轻链可变结构域的组合。作为非限制性例子，本公开文本提供了由三个抗IL-1β抗体重链可变结构域序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述三个抗IL-1β抗体重链可变结构域序列指定为Ab5H3、Ab8H1、Ab9H1，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.31、NO.32、NO.33所示。在实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合片段包含含有与SEQIDNO:31、32或33具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的抗IL-1β抗体重链可变结构域。作为非限制性例子，本公开文本提供了由三个抗IL-1β抗体轻链可变结构域序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述三个抗IL-1β抗体轻链可变结构域序列指定为Ab5L、Ab8L3、Ab9L1，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.34、NO.35、NO.36所示。在实施方案中，所述双特异性抗体和抗原结合片段包含含有与SEQIDNO:34、35或36具有至少约80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的抗IL-1β抗体轻链可变结构域。作为非限制性例子，本公开文本提供了由具有含K409R突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab5H3、Ab8H1、Ab9H1的三个抗IL-1β抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述三个抗IL-1β抗体重链序列指定为EAC53、EAC73、EAC80，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.37、NO.38、NO.39所示。本公开文本还提供了由具有含L234A、L235A、K409R、M428L、N434S突变的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab5H3和Ab8H1的两个抗IL-1β抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述两个抗IL-1β抗体重链序列指定为EAC120和EAC121，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.40和NO.41所示。本公开文本还提供了由具有含E233P、L234A、L235A、K409R、M428L、N434S突变并缺失了G236的IgG1Fc的基于重链可变结构域Ab8H1和Ab9H1的两个抗IL-1β抗体重链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述两个抗IL-1β抗体重链序列指定为EAC145和EAC161，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.42和NO.43所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:37、38、39、40、41、42或43具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的重链氨基酸序列的双特异性抗体。作为非限制性例子，本公开文本提供了由基于轻链可变结构域Ab5L、Ab8L3、Ab9L1的三个抗IL-1β抗体轻链序列构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述三个抗IL-1β抗体轻链序列指定为EAC32、EAC78、EAC83，其中氨基酸序列分别如SEQIDNO.44、NO.45、NO.46所示。在实施方案中，本公开文本提供了包含与SEQIDNO:44、45或46具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％序列同一性的轻链氨基酸序列的双特异性抗体。作为非限制性例子，通过将上述抗IL-1β抗体重链序列和抗IL-1β抗体轻链序列配对，本公开文本提供了由表3中列出的具有不同IgGFc的抗IL-1β抗体构成的双特异性抗体和抗原结合片段，所述抗体采用不同重链可变结构域和不同轻链可变结构域的组合。作为非限制性例子，本公开文本提供了表4中列出的对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体，所述双特异性抗体采用具有不同IgGFc的表2中列出的抗TNFα抗体和表3中列出的抗IL-1β抗体的组合。表4.抗TNFα和IL-1β双特异性抗体抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的组合物本公开文本的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体涵盖保留与TNFα和IL-1β二者特异性结合的能力的抗原结合片段。如本文所用的抗原结合片段可以包括抗体的任何3个或更多个连续氨基酸(例如，4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、8个或更多个或甚至10个或更多个连续氨基酸)，并且涵盖Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)片段，或单独的轻链或重链可变区或其部分。这些片段缺乏完整抗体的Fc片段，从循环中清除地较快，并且与完整抗体相比可以具有更少的非特异性组织结合。这些片段可以使用熟知的方法从完整抗体产生，例如通过用酶(诸如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段))进行蛋白水解切割而产生。TNFα和IL-1β结合片段还可以涵盖由重链抗体(HCAb)的VH结构域组成的结构域抗体(dAb)片段。在骆驼科动物中发现的免疫球蛋白的一些同种型中存在常规抗体的H2L2结构的例外。功能性VHH可以通过直接克隆来自免疫的骆驼科动物的B细胞的VHH基因从而产生重组VHH而通过免疫的骆驼科动物的HCAb的蛋白水解切割获得，或者从天然或合成文库获得。具有所需抗原特异性的VHH也可以通过噬菌体展示方法获得。TNFα和IL-1β结合片段还可以涵盖双抗体，所述双抗体是这样的二价抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但是使用足够短以致不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。TNFα和IL-1β结合片段还可以涵盖与TNFα和IL-1β二者结合的单链抗体片段(scFv)。scFv包含与抗体轻链可变区(VL)可操作地连接的抗体重链可变区(VH)，其中重链可变区和轻链可变区一起或单独地形成结合TNFα和IL-1β的结合位点。此类TNFα和IL-1β结合片段可以通过本领域已知的方法和由氨基酸Gly和Ser构成的柔性蛋白质接头制备，所述方法例如像抗体分子的重链和轻链可变部分的合成或PCR介导的扩增。克隆所得的DNA片段以用于在大肠杆菌(E.coli)或哺乳动物细胞中表达。从宿主细胞中纯化表达的TNFα和IL-1β结合片段。本公开文本的TNFα和IL-1β结合抗体和片段涵盖包含两条重链和两条轻链的全长抗体。TNFα和IL-1β结合抗体可以是人抗体或人源化抗体。人源化抗体包括嵌合抗体和CDR移植抗体。嵌合抗体是包括与人恒定区连接的非人抗体可变区的抗体。CDR移植抗体是包括与来自人“受体”抗体的框架区连接的来自非人“供体”抗体的CDR的抗体。示例性人抗体或人源化抗体包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD抗体。本发明的抗体可以属于任何类别(IgG、IgM、IgE、IgGA、IgD等)或同种型，并且可以包含κ或λ轻链。例如，人抗体可以包含IgGFc结构域，诸如同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的至少一种。在一些情况下，IgGFc结构域包含与作为SEQIDNO:47的IgG1Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，IgGFc结构域包含与作为SEQIDNO:48的IgG2Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，IgGFc结构域包含与作为SEQIDNO:49的IgG3Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，IgGFc结构域包含与作为SEQIDNO:50的IgG4Fc序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。可以将S228P突变做到IgG4抗体中以增强IgG4稳定性。本发明的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体可以包含经修饰的Fc区，其中经修饰的Fc区相对于野生型Fc区包含至少一个氨基酸修饰。在一些实施方案中，本发明的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体提供有经修饰的Fc区，其中在生物环境中当与亲本野生型抗体相比时，修饰天然存在的Fc区以延长抗体的半衰期，例如血清半衰期或通过体外测定测量的半衰期。可以单独或组合做出的示例性突变是T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A和H435R突变。在某些实施方案中，通过在作为SEQIDNO:51的IgG1Fc中用M252Y/S254T/T256E突变工程化可以实现半衰期的延长，根据EU索引进行残基编号(Dall'Acqua,Kiener等人2006)。在某些实施方案中，通过在作为SEQIDNO:52的IgG1Fc中用M428L/N434S突变工程化也可以实现半衰期的延长(Zalevsky,Chamberlain等人2010)。在某些实施方案中，通过在作为SEQIDNO:53的IgG1Fc中用T250Q/M428L突变工程化也可以实现半衰期的延长(Hinton,Xiong等人2006)。在某些实施方案中，通过在作为SEQIDNO:54的IgG1Fc中用N434A突变工程化也可以实现半衰期的延长(Shields,Namenuk等人2001)。在某些实施方案中，通过在作为SEQIDNO:55的IgG1Fc中用T307A/E380A/N434A突变工程化也可以实现半衰期的延长(Petkova,Akilesh等人2006)。可以在小鼠的PK研究中评价相对于具有天然IgGFc的抗体Fc工程化对抗体的半衰期延长的影响。在一些实施方案中，本发明的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体提供有经修饰的Fc区，其中修饰天然存在的Fc区以增强抗体对在残基222-237(EU编号)之间或所述残基处切割野生型抗体的蛋白酶的蛋白水解降解的抗性。在某些实施方案中，通过在缺失了G236的铰链区中用E233P/L234A/L235A突变工程化可以实现当与作为SEQIDNO:56的亲本野生型抗体相比时对蛋白水解降解的抗性，根据EU索引进行残基编号(Kinder,Greenplate等人2013)。在不需要效应子功能的情况下，可以进一步工程化本公开文本的抗体以在抗体Fc中引入至少一个突变，所述至少一个突变降低抗体与激活Fcγ受体(FcγR)的结合和/或降低Fc效应子功能(诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP))。可以突变以降低抗体与激活FcγR的结合并且随后降低效应子功能的Fc位置是例如以下文献中所述的那些：(Xu,Alegre等人2000)(Vafa,Gilliland等人2014)(Bolt,Routledge等人1993)(Chu,Vostiar等人2008)(Shields,Namenuk等人2001)。具有最小的ADCC、ADCP、CDC、Fc介导的细胞激活的Fc突变也已经被描述为IgG1、IgG2和IgG4的σ突变(Tam,McCarthy等人2017)。可以单独或组合做出的示例性突变是在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的K214T、E233P、L234V、L234A、G236缺失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S和P331S突变。可以做出以降低ADCC的示例性组合突变是在IgG1上的L234A/L235A、在IgG2上的V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、在IgG4上的F234A/L235A、在IgG4上的S228P/F234A/L235A、在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上的N297A、在IgG2上的V234A/G237A、在IgG1上的K214T/E233P/L234V/L235A/G236缺失/A327G/P331A/D365E/L358M、在IgG2上的H268Q/V309L/A330S/P331S、在IgG1上的S267E/L328F、在IgG1上的L234F/L235E/D265A、在IgG1上的L234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、在IgG4上的S228P/F234A/L235A/G237A/P238S和在IgG4上的S228P/F234A/L235A/G236缺失/G237A/P238S。也可以使用杂交体IgG2/4Fc结构域，诸如具有来自IgG2的残基117-260和来自IgG4的残基261-447的Fc。进一步包含保守修饰的本公开文本的抗体在本公开文本的范围内。“保守修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。保守取代是氨基酸被具有类似侧链的氨基酸残基替代的那些。具有类似侧链的氨基酸残基的家族是定义明确的，并且包括具有以下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳香族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂肪族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基也可以被丙氨酸取代，如先前已经针对丙氨酸扫描诱变所述。对本公开文本的抗体的氨基酸取代可以通过已知方法(例如通过PCR诱变)进行(美国公开号4,683,195)。可替代地，可以例如使用编码11种氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)的随机(NNK)或非随机密码子(例如，DVK密码子)产生变体文库。可以使用本文所述的测定来测试所得抗体变体的特征。本公开文本的抗体可以通过诸如糖基化、异构化、去糖基化或非天然存在的共价修饰(诸如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂化)等过程进行翻译后修饰。此类修饰可以在体内或在体外发生。例如，本公开文本的抗体可以与聚乙二醇缀合(PEG化)，以改善其药代动力学特征。缀合可以通过本领域技术人员已知的技术进行。已经证明治疗性抗体与PEG的缀合可增强药效学同时不干扰功能。可以修饰本公开文本的抗体以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或在本公开文本的范围内的其他所希望的生物或生物物理特性。抗体的稳定性受到多种因素的影响，所述因素包括(1)影响其固有稳定性的单独结构域的核心填充；(2)对HC和LC配对产生影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用；(3)掩埋极性和带电残基；(4)极性和带电残基的H键合网；以及(5)在其他分子内和分子间力之间的表面电荷和极性残基分布(Worn和Pluckthun2001)。可以基于抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定潜在的结构不稳定残基，并且可以通过在所鉴定的残基中产生和评价具有突变的变体来测试所述残基对抗体稳定性的影响。增加抗体稳定性的方法之一是提高如通过差示扫描量热法(DSC)测量的热转化中点(Tm)。通常，蛋白质Tm与其稳定性相关并且与其对在溶液中解折叠和变性以及依赖于蛋白质解折叠的趋势的降解过程的易感性逆相关。许多研究已经发现了如通过DSC测量为热稳定性的配制品的物理稳定性与通过其他方法测量的物理稳定性的排名之间的相关性。配制品研究表明FabTm对相应mAb的长期物理稳定性具有影响。本公开文本的抗体可以在Fc区中具有氨基酸取代，所述氨基酸取代可以改善制造和药物稳定性。IgG1的例子是在铰链221-DKTHTC-226中的H224S(或H224Q)(Eu编号)，其彻底阻断诱导的切割；并且对于IgG4，S228P突变阻断半抗体交换。本公开文本的抗体可以包含另外的氨基酸序列，所述另外的氨基酸序列可以用作抑制性结构域以在识别和结合至其抗原方面掩盖抗体，并且因此抗体以无活性或前抗体存在。可以通过经由例如位点特异性蛋白酶去除抑制性结构域序列，将前抗体转化为活性抗体。无活性前抗体可以全身地具有降低的毒性，但是可以在蛋白酶丰富的疾病位点处激活以达到治疗效果。抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的产生从在IgGFc中分别具有F405L和K409R(EU编号)突变的两种亲本抗体通过称为受控的Fab臂交换的方法产生双特异性抗体(Labrijn,Meesters等人2014)。受控的Fab臂交换反应是CH3结构域的二硫键异构化反应和解离-缔合的结果。首先，产生两种亲本抗体，一种携带F405LFc突变，并且一种携带K409RFc突变。还原亲本抗体的铰链区中的重链二硫键，并且分离亲本抗体的重链。相对于同二聚化，F405L和K409R突变有利于重链的异二聚化。因此，亲本抗体之一的所得的游离半胱氨酸与第二亲本抗体的半胱氨酸残基形成重链间二硫键。所得的产物是异二聚化的抗体，其中一半来自一种亲本抗体，并且另一半来自另一种亲本抗体。在本公开文本中，通过受控的Fab臂交换由具有F405LFc突变的针对TNFα的一种亲本抗体与具有K409RFc突变的针对IL-1β的另一种亲本抗体产生对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体。在本公开文本的亲本抗体上的F405L和K409R突变可以在人Fc、非人灵长类动物Fc、鼠Fc结构域等上工程化。在本公开文本的亲本抗体上的F405L和K409R突变可以在人IgG1Fc、人IgG2Fc、人IgG3Fc、人IgG4Fc等上工程化。在一些情况下，具有F405L突变的Fc结构域包含与作为SEQIDNO:57的具有F405L突变的IgG1Fc具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，具有K409R突变的Fc结构域包含与作为SEQIDNO:58的具有K409R突变的IgG1Fc具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。可以通过促进Fc异二聚化的其他Fc突变和工程化方法产生本公开文本的抗TNFαxIL1β双特异性抗体，所述方法包括但不限于杵臼和静电匹配的相互作用。在杵臼策略(参见例如，国际公开号WO2006/028936，通过引用并入)中，可以将在人IgG中形成CH3结构域的界面的选定的氨基酸在影响CH3结构域相互作用的位置处突变以促进异二聚体形成。将具有小侧链的氨基酸(臼)引入亲本抗体的一个Fc结构域中，并且将具有大侧链的氨基酸(杵)引入亲本抗体的另一个Fc结构域中。在两条重链共表达后，由于具有“臼”的重链与具有“杵”的重链的优先相互作用，形成异二聚体。形成杵和臼的示例性CH3取代对包括：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。在静电匹配的相互作用策略中，可以工程化突变以在一个CH3界面处产生带正电的残基并且在第二CH3界面处产生带负电的残基，如US2010/0015133A1；US2009/0182127A1；US2010/028637A1或US2011/0123532A1中所述。重链的异二聚化可以通过两个突变的Fc之间的静电匹配的相互作用形成。双特异性抗体的形成可以通过ELISA测定来评估。在本公开文本中，将IL-1β包被在ELISA板上，然后添加双特异性抗体和TNFα。在洗涤非特异性结合后，通过抗TNFα抗体然后通过HRP缀合的二抗检测TNFα的存在。由于只有双特异性抗体能够用双臂同时结合TNFα和IL1β时，因此通过ELISA信号反映双特异性抗体的形成。如果在两种亲本抗体的生物物理特性方面存在可检测的差异，则也可以通过分析型HPLC评估双特异性抗体的形成。pI的差异可以在阳离子交换色谱上产生两种亲本抗体的两个单独的峰，并且双特异性抗体可以迁移为之间的峰。疏水性的差异可以在疏水相互作用色谱上产生两种亲本抗体的两个单独的峰，并且双特异性抗体可以迁移为之间的峰。分析型HPLC不仅证明了双特异性抗体的形成，而且还允许定量形成的双特异性抗体的百分比。亲本抗TNFα和抗IL-1β抗体的表达和纯化本公开文本的抗TNFα和抗IL-1β亲本抗体和片段可以由单一核酸(例如，包含编码抗体的轻链和重链多肽的核苷酸序列的单一核酸)编码，或者由两种或更多种单独的核酸(其中的每种编码抗体或抗体片段的不同部分)编码。可以将核酸插入载体(例如，核酸表达载体和/或靶向载体)中。此类载体可以以多种方式使用，例如用于在细胞或转基因动物中表达抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或抗体片段。通常选择在将使用载体的宿主细胞中具有功能的载体。编码抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或片段的核酸分子可以在原核、酵母、昆虫(杆状病毒系统)和/或真核宿主细胞中扩增/表达。宿主细胞的选择将部分取决于抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或片段是否进行翻译后修饰(例如，糖基化和/或磷酸化)。如果是这样的话，优选酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。表达载体通常含有一种或多种以下组分：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、用于分泌的前导序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区和可选择标记元件。作为非限制性例子，本公开文本提供了包含SEQIDNO:59、60、61或62的多核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸序列分别编码抗TNFα抗体重链EAC33、抗TNFα抗体轻链EAC34、抗IL-1β抗体重链EAC53和抗IL-1β抗体轻链EAC32。在大多数情况下，在抗TNFα和抗IL-1β抗体或片段的N末端处工程化前导序列或信号序列以引导其分泌。抗TNFα和抗IL-1β抗体或片段从宿主细胞的分泌将导致信号肽从抗体或片段中去除。因此，成熟抗体或片段将缺乏任何前导序列或信号序列。在一些情况下，诸如在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化的情况下，可以操纵多种前序列以改善糖基化或产率。例如，可以改变信号肽的肽酶切割位点，或者添加也可能影响糖基化的前序列。本公开文本进一步提供了包含本公开文本的核酸或载体的细胞(例如，分离的或纯化的细胞)。所述细胞可以是能够用本公开文本的核酸或载体转化以便产生由此编码的多肽的任何类型的细胞。为了表达抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或片段，将如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中，使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。将核酸和载体引入分离的细胞中和转化的宿主细胞的体外培养和选择的方法是本领域已知的，并且包括使用氯化钙介导的转化、转导、缀合、三亲本杂交、DEAE、葡聚糖介导的转染、感染、与脂质体膜融合、用DNA包被的微弹高速轰击、直接显微注射至单个细胞和电穿孔。在将本公开文本的核酸或载体引入细胞中后，将细胞在适用于表达编码序列的条件下培养。然后可以从细胞中分离抗体、抗原结合片段或抗体的一部分。在某些实施方案中，可以将一起编码抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或其抗原结合片段的两种或更多种载体引入细胞中。已经分泌到细胞培养基中的抗TNFα和抗IL-1β结合抗体或片段的纯化可以使用多种技术完成，所述技术包括亲和、免疫亲和或离子交换色谱，分子筛色谱，制备型凝胶电泳或等电点聚焦，色谱聚焦和高压液相色谱。例如，可以通过用蛋白A(其选择性结合Fc区)的亲和色谱纯化包含Fc区的抗体。修饰形式的抗体或抗原结合片段可以用在其羧基或氨基末端处的亲和标签(诸如六组氨酸)或其他小肽(诸如FLAG或myc)制备，并且通过一步亲和柱纯化。例如，多组氨酸以高亲和力和特异性与镍结合，因此镍的亲和柱(诸如镍柱)可以用于纯化多组氨酸标记的选择性结合剂。在一些情况下，可以采用多于一个的纯化步骤。抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的结合和功能活性本公开文本涵盖与TNFα和IL-1β选择性结合的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体，因为它们以比对其他抗原更高的亲和力与TNFα和IL-1β结合。抗TNFα和IL-1β双特异性抗体和片段可以与人TNFα和IL-1β选择性结合，而且还与非人TNFα和IL-1β可检测地结合。例如，所述抗体或片段可以与啮齿动物TNFα和IL-1β、灵长类动物TNFα和IL-1β、犬TNFα和IL-1β、和兔TNFα和IL-1β、或豚鼠TNFα和IL-1β中的一种或多种结合。可替代地或另外地，TNFα和IL-1β结合抗体可以对重组人TNFα和IL-1β以及内源性人TNFα和IL-1β具有相同或基本上相同的效力。本领域详细描述了体外和基于细胞的测定用于确定TNFα和IL-1β与其受体的结合。例如，可以通过以下方式来确定TNFα和IL-1β与其受体的结合：固定TNFα和IL-1β结合抗体，用固定化的抗体鳌合TNFα和IL-1β，并且确定TNFα和IL-1β是否与抗体结合，并且使可溶性形式的受体与结合的TNFα和IL-1β/抗体复合物接触并且确定可溶性受体是否与复合物结合。所述方案还可以包括使可溶性受体与固定化的抗体接触，然后与TNFα和IL-1β接触，以确认可溶性受体不与固定化的抗体结合。可以使用仪器进行此方案以用于结合相互作用的动力学分析。还可以采用这种方案来确定抗体或其他分子是允许还是阻断TNFα和IL-1β与其受体的结合。对于其他结合测定，可以通过在存在或不存在TNFα和IL-1β抗体的情况下比较TNFα和IL-1β与受体的结合来确定允许或阻断TNFα和IL-1β与其受体的结合。在测定读出方面阻断被鉴定为与含有相应缓冲剂或稀释剂但是不含抗TNFα和IL-1β抗体的对照样品相比，在存在抗TNFα和IL-1β抗体的情况下TNFα和IL-1β与受体的结合的指定降低。测定读出可以定性地观察，以指示存在或不存在阻断，或者可以定量地观察，以指示由于抗体或片段的存在导致的结合降低的百分比或倍数。当TNFα和IL-1β结合双特异性抗体基本上阻断TNFα和IL-1β与受体的结合时，与在不存在所述抗体或片段的情况下相同浓度的TNFα和IL-1β与受体的结合相比，TNFα和IL-1β与受体的结合降低至少10倍、可替代地至少约20倍、可替代地至少约50倍、可替代地至少约100倍、可替代地至少约1000倍、可替代地至少约10000倍或更多。根据本公开文本的用于所述用途的优选的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体通常以高亲和力(例如，如用BIACORE确定的)(例如像对TNFα和IL-1β的平衡结合解离常数(KD)为约10nM或更小、约5nM或更小、约1nM或更小、约500pM或更小、或更优选地约250pM或更小、约100pM或更小、约50pM或更小、约25pM或更小、约10pM或更小、约5pM或更小、约3pM或更小、约1pM或更小、约0.75pM或更小、约0.5pM或更小或者约0.3pM或更小)与人TNFα和IL-1β结合。本公开文本的抗体或片段可以例如以约10nM或更小、约5nM或更小、约2nM或更小、约1nM或更小、约0.75nM或更小、约0.5nM或更小、约0.4nM或更小、约0.3nM或更小或甚至约0.2nM或更小的EC50与TNFα和IL-1β结合，如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)确定的。优选地，本公开文本的抗体或抗体片段不与除TNFα和IL-1β之外的任何靶标交叉反应。例如，本发明的抗体和片段可以与IL-1β结合，但是不与IL-1α可检测地结合，或者相对于与IL-1α的结合，在与IL-1β的结合方面具有至少约100倍(例如，至少约150倍、至少约200倍或甚至至少约250倍)的选择性。本公开文本还涵盖与TNFα和IL-1β结合的中和抗体或其中和片段，以便中和TNFα和IL-1β的生物活性。可以通过TNFα和IL-1β生物活性的一种或多种指标(诸如在报告测定中TNFα和IL-1β刺激的报告基因表达、TNFα和IL-1β刺激的IL-6从人成纤维细胞或其他细胞中的释放、TNFα和IL-1β诱导的T辅助细胞的增殖)的测定来评估TNFα和IL-1β的生物活性的中和。还可以通过小鼠关节炎模型在体内评估TNFα和IL-1β的生物活性的中和。优选地，本公开文本的TNFα和IL-1β结合抗体和片段中和与TNFα和IL-1β所结合的受体的信号传导功能联系的TNFα和IL-1β的生物活性。本发明的抗体或片段可以是与影响TNFα和IL-1β的生物活性的TNFα和IL-1β表位特异性结合的中和抗体或片段。本发明的抗体或片段可以与TNFα和IL-1β的中和敏感表位结合。当TNFα和IL-1β的中和敏感表位被本发明的抗体或片段之一结合时，结果是含有所述表位的TNFα和IL-1β的生物活性的丧失。药物组合物根据本公开文本的用于所述用途的TNFα和IL-1β结合抗体和抗体片段可以被配制为组合物，尤其是药物组合物，用于本文所述的方法。此类组合物包含治疗或预防有效量的本公开文本的TNFα和IL-1β结合抗体或抗体片段与合适的载体(例如，药学上可接受的药剂)的混合。通常，本公开文本的TNFα和IL-1β结合抗体和抗体片段被充分纯化以用于在被配制为药物组合物之前向动物施用。药学上可接受的药剂包括载体、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、助悬剂、溶剂、填充剂、疏松剂、缓冲剂、递送媒介物、张度剂、助溶剂、润湿剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂和表面活性剂。所述组合物可以呈液体形式或者冻干或冷冻干燥形式，并且可以包括一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或疏松剂。组合物可以适用于肠胃外施用。示例性组合物适用于通过熟练技术人员可用的任何途径(诸如关节内、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、病灶内、直肠内、经皮、口服和吸入途径)注射或输注到动物中。本文所述的药物组合物可以以在特定局部(local)环境中提供局部(local)浓度的产物(例如，推注、储库效应、局部(topical))持续释放和/或增加的稳定性或半衰期的方式被配制用于受控或持续递送。使用方法本公开文本提供了本文提供的双特异性抗TNFα和IL-1β抗体治疗将经历常规抗TNFα疗法或抗IL-1β疗法的患者的用途。示例性适应症包括类风湿性关节炎、炎性肠病和其他全身炎性病症。双特异性抗体增强每种单独的抗细胞因子疗法的反应性和/或最小化所述疗法的毒性。在实施方案中，与相应的单克隆抗体相比，可以以更低的有效剂量给予双特异性抗体，从而最小化潜在的毒性。此外，归功于具有最佳Fc工程化的双特异性抗TNFα和IL-1β抗体的较长半衰期的较低给药连同较不频繁给药可以导致较低的免疫原性风险，因此可能需要更长时间形成抗药物抗体。使用双重TNFα和IL-1β抑制剂抗体的考虑是从TNFα和IL-1β二者均具有强烈存在的疾病状态的数据挖掘获得的。下文描述了与两种细胞因子具有高靶标-疾病相关性的选定的例子(https://www.targetvalidation.org/)。在痛风中，已经证明尿酸可促进人单核细胞中的IL-1β分泌。还已知TNFα刺激诱导前IL-1βmRNA表达。Yokose等人证明了通过用TNFα引发人的嗜中性粒细胞，这将在痛风关节中促进尿酸介导的IL-1β分泌。因此，这些发现还指出了在患有痛风性关节炎的患者中这种双重TNFα和IL-1β抑制的效用(Yokose,Sato等人2018)。创伤后关节炎是严重关节创伤的常见继发性并发症。随着疾病的进展，它最终可能导致骨关节炎。在创伤后关节炎兔动物模型中，Tang等人表明同时沉默IL-1β和TNFα二者(经由RNA干扰)导致软骨损伤和关节退行性变大大减少。共治疗组还显示出与创伤关节损伤相关的症状的更大缓解(Tang,Hao等人2015)。因此，创伤后关节炎也将是此新型双特异性抗体的另一种关键适应症。此双重特异性抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的另一个重要的潜在用途是在伤口愈合方面。血管生成是伤口愈合的重要步骤，并且它受内皮细胞功能的影响。已知Cdc42在内皮细胞功能和血管发育中起关键作用。已经发现Cdc42的耗竭通过在伤口床中增加IL-1β和TNF-α的方式导致伤害愈合不良。通过同时阻断IL-1β和TNFα二者，这可能会使Cdc42的功能正常化，并且因此潜在地加快伤口愈合的速度(Xu,Lv等人2019)。此外，已经证明神经性疼痛(诸如坐骨神经痛)对抗TNFα疗法有反应(Hess,Axmann等人2011)。也已经证明老的TNF合成抑制剂姜黄素和沙利度胺可有效地降低神经性疼痛(Li,Zhang等人2013)。事实上，已知类风湿性关节炎患者在抗TNFα疗法后，在他们的关节损伤得到改善很久以前，他们很快感觉到好转(Taylor2010)。还已知细胞因子IL-1β是炎症和神经性疼痛的关键因子。因此，双重特异性抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的这种新型披露将在管理这种病症中具有巨大潜力。存在指向同时IL-1β和TNFα抑制的效用的许多其他文献资料。例如，帕金森病显示出具有升高组分的IL-1β和TNFα二者(Leal,Casabona等人2013，Erekat和Al-Jarrah2018)。另一方面，慢性乙型肝炎感染与来自IL-1β和TNFα增加的严重炎症相关(Lou,Hou等人2013，Wu,Kanda等人2016)。因此，双重特异性抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的这种新型披露可以为帕金森病和慢性乙型肝炎感染提供新型治疗方法。许多化学疗法或癌症靶向疗法已经与这样的病症相关，所述病症已知为主要经由升高的IL-1β和TNFα介导的癌症治疗相关症状(CTRS)。使用双重抑制剂来抑制这些细胞因子(诸如本公开文本)可以具有加快这些患者从痛苦中康复的潜力(Smith,Leo等人2014)。最后，还已经在乳腺癌中发现TNFα和IL-1β二者的升高(Martinez-Reza,Diaz等人2019)。事实上，已知炎性细胞因子(包括TNFα和IL-1β二者)存在于肿瘤微环境中以促进癌症生长和疾病进展(Kuratnik,Senapati等人2012，Kobayashi,Vali等人2016)。调节TNFα和IL-1β二者可能会改变肿瘤微环境。因此，本公开文本的针对TNFα和IL-1β二者的双特异性抗体也可以具有在癌症治疗中作为采用其他标准护理抗癌剂的辅助疗法的作用。此外，对TNFα和IL-1β二者具有双重特异性的双特异性抗体和针对免疫肿瘤学靶标(诸如PD1)的抗体的组合使用可以提供治疗不同类型的癌症的更有效的治疗功效。为了治疗神经障碍，可以采用Fc工程化以促进抗TNFα和IL-1β双特异性抗体对新生儿Fc受体(FcRn)的亲和力增加，然后这将允许跨越血脑屏障进行Ig-Ab胞吞转运(Sockolosky,Tiffany等人2012，Xiao和Gan2013)。同样，允许便利扩散到这些构建体中的蛋白质融合体可以增加跨越血脑屏障的转运。这将促进在CNS内治疗性抗体介导的TNFα和IL-1β中和用于脑内的炎性病症(诸如中风、阿尔茨海默病或其他慢性神经障碍)的潜力。除了治疗用途，本发明的抗体和片段还可以用于使用常规免疫测定(诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学)检测TNFα和IL-1β(例如，在生物样品诸如血清或血浆中)的诊断方法中。用于检测生物样品中的TNFα和IL-1β的方法可以包括以下步骤：使生物样品与一种或多种本发明的抗体或片段接触，以及检测与TNFα和IL-1β结合的抗体或片段或者未结合的抗体或片段，从而检测生物样品中的TNFα和IL-1β。所述抗体或片段可以用可检测物质直接或间接标记以促进结合或未结合的抗体的检测。合适的可检测物质包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。实施例提供以下实施例以更详细地描述本公开文本。它们旨在说明而非限制本公开文本。实施例1：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的产生通过称为受控的Fab臂交换的方法由两种亲本抗体(指定为TAVO3334的抗人TNFα抗体和指定为TAVO5332的抗人IL-1β抗体)产生针对TNFα和IL-1β二者的双特异性抗体，在本公开文本中指定为TAVO3334x5332(图1)。抗人TNFα抗体TAVO3334在其IgG1Fc中具有F405L突变(图2)并且抗人IL-1β抗体TAVO5332在其IgG1Fc中具有K409R突变(图3)，以促进双特异性抗体形成。为了产生亲本抗体，根据转染试剂盒说明书(ThermoScientific)，将编码TAVO3334和TAVO5332的重链和轻链的质粒共转染到Expi293F细胞中。转染后五天将细胞离心，并且使上清液通过0.2μm过滤器。通过在蛋白A琼脂糖柱(GEHealthcareLifeSciences)上的亲和层析纯化上清液中的表达的抗体。将纯化的抗体通过透析缓冲液交换到DPBS(pH7.2)中，并且通过280nm处的紫外吸光度确定蛋白质浓度。对于受控的Fab臂交换，将等摩尔量的两种亲本抗体混合在一起，并且在存在75mM2-巯基乙胺(2-MEA)的情况下还原5小时。将反应混合物针对DPBS透析以允许双特异性抗体形成。通过类似的过程，也通过受控的Fab臂交换产生了在这些实施例中采用的其他形式的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体。使亲本抗体TAVO5332和TAVO3334以及双特异性抗体TAVO3334x5332经受SDS-PAGE分析(图4)。在还原条件下，所有三种抗体均具有预期分子量的重链和轻链。在非还原条件下，所有三种抗体均迁移为具有大约150kDa分子量的主要蛋白质条带。也对TAVO167127x14578、TAVO169127x14578、TAVO167128x14578和TAVO169128x14578(它们是用E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434SFc突变工程化并缺失了G236的抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体)以及相应的亲本抗体TAVO167127、TAVO169127、TAVO167128、TAVO169128和TAVO14578进行了类似的SDS-PAGE分析。在还原和非还原条件下均获得预期的蛋白质条带，这表明这些广泛的Fc突变不会影响这些抗体的结构完整性(图4)。实施例2：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的形成的确认通过阳离子交换(CEX)色谱评估抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332的形成。将20μg的抗体加载到BioSCX离子交换柱(Agilent)上。TAVO3334的峰出现在6.841分钟处，而TAVO5332的峰出现在5.137分钟处(图5)。TAVO3334x5332的主要蛋白质条带的峰在5.936分钟处迁移。曲线下面积(AUC)的进一步计算表明97％的亲本抗体通过Fab臂交换形成双特异性抗体(图5)。类似地，当评估抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178和相关的亲本抗体时，TAVO11934的峰出现在6.861分钟处，而TAVO12178的峰出现在4.725分钟处(图5)。TAVO11934x12178的主要蛋白质条带的峰在5.783分钟处迁移。AUC的进一步计算表明96％的亲本抗体通过Fab臂交换形成TAVO11934x12178双特异性抗体(图5)。还通过基于ELISA的结合测定评估双特异性抗体的形成。在此测定中，将人IL-1β包被在板上，然后添加双特异性抗体TAVO3334x5332和TNFα。在洗涤非特异性结合后，通过抗TNFα检测抗体然后通过HRP缀合的二抗(Biolegend)检测TNFα的存在。观察到双特异性抗体TAVO3334x5332剂量依赖性地介导TNFα和IL1β二者的结合(图6)。通过将小鼠IL-1β包被在板上也进行了类似的ELISA测定。一致地，观察到双特异性抗体TAVO3334x5332而不是两种亲本抗体TAVO3334和TAVO5332的混合物对人TNFα的剂量依赖性募集(图6)。此数据表明了能够用双臂同时结合TNFα和IL-1β的双特异性抗体的形成。实施例3：双特异性抗体及其相应的亲本抗体对TNFα和IL-1β的结合亲和力采用基于ELISA的结合测定来评价双特异性抗体TAVO3334x5332及其亲本抗体TAVO5332和TAVO3334与来自不同物种的TNFα和IL1β的结合。在此测定中，将1μg/mL重组人TNFα或IL-1β(R&Dsystems)包被在ELISA板上。将渐增浓度的TAVO3334x5332、TAVO5332和TAVO3334抗体施加到板上，并且通过HRP缀合的抗人二抗检测它们与重组人TNFα或IL-1β的结合。观察到抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332以与抗TNFα抗体TAVO3334类似的效力剂量依赖性地结合来自人、恒河猴和小鼠的TNFα，而抗IL-1β抗体TAVO5332没有显示出结合活性(图7)。另一方面，抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332也以与抗IL-1β抗体TAVO5332类似的效力剂量依赖性地结合来自人、恒河猴和小鼠的IL-1β，而抗TNFα抗体TAVO3334没有显示出结合活性(图8)。实施例4：双特异性抗体及其相应的亲本抗体对TNFα活性的中和TNFα对鼠纤维肉瘤WEHI细胞系具有细胞毒效应。开发了基于WEHI细胞的细胞毒性测定以评估TAVO3334x5332及其亲本抗体对TNFα介导的细胞毒性的中和的影响。在此测定中，将渐增量的测试抗体连同10ng/mLTNFα一起施加到WEHI细胞上。通过MTT测定来定量WEHI细胞的细胞毒性。观察到抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332以相对于抗TNFα抗体TAVO3334不到二分之一的效力剂量依赖性地中和来自人和恒河猴的TNFα的细胞毒性活性，而抗IL1β抗体TAVO5332没有显示出功能活性(图9)。然而，尽管具有良好的结合亲和力，但抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332和抗TNFα抗体TAVO3334均没有显示出对小鼠TNFα的功能中和活性。实施例5：双特异性抗体及其相应的亲本抗体对IL-1β活性的中和IL-1β可以驱动人肺成纤维细胞细胞系MRC-5的激活并且刺激IL-6释放。采用基于MRC-5细胞的测定来评价TAVO3334x5332及其亲本抗体在阻断由分别来自人、恒河猴和小鼠的IL-1β驱动的IL-6释放中的作用。将渐增量的抗体连同IL-1β(人和恒河猴为1ng/ml，并且小鼠为10ng/ml)一起施加到在96孔板的每个孔中的5,000个MRC-5细胞中。在过夜孵育后，通过IL-6测定试剂盒(R&Dsystems)定量IL-6产生。观察到抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332及其抗IL-1β亲本抗体TAVO5332可以剂量依赖性地抑制由来自人、恒河猴和小鼠的IL-1β诱导的IL-6释放，而抗TNFα抗体TAVO3334没有显示出功能活性(图10)。在中和IL-1β活性方面，抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332与其抗IL-1β亲本抗体TAVO5332相比显示出略微降低的效力(<2分之一)。实施例6：双特异性抗体及其相应的亲本抗体对TNFα和IL-1β活性二者的中和TNFα和IL-1β二者的功能活性可以通过HEK-Blue报告测定来评估。在此测定中，HEK-Bluenull1-v细胞(Invivogen)可以通过触发导致NF-κB激活的信号传导级联对TNFα和IL-1β刺激做出反应，并且通过激活SEAP报告基因表达对分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的随后产生做出反应(图11)。使用此测定评价HEK-Bluenull1-v报告细胞系对TNFα和IL-1β的反应。观察到TNFα或IL-1β可以剂量依赖性地诱导报告基因表达，其中EC50分别为5ng/mL和0.5ng/mL(图11)。将TNFα和IL-1β二者添加到细胞中可以引发加性效应，其中报告基因表达的激活更高并且EC50为1.25ng/mL。然后采用HEK-Blue报告测定来评价抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332及其亲本抗体阻断由TNFα、IL-1β或TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因表达。将渐增量的抗体连同TNFα和/或IL-1β一起施加到HEK-Blue报告细胞中。在过夜孵育后，定量SEAP报告基因表达。观察到抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332与抗TNFα抗体TAVO3334类似地剂量依赖性地抑制TNFα介导的报告基因激活，而抗IL1β抗体TAVO5332没有显示出功能活性(图12)。抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332也以与抗IL-1β抗体TAVO5332类似的效力剂量依赖性地抑制IL-1β介导的报告基因激活，而抗TNFα抗体TAVO3334没有显示出功能活性(图12)。也采用相同的测定来评价双特异性抗体及其亲本抗体阻断由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活。观察到抗TNFα抗体TAVO3334和抗IL-1β抗体TAVO5332二者均可以剂量依赖性地抑制由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活；然而，它们只能部分阻断由两种细胞因子驱动的报告基因激活(图12)。相比之下，抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332以全功效剂量依赖性地阻断由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活。此数据证明了双特异性抗体对两种细胞因子的功能活性。除了TAVO3334x5332，还采用HEK-Blue报告测定来评价其他抗TNFα和IL-1β双特异性抗体阻断由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活。观察到TAVO3334x7378、TAVO11934x12032、TAVO11934x12178、TAVO14434x14578、TAVO167127x14578、TAVO169127x14578、TAVO167128x14578和TAVO169128x14578全部均可以以全功效剂量依赖性地抑制由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活(图13)。实施例7：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的Fc工程化以延长半衰期和降低效应子功能为了改善抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的PK特征，可以将Fc突变引入IgG1抗体中以延长抗体半衰期。特别地，已经证明M428L/N434S突变可通过增加FcRn结合亲和力来延长抗体半衰期(Booth,Ramakrishnan等人2018)。此外，L234A/L235AFc突变可以消除IgG1抗体的ADCC和CDC效应子功能(Hezareh,Hessell等人2001)。因此，产生在其IgG1Fc中具有L234A、L235A、M428L、N434S(AALS)突变的两种抗TNFα和IL-1β双特异性抗体，指定为TAVO11934x12032和TAVO11934x12178。为了研究Fc工程化抗体是否具有改善的FcRn结合亲和力，在基于ELISA的结合测定中评估TAVO11934x12032及其具有野生型IgG1的对应抗体TAVO3334x5332与小鼠FcRn的结合。将1ug/mL重组小鼠FcRn(R&Dsystems)包被在ELISA板上。将渐增浓度的TAVO11934x12032和TAVO3334x5332抗体施加到板上，并且通过HRP缀合的抗人二抗检测在pH6.0下它们与重组FcRn的结合。观察到具有M428L/N434SFc突变的TAVO11934x12032可以以与缺乏此类半衰期延长突变的TAVO3334x5332相比更好的效力和功效结合FcRn(图14)。还用具有或不具有半衰期延长突变的另一对抗TNFα和IL-1β双特异性抗体进行了FcRn结合测定。类似地，观察到具有FcM428L/N434S突变的TAVO11934x12178可以以与缺乏此类半衰期延长突变的TAVO3334x7378相比更好的效力和功效结合FcRn(图14)。为了确定M428L/N434S突变是否可以延长抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的循环半衰期，将在食蟹猴PK模型中测试TAVO11934x12032。在第0天，基于体重，将TAVO11934x12032经3分钟以1.0ml/kg的体积以4mg/kg作为静脉内输注施用至雄性幼稚食蟹猴。在给药前以及在给药后1h、2h和多个时间直到第35天，将全血收集进EDTA-K2收集管中。将血浆通过在4℃下以3500xg离心10分钟分离，然后转移到微量离心管中以在-80℃下储存。将通过标准ELISA方法测量血浆样品以检测人IgG。将使用Winnonlin6.4软件分析PK数据。基于已公布的数据和我们先前的具有此类M428L/N434SFc突变的另一种抗体(其具有26天左右的半衰期)的研究，预测TAVO11934x12032将在猴中具有比正常人IgG长得多的循环半衰期。实施例8：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的Fc工程化以对蛋白酶降解具有抗性为了改善抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的体内稳定性，可以将Fc突变引入IgG1抗体中以增强抗体对蛋白水解降解的抗性。许多蛋白酶可以在残基222-237(EU编号)之间或所述残基处切割野生型IgG抗体。通过在缺失了G236的IgG1抗体的铰链区中用E233P、L234A、L235A突变工程化可以实现对蛋白水解降解的抗性，根据EU索引进行残基编号(Kinder,Greenplate等人2013)。为了赋予抗TNFα和IL1β双特异性抗体最佳的特性，将一系列Fc突变(包括E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434S突变和G236缺失)引入表4中列出的许多抗TNFα和IL-1β双特异性抗体中。此组突变包括增强抗体对蛋白水解降解的抗性的Fc突变，连同延长抗体半衰期的M428L/N434S突变和消除ADCC和CDC效应子功能的L234A/L235A突变。为了研究用这些Fc突变工程化的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体是否对蛋白水解降解具有改善的抗性，使一组具有不同IgG1Fc突变的抗体在37℃下经受半小时的重组IgG蛋白酶IdeZ(NewEnglandBiolabs)消化，然后在还原条件下进行SDS-PAGE分析以评估重链的完整性。观察到用E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434SFc突变工程化并缺失了G236的抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体TAVO14434x14578具有完整的抗TNFα重链条带和抗IL-1β重链条带，它们在凝胶上具有靠近的迁移(图15)。类似地，具有相同组的Fc突变的其亲本抗体TAVO14434和TAVO14578也对IdeZ的蛋白水解降解有抗性。然而，抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x7378(它在其IgG1Fc中没有突变)和TAVO11934x12178(它在其IgG1Fc中具有L234A、L235A、M428L、N434S(AALS)突变)均不能抵抗IdeZ的消化，并且抗TNFα重链条带和抗IL-1β重链条带二者均消失(图15)。这表明E233P、L234A、L235AFc突变和G236缺失可以促进抗TNFα和IL-1β双特异性抗体对IdeZ降解的抗性。除了IgG蛋白酶IdeZ，还使具有不同IgG1Fc突变的相同组的抗体在37℃下经受24小时的重组基质金属蛋白酶3MMP3(EnzoLifeSciences)消化，然后在还原条件下进行SDS-PAGE以评估重链的完整性。观察到抗TNFα重链在MMP3消化后保持完整，不管它的IgG1Fc是否具有蛋白水解抗性突变(图15)。然而，抗IL-1β重链条带在TAVO3334x7378(它在其IgG1Fc中没有突变)中消失，但是在TAVO14434x14578(它是用E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434SFc突变工程化并缺失了G236的抗TNFα和IL-1β双特异性IgG1抗体)和TAVO11934x12178(它在其IgG1Fc中具有L234A、L235A、M428L、N434S(AALS)突变)中保持完整(图15)。这表明需要在铰链区下的Fc突变以促进抗TNFα和IL-1β双特异性抗体对MMP3降解的抗性。在HEK-Blue报告测定中评价这些广泛的Fc突变是否可以影响抗TNFα和IL-1β双特异性抗体的功能活性。如图13所示，TAVO14434x14578、TAVO167127x14578、TAVO169127x14578、TAVO167128x14578和TAVO169128x14578(它们全部均用E233P、L234A、L235A、F405L、M428L、N434SFc突变工程化并缺失了G236)可以以全功效和与没有此类突变的相应的抗TNFα和IL-1β双特异性抗体类似的效力剂量依赖性地抑制由TNFα和IL-1β一起驱动的报告基因激活。实施例9：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体在胶原抗体诱导的关节炎模型中的体内功效在胶原抗体诱导的关节炎(CAIA)模型中评价抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332在炎症中的功效(Moore,Allden等人,2014)。通过施用抗胶原单克隆抗体混合物和随后施用脂多糖(LPS)建立CAIA模型。CAIA的特征在于类似于在RA中观察到的炎症、关节翳形成和骨侵蚀。据报道，CAIA病理学是TNFα和IL-1β依赖性的，同时已经证明用抗TNFα或抗IL1β抗体阻断可改善病理学(Bendele,Chlipala等人,2000)。由于抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO3334x5332不能中和小鼠TNFα活性(即使对小鼠TNFα具有良好的结合亲和力)，因此使用希腊的Biomedcode提供的Tg1278/TNFKO小鼠进行研究。Tg1278/TNFKO小鼠缺乏鼠TNFα并且对于在正常生理对照下表达的人TNFα转基因的多个拷贝是杂合的。Tg1278/TNFKO小鼠表现出正常的发育，并且没有明显的病理学。在8至10周龄Tg1278/TNFKO雄性小鼠中诱导CAIA，所述小鼠在第0天接受腹膜内注射(i.p.)致关节炎抗体混合物(ArthritoMab,MDBiosciences)，然后在第3天接受i.p.注射LPS。在CAIA诱导后，每周两次给药PBS或3种剂量浓度的TAVO3334x5332(1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg)，持续两周。测量关节炎的临床得分、四肢的组织病理学和体重，并且将其作为读出收集。研究结果表明到诱导后第14天，PBS处理组显示明显增加的体内关节炎得分，这证明了关节炎病理学的诱导。与阴性对照PBS处理组相比，用1mg/kg、5mg/kg和10mg/kg的TAVO3334x5332处理以剂量依赖性方式抑制关节炎表型(图16，左侧小图)。到给药后第14天，与PBS关节炎得分相比，10mg/kg、5mg/kg和1mg/kg剂量分别将关节炎得分抑制了65％、32％和17％。此外，与用PBS处理的小鼠(其经14天显示出显著的7％体重减轻)相比，用TAVO3334x5332给药的小鼠显示出最小的体重减轻(图16，右侧小图)。总体而言，研究结果提供了TAVO3334x5332在Tg1278/TNFKO小鼠中诱导的CAIA模型中有预防关节炎症状的治疗效果的证据。实施例10：抗TNFα和IL-1β双特异性抗体在膝关节炎症模型中的体内功效还开发了膝关节炎症小鼠模型以评价抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178在正常小鼠中的体内功效。在将连续分泌的来自转染的小鼠NIH3T3细胞的人TNFα和IL-1β注射到其中一个膝关节后诱导此模型中的关节炎症，因为人TNFα和IL-1β二者均可以激活小鼠中的同源受体以诱导炎症。此模型允许研究抗TNFα和IL-1β抗体，所述抗体可以中和人细胞因子的作用，但是缺乏与鼠细胞因子的交叉反应性。对于此模型的开发，将衍生自DBA-1小鼠背景的鼠成纤维细胞细胞系NIH3T3用表达人TNFα或IL-1β的构建体转染，并且因此建立了稳定表达这两种细胞因子中任一种的两种NIH3T3细胞系。通过ELISA试剂盒(Biolegend)定量从已建立的稳定细胞系分泌的人TNFα和IL-1β的量。观察到一百万个NIH3T3:hTNFα细胞可以在24小时的时间段内分泌10-30nghTNFα，同时已建立的NIH3T3:hIL1β细胞可以分泌5-10nghIL-1β。此外，在这些细胞因子的HEK-Blue报告测定(Invivogen)中，从稳定的NIH3T3细胞系分泌的TNFα和IL-1β二者均可以激活报告基因表达，这确认了两种分泌的细胞因子的功能活性。为了评估已建立的细胞系在诱导膝关节炎症中的效用，将1x104、5x104或25x104个NIH3T3:hTNFα细胞或NIH3T3:hIL-1β细胞注射到9-10周龄的雄性DBA-1小鼠的右膝中，同时为左膝注射相当数量的NIH3T3亲本细胞。在细胞注射后每天对两个膝关节进行卡尺测量持续三天，并且将细胞因子诱导的膝关节炎症定量为处理右膝与未处理左膝之间的卡尺测量值差异。观察到在细胞注射后三天的时间里，从注射的细胞分泌的hTNFα和hIL-1β二者均可以以细胞数量依赖性方式诱导膝关节炎症增加(图17)。为了研究抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178及其相关的亲本抗体的体内功效，将这些测试制品连同同种型对照抗体一起腹膜内给药至DBA-1小鼠，两小时后，向小鼠给予关节内(IA)注射5x104个NIH3T3:hTNFα细胞与5x104个NIH3T3:hIL-1β细胞的混合物至右膝关节，以及10x104个NIH3T3亲本细胞至左膝关节作为对照。在第-1天以及注射后第1天、第2天和第3天，对双膝进行卡尺测量，并且将膝关节炎症定量为处理右膝与未处理左膝之间的卡尺测量值差异。观察到与同种型对照组相比，以10mg/kg给药的TAVO11934x12178显著地抑制由人TNFα和IL-1β诱导的膝关节炎症(图18A)。通过曲线下面积(AUC)计算，与同种型对照抗体处理的膝(AUC＝0.72±0.06mmx天数)相比，到第3天在TAVO11934x12178双特异性抗体处理的膝中的肿胀显著地(p值<0.005)降低(AUC＝0.25±0.05mmx天数)(图18B)。然而，当以5mg/kg(其与双特异性抗体的摩尔浓度相当)给药时的亲本抗TNFα抗体TAVO11934和亲本抗IL-1β抗体TAVO12178二者均不能诱导与双特异性抗体TAVO11934x12178相同程度的膝关节炎症抑制(TAVO11934的AUC＝0.52±0.18mmx天数，并且TAVO12178的AUC＝0.43±0.06mmx天数)，尽管抑制相对于同种型对照处理的小鼠仍然是显著的(图18A，图18B)。除了膝关节炎症，还观察到用抗TNFα和抗IL-1β抗体给药的小鼠具有最小的体重减轻，而用同种型对照抗体处理的小鼠显示出更显著的体重减轻(图18C)。这些结果证明抗TNFα和IL-1β双特异性抗体TAVO11934x12178可以中和人TNFα和人IL-1β二者在诱导膝关节炎症中的生物活性，而单独的抗TNFα抗体或抗IL-1β抗体可以仅通过阻断两种细胞因子中的仅一种而显示出部分功效。序列本文提供了本文提供的实施方案中包括的某些序列的代表性列表。表5.序列参考文献Aggarwal,B.B.(2003).\"SignallingpathwaysoftheTNFsuperfamily:adouble-edgedsword.\"NatRevImmunol3(9):745-756.BendeleA.M.,E.S.Chlipala,J.Scherrer,et.al.,(2002)“Combinationbenefitoftreatmentwiththecytokineinhibitorsinterleukin-1receptorantagonistandpegylatedsolubletumornecrosisfactorreceptortypeIinanimalmodelsofrheumatoidarthritis”.ArthritisRheumatol.43(12):2648-2659.Bolt,S.,E.Routledge,I.Lloyd,L.Chatenoud,H.Pope,S.D.Gorman,M.ClarkandH.Waldmann(1993).\"Thegenerationofahumanized,non-mitogenicCD3monoclonalantibodywhichretainsinvitroimmunosuppressiveproperties.\"EurJImmunol23(2):403-411.Chu,S.Y.,I.Vostiar,S.Karki,G.L.Moore,G.A.Lazar,E.Pong,P.F.Joyce,D.E.SzymkowskiandJ.R.Desjarlais(2008).\"InhibitionofBcellreceptor-mediatedactivationofprimaryhumanBcellsbycoengagementofCD19andFcgammaRIIbwithFc-engineeredantibodies.\"MolImmunol45(15):3926-3933.Dall'Acqua,W.F.,P.A.KienerandH.Wu(2006).\"PropertiesofhumanIgG1sengineeredforenhancedbindingtotheneonatalFcreceptor(FcRn).\"JBiolChem281(33):23514-23524.Erekat,N.andM.D.Al-Jarrah(2018).\"Interleukin-1BetaandTumorNecrosisFactorAlphaUpregulationandNuclearFactorKappaBActivationinSkeletalMusclefromaMouseModelofChronic/ProgressiveParkinsonDisease.\"MedSciMonit24:7524-7531.Feldmann,M.,F.M.Brennan,E.Paleolog,A.Cope,P.Taylor,R.Williams,J.WoodyandR.N.Maini(2004).\"Anti-TNFalphatherapyofrheumatoidarthritis:whatcanwelearnaboutchronicdisease？\"NovartisFoundSymp256:53-69；discussion69-73,106-111,266-109.Gram,H.(2016).\"PreclinicalcharacterizationandclinicaldevelopmentofILARIS((R))(canakinumab)forthetreatmentofautoinflammatorydiseases.\"CurrOpinChemBiol32:1-9.Hess,A.,R.Axmann,J.Rech,S.Finzel,C.Heindl,S.Kreitz,M.Sergeeva,M.Saake,M.Garcia,G.Kollias,R.H.Straub,O.Sporns,A.Doerfler,K.BruneandG.Schett(2011).\"BlockadeofTNF-alpharapidlyinhibitspainresponsesinthecentralnervoussystem.\"ProcNatlAcadSciUSA108(9):3731-3736.Hezareh,M.,A.J.Hessell,R.C.Jensen,JG.VandeWinkelandP.W.Parren.(2001).“EffectorfunctionactivitiesofapanelofmutantsofabroadlyneutralizingantibodyagainsthumanimmunodeficiencyvirusType1.”JVirol.75(24):1261-8.Hinton,P.R.,J.M.Xiong,M.G.Johlfs,M.T.Tang,S.KellerandN.Tsurushita(2006).\"AnengineeredhumanIgG1antibodywithlongerserumhalf-life.\"JImmunol176(1):346-356.Huang,C.C.,C.H.Chiou,S.C.Liu,S.L.Hu,C.M.Su,C.H.TsaiandC.H.Tang(2019).\"MelatoninattenuatesTNF-alphaandIL-1betaexpressioninsynovialfibroblastsanddiminishescartilagedegradation:Implicationsforthetreatmentofrheumatoidarthritis.\"JPinealRes66(3):e12560.Issafras,H.,J.A.Corbin,I.D.GoldfineandM.K.Roell(2013).\"Detailedmechanisticanalysisofgevokizumab,anallostericanti-IL-1betaantibodywithdifferentialreceptor-modulatingproperties.\"JPharmacolExpTher348(1):202-215.Jani,M.,W.G.DixonandH.Chinoy(2018).\"Drugsafetyandimmunogenicityoftumournecrosisfactorinhibitors:thestorysofar.\"Rheumatology57(11):1896-1907.Kaymakcalan,Z.,P.Sakorafas,S.Bose,S.Scesney,L.Xiong,D.K.Hanzatian,J.SalfeldandE.H.Sasso(2009).\"Comparisonsofaffinities,avidities,andcomplementactivationofadalimumab,infliximab,andetanerceptinbindingtosolubleandmembranetumornecrosisfactor.\"ClinImmunol131(2):308-316.Kinder,M.,A.R.Greenplate,K.D.Grugan,K.L.Soring,K.A.Heeringa,S.G.McCarthy,G.Bannish,M.Perpetua,F.Lynch,R.E.Jordan,W.R.Strohl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再多了解一些
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