禽源趋化因子CCL19在制备抗病毒产品中的应用

禽源趋化因子ccl19在制备抗病毒产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，禽源趋化因子ccl19在制备抗病毒产品中的应用。


背景技术：

2.趋化因子是一类低分子量蛋白质，对白细胞具有趋化和激活作用。可通过与其相应受体作用在胚胎发育、血管生成、癌症的发生和转移等过程中发挥重要作用。根据趋化因子n端前两个半胱氨酸的位置及其间是否有氨基酸残基的插入将其分为4个亚族分别是cxc亚族、cc亚族、cx3c亚族和c亚族，也可根据其功能将其分为稳态趋化因子和炎症趋化因子。
3.趋化因子ccl19(c-c motif chemokine ligand 19,ccl19)又称为巨噬细胞炎性蛋白3β(macrophage inflammatory protein-3β，mip-3β)，作为ccr7的配体，常与ccr7形成ccl19/ccr7轴，在巨噬细胞、t细胞和树突状细胞(dc)等免疫细胞分化、增殖和迁移等过程及成熟归巢至二级淋巴器官中起着重要作用。通常认为，ccl19和ccl21是参与自体平衡的趋化因子，在t细胞和树突状细胞迁移入淋巴组织过程中起着关键作用，新的数据表明，ccl19和ccl21也参与炎症反应。在人类免疫缺陷病毒(hiv)的感染中，ccl19/ccl21/ccr7系统的失调有可能会产生炎症反应从而在hiv感染中发挥致病作用，ccl19/ccl21与其受体ccr7均作为hiv致病回路的一部分参与其中。在犬中枢神经系统炎症反应中，如果犬患类固醇反应性脑膜炎-动脉炎或者未知病因的脑膜脑髓炎时，其脑脊液中ccl19浓度往往会明显升高。但是目前尚未发现ccl19对病毒有预防和治疗作用。
4.鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease，ibd)是由鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，ibdv)引起的主要感染幼鸡和青年鸡的一种急性、高度接触性传染病。又称为“甘布罗病”。ibdv的主要靶器官是法氏囊，它是禽类特有的中枢免疫器官，ibdv主要侵害b前淋巴细胞致使法氏囊中b细胞急剧减少，从而导致法氏囊萎缩、出血等病变，从而导致高度的免疫抑制，使鸡对其他疾病更加易感，并影响其他疫苗的免疫效果导致免疫失败。ibd是威胁养禽业的重要传染病之一，给养殖户造成重大经济损失。因此，有必要研发有效的抗病毒方法。


技术实现要素：

5.针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种趋化因子ccl19的新用途。
6.为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
7.禽源趋化因子ccl19或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在制备抗病毒产品中的应用。
8.本发明研究发现，将趋化因子ccl19体外进行过表达可以有效抑制病毒的复制。直接添加ccl19的重组蛋白可以抑制病毒，也可以通过转染ccl19的真核表达质粒来抑制病毒复制。
9.本发明的应用中，所述禽源趋化因子ccl19具有seq id no.1所示的氨基酸序列。
10.本发明的应用中，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
11.本发明的应用中，所述病毒为传染性法氏囊病病毒或新城疫病毒。
12.本发明的应用中，所述产品为预防和/或治疗病毒的药物。
13.本发明的应用中，所述药物可单独使用或者联合其它药物使用。
14.所述药物含有至少一种可药用载体。
15.所述药物的给药方式为注射和/或口服。
16.ccl19蛋白制备的抗病毒药物，可以是纯制剂，也可以是与药学上可接受的载体组成的各种制剂，如注射液、口服液、丸剂、片剂或胶囊等。可以是口服或者注射等方式给药。本发明的ccl19蛋白可一次给予或连续多次给药。
17.ccl19的真核表达质粒可以直接注射给动物，也可以体外转染细胞，发挥抗病毒作用。
18.本发明还提供一种预防和/或治疗病毒的方法，使动物体内趋化因子ccl19表达水平适量增高。
19.本发明的方法中，所述禽源趋化因子ccl19具有seq id no.1所示的氨基酸序列。
20.本发明的方法中，所述病毒为传染性法氏囊病病毒或新城疫病毒。
21.本发明的有益效果至少在于：
22.本发明发现了ccl19蛋白及其基因制品在制备抗畜禽病毒药物中的新用途。所述禽源趋化因子ccl19(基因登录号：nm_001302168.1)能够通过分子生物技术体外获得其蛋白和真核表达质粒，试验表明ccl19真核表达质粒转染细胞后，可以有效抑制家禽病毒的复制，本发明为家禽病毒病的防控提供了一种新途径。
附图说明
23.图1为pegfp-n1/ccl19的真核表达载体的构建结果。
24.图2为转染pegfp-n1/ccl19(实验组，图中的左图)和pegfp-n1(对照组，图中的右图)24h后接种ibdv 72h的结果。
25.图3为真核表达质粒pegfp-n1/ccl19过表达ccl19对ibdv复制的影响结果；纵坐标为vp2基因表达量，图中**代表p《0.01(即差异极显著)。
具体实施方式
26.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
27.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
28.实施例1 pegfp-n1/ccl19真核载体构建
29.家禽ccl19的全基因序列(accession no.:nm_001302168.1)如seq id no.1所示。
30.根据ccl19测序结果，设计一对真核表达引物(其中，下划线部分碱基为引入的酶切位点，其中在ccl19-n1-f中还引入了促进表达的kozak序列“gccacc”)：
31.ccl19-n1-f(seq id no.2)：
32.5'ccgaagcttgccaccatgcagcggctgcacgtt 3'
33.ccl19-n1-r(seq id no.3)：
34.5'ccgggatccctaattgccttgatttgggac 3'。
35.分别在引物的上下游引入酶切位点hind iii和bamh i，以已制备的原核载体pmd t/ccl19(参见王秋霞,李鹏祥,李茵,刘兴友,余燕,张艳红,姜金庆,马金友,欧长波.禽源ccl19蛋白的表达纯化和抗体的制备.中国兽医科学,2018,48(2):155-160.)为模板，使用ccl19-n1-f和ccl19-n1-r引物进行扩增，扩增体系为50μl，按rtaq酶的使用说明进行配制。扩增程序为：95℃2min，之后按95℃10s，58℃30s，72℃20s的程序扩增30个循环，最后72℃再延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，通过切胶方式纯化回收目的片段。
36.使用hind iii和bamh i，按1μl酶1000ng dna的量配制酶切体系，分别对pegfp-n1载体和回收获得的ccl19片段(上述回收获得的目的片段)进行双酶切，1％琼脂糖凝胶观察酶切效果后，使用dna直接纯化试剂盒进行回收。
37.将双酶切后的pegfp-n1载体和ccl19片段使用t4 dna连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌dh5α细胞中，涂布含kan 抗性的lb平板后，37℃培养箱过夜培养，挑取单菌落，培养后提取质粒，分别进行pcr和酶切鉴定(鉴定结果见图1)，并将鉴定正确的质粒送金维智公司进一步测序鉴定。
38.实施例2 ccl19体外抗病毒效果
39.取转染24h的df-1细胞，使用ibdv毒株(毒株为b87株中毒疫苗株，购自青岛蔚蓝生物制品有限公司)进行攻毒试验，设空白对照和阴性攻毒对照。简单来说，即按测定的tcid
50
，选取一定倍数稀释的病毒液，按每孔200μl的量，覆于转染24h的细胞孔和阴性对照细胞孔中，37℃co2培养箱孵育1h，去除病毒液，换成含2％fbs的培养液继续培养。
40.取不同时间收集的细胞样品，根据说明书，使用试剂盒提取总rna，逆转录后使用sybr green master mix试剂盒进行扩增ibdv vp2基因，以β-actin为内参基因。qrt-pcr采用的循环程序为：95℃循环10min，95℃循环15s，60℃循环30s，72℃循环20s。pcr引物参见表1。根据空白对照细胞cdna所建立的标准曲线，使用step-one软件v2.3对结果进行量化处理。每个样品做三个重复，取平均值用于进一步的计算。
41.具体地，攻毒试验中，将df-1细胞调至2
×
105/ml铺96孔板，每孔加入细胞液100μl。用1ug的pegfp-n1-ccl19质粒(实施例1中制备得到)转染6孔板df-1细胞，以pegfp-n1空载体为对照，转染后24h接种ibdv，接种剂量为10倍tcid
50
。接种后观察细胞病变。
42.表1 pcr引物序列(seq id no.4-9)
[0043][0044]
[0045]
结果显示，在接种后24h、48h对照组和实验组都没有发生明显细胞病变，攻毒后72h pegfp-n1载体对照组细胞几乎全部死亡脱落，pegfp-n1-ccl19组细胞只发生轻微病变。具体结果见图2。提示过表达ccl19能够一定程度的减轻ibdv对细胞的损伤，提示ccl19抑制了ibdv在df-1细胞中的复制。
[0046]
感染后24h pegfp-n1-ccl19转染组vp2mran表达水平与对照组无明显差异，自感染后36h起，过表达ccl19组vp2表达量明显下降。ibdv感染后60h，vp2表达量下降约11.8倍；ibdv感染后72h，vp2表达量下降约100倍。具体结果见图3。
[0047]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。