高压液相色谱-质谱联用检测水中微囊藻毒素含量的方法与流程

1.本发明涉及环境检测技术领域，具体是涉及高压液相色谱-质谱联用检测水中微囊藻毒素含量的方法。


背景技术：

2.水质富营养化导致蓝藻水华和赤潮发生频次逐年增加。蓝藻水华和赤潮爆发时，不仅降低水中溶解氧含量，还能产生微囊藻毒素。微囊藻毒素对人体健康具有很大危害性，皮肤接触可引起敏感部位(眼睛)和皮肤过敏，少量喝入可引起急性肠胃炎。
3.目前，微囊藻毒素的检测主要有液相色谱法。液相色谱主要依赖色谱柱分离和检测器对抗生素响应度，而由于水环境基体较为复杂，包含多种有机物质或干扰离子，色谱在定性和定量上存在一定难度。液相色谱-质谱联用主要利用色谱柱分离，质量分析器根据测定的分子量以及该分子量物质的强度进行定性和定量，较之液相色谱，色谱与质谱联用技术可较好地完成复杂样品的定性和定量，然而由于环境中存在大量的有机质，背景干扰较严重，相同分子量的物质种类仍然很多，所以易造成测定结果的假阳性。
4.三重四级杆技术通过施加能量，将化合物分子打成碎片，每种化合物在一定条件下均有自己的特征碎片，通过同时测定化合物本身分子量和特征碎片分子量对化合物进行定性和定量不但能减少对化合物的误判降低假阳性判定，而且大大提高检测灵敏度。目前国内对高压液相色谱-质谱仪联用法测定水中微囊藻毒素-lr研究较少，在降低对定性和定量干扰难题方面还没有在环境检测行业引起关注。
5.专利cn102520086b公开了一种水体中微囊藻毒素总量的气相色谱-质谱联用的检测方法，属于分析化学领域，同时也涉及水环境污染物的检测技术领域。该发明步骤包括：浓缩样品并调节ph值至8.5-9.5，经高锰酸钾溶液氧化，用亚硫酸氢钠粉末终止反应后酸化，将氧化产物2-甲基-3-甲氧基-4-苯基丁酸 (mmpb)加入甲醇，以吡啶作为催化剂经氯甲酸甲酯甲酯化反应后由氯仿萃取，本方法用4-苯基丁酸作为内标物，并用气相色谱-质谱联用对甲酯化的mmpb 进行检测。该方法能够有效检测微囊藻毒素的总量，具有良好的灵敏度和重现性。但是，该方法不能有效的对痕量微囊藻毒素-lr进行高灵敏度的检测。


技术实现要素：

6.针对上述存在的问题，本发明提供了高压液相色谱-质谱联用检测水中微囊藻毒素含量的方法。
7.本发明的技术方案是：
8.高压液相色谱-质谱联用检测水中微囊藻毒素-lr含量的方法，包括以下步骤：
9.s1、水样ph调节：量取一份50.00ml水样，加入盐酸溶液或氢氧化钠溶液，调节ph至接近中性；
10.s2、固相萃取富集浓缩：
11.s2-1、活化固相萃取柱：取固相萃取柱，使用5ml甲醇溶液活化固相萃取柱，流速为
4-6ml/min，再使用10ml去离子水活化固相萃取柱，流速为5
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10ml/min；
12.s2-2、洗脱液收集：将步骤s1中得到的50ml水样过活化后的固相萃取柱，流速为3-5ml/min，随后使用5ml去离子水冲洗固相萃取柱，流速为15
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20ml/min，随后干燥固相萃取柱30min，最后用5ml甲醇溶液以3ml/min流速洗脱固相萃取柱，收集洗脱液；
13.s2-3、定容：将洗脱液在40℃条件下水浴加热30min，并使用35-40℃的氮气吹至近干燥，最后用甲醇溶液定容至1.0ml，再过聚四氟乙烯滤膜，得到样品溶液；
14.s3、高压液相色谱-质谱仪检测：
15.s3-1、标准溶液的制备：称取标准品微囊藻毒素-lr，使用甲醇溶液溶解，配成0.2mg/ml的标准储备溶液，使用时根据微囊藻毒素-lr的响应，用甲醇溶液稀释成标准工作液；
16.s3-2、标准工作液和样品溶液的检测：由自动进样器分别吸取标准工作液和样品溶液，注入高压液相色谱-质谱仪中，样品溶液中和标准溶液的微囊藻毒素-lr组分经液相色谱柱分离，随后经质谱仪检测；
17.s4、数据分析：以步骤s3中分离出的含微囊藻毒素-lr的化合物的母离子和子离子为定量离子和定性离子，以标准工作液的质量浓度x为横坐标，定量定性离子的峰面积y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行单离子外标法定量，用样品溶液中出现的色谱峰保留时间和母离子/子离子对进行定性。
18.进一步的，所述步骤s1中，盐酸溶液的质量浓度为35-37％，氢氧化钠溶液的质量浓度为40％，调整至接近中性的ph值范围为6.0-8.0。方便了ph值的调节。
19.进一步的，所述步骤s2中所用的固相萃取柱为watersoasishlb固相萃取柱，规格为6cc/500mg，60μm。填料稳固定能良好，极大地提高了分离效能和载样量。
20.进一步的，所述步骤s2、s3中所用到的甲醇溶液均为质量浓度为95-99％的甲醇溶液。确保固相萃取柱活化完全。
21.进一步的，所述步骤s2-3中近干燥的含水率为2-5％，所述聚四氟乙烯滤膜的率孔直径为0.45μm。
22.进一步的，所述步骤s3-2中液相色谱柱分离的色谱柱为beh-c18，色谱柱的粒度为1.7μm，色谱柱的内径为2.1mm，柱长为50mm，流动相包括第一流动相和第二流动相，柱温为27-32℃，在进行液相色谱柱分离时进行梯度洗脱：
23.s3-2-1、一次洗脱：以质量分数计，使用80％的第一流动相和20％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.2-0.5ml/min，洗脱时间为第0-1min；
24.s3-2-2、二次洗脱：以质量分数计，使用40-80％的第一流动相和20-60％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.3-0.6ml/min，洗脱时间为第1-3min；
25.s3-2-3、三次洗脱：以质量分数计，使用20-40％的第一流动相和60-80％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.4-0.8ml/min，洗脱时间为第3-4min；
26.s3-2-4、四次洗脱：以质量分数计，使用20％的第一流动相和80％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.2-0.5ml/min，洗脱时间为第4-7min。
27.更进一步的，所述第一流动相为质量浓度0.1％的甲酸溶液，所述第二流动相为质量浓度50％的乙腈溶液。合理的洗脱液配比以及两种洗脱液的组合对洗脱效率具有影响。
28.进一步的，所述步骤s3-2中质谱仪的质量分析器为三重四级杆，扫描模式为正离
子-反应监测模式，离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为3.0kv，去溶剂温度为350℃，去溶剂气体流速为800l/h。使质谱检测效率更高。
29.本发明的有益效果是：
30.(1)本发明的高压液相色谱-质谱联用检测水中微囊藻毒素-lr含量的方法具有检测时间短、灵敏度高的特点，是一种新型的对于水环境样品中微囊藻毒素-lr含量的测定方法，该方法大大降低了对目标物的检测的干扰，能够对痕量微囊藻毒素-lr进行高灵敏度的检测。
31.(2)本发明的梯度洗脱方法能够使梯度洗脱更为平稳，能够有效避免沟渠效应，经检测对于微囊藻毒素-lr检测限为0.2ug/l，添加回收率为90-100％，相对标准偏差小于3％。
附图说明
32.图1是本发明的标准工作液浓度与峰面积的标准曲线图；
33.图2是本发明的微囊藻毒素-lr的多反应监测mrm色谱图。
具体实施方式
34.实施例1
35.高压液相色谱-质谱联用检测水中微囊藻毒素-lr含量的方法，包括以下步骤：
36.s1、水样ph调节：量取一份50.00ml水样，加入盐酸溶液或氢氧化钠溶液，盐酸溶液的质量浓度为36％，氢氧化钠溶液的质量浓度为40％，调节ph 至7；
37.s2、固相萃取富集浓缩：
38.s2-1、活化固相萃取柱：取固相萃取柱，固相萃取柱为watersoasishlb 固相萃取柱，规格为6cc/500mg，60μm，使用5ml甲醇溶液活化固相萃取柱，流速为5ml/min，再使用10ml去离子水活化固相萃取柱，流速为5-10ml/min；
39.s2-2、洗脱液收集：将步骤s1中得到的50ml水样过活化后的固相萃取柱，流速为4ml/min，随后使用5ml去离子水冲洗固相萃取柱，流速为18ml/min，随后干燥固相萃取柱30min，最后用5ml甲醇溶液以3ml/min流速洗脱固相萃取柱，收集洗脱液；
40.s2-3、定容：将洗脱液在40℃条件下水浴加热30min，并使用38℃的氮气吹至近干燥，近干燥的含水率为3％，最后用甲醇溶液定容至1.0ml，再过聚四氟乙烯滤膜，聚四氟乙烯滤膜的率孔直径为0.45μm，得到样品溶液；
41.s3、高压液相色谱-质谱仪检测：
42.s3-1、标准溶液的制备：称取标准品微囊藻毒素-lr，使用甲醇溶液溶解，配成0.2mg/ml的标准储备溶液，使用时根据微囊藻毒素-lr的响应，用甲醇溶液稀释成标准工作液；
43.s3-2、标准工作液和样品溶液的检测：由自动进样器分别吸取标准工作液和样品溶液，注入高压液相色谱-质谱仪中，样品溶液中和标准溶液的微囊藻毒素-lr组分经液相色谱柱分离，随后经质谱仪检测，质谱仪的质量分析器为三重四级杆，扫描模式为正离子-反应监测模式，离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为3.0kv，去溶剂温度为350℃，去溶剂气体流速为800l/h，步骤s2、s3中所用到的甲醇溶液均为质量浓度为97％的甲醇溶液；液相色
谱柱分离的色谱柱为beh-c18，色谱柱的粒度为1.7μm，色谱柱的内径为2.1mm，柱长为50mm，流动相包括第一流动相和第二流动相，第一流动相为质量浓度0.1％的甲酸溶液，第二流动相为质量浓度50％的乙腈溶液，柱温为30℃，在进行液相色谱柱分离时进行梯度洗脱：
44.s3-2-1、一次洗脱：以质量分数计，使用80％的第一流动相和20％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.4ml/min，洗脱时间为第0-1min；
45.s3-2-2、二次洗脱：以质量分数计，使用40-80％的第一流动相和20-60％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min，洗脱时间为第1-3min；
46.s3-2-3、三次洗脱：以质量分数计，使用20-40％的第一流动相和60-80％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.6ml/min，洗脱时间为第3-4min；
47.s3-2-4、四次洗脱：以质量分数计，使用20％的第一流动相和80％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.3ml/min，洗脱时间为第4-7min；
48.s4、数据分析：以步骤s3中分离出的含微囊藻毒素-lr的化合物的母离子和子离子为定量离子和定性离子，以标准工作液的质量浓度x为横坐标，定量定性离子的峰面积y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行单离子外标法定量，用样品溶液中出现的色谱峰保留时间和母离子/子离子对进行定性。
49.实施例2
50.本实施例与实施例1不同之处在于：步骤s1中水样ph调节的参数不同。
51.s1、水样ph调节：量取一份50.00ml水样，加入盐酸溶液或氢氧化钠溶液，盐酸溶液的质量浓度为37％，氢氧化钠溶液的质量浓度为40％，调节ph 至6.0。
52.实施例3
53.本实施例与实施例1不同之处在于：步骤s1中水样ph调节的参数不同。
54.s1、水样ph调节：量取一份50.00ml水样，加入盐酸溶液或氢氧化钠溶液，盐酸溶液的质量浓度为35％，氢氧化钠溶液的质量浓度为40％，调节ph 至8.0。
55.为保证本发明的测试结果准确性最高，应进能量保证调节ph至接接近中性故选取实施例1中的工艺参数。
56.实施例4
57.本实施例与实施例1不同之处在于：步骤s2中固相萃取富集浓缩的参数不同。
58.s2、固相萃取富集浓缩：
59.s2-1、活化固相萃取柱：取固相萃取柱，固相萃取柱为watersoasishlb 固相萃取柱，规格为6cc/500mg，60μm，使用5ml甲醇溶液活化固相萃取柱，流速为4ml/min，再使用10ml去离子水活化固相萃取柱，流速为5ml/min；
60.s2-2、洗脱液收集：将步骤s1中得到的50ml水样过活化后的固相萃取柱，流速为3ml/min，随后使用5ml去离子水冲洗固相萃取柱，流速为15ml/min，随后干燥固相萃取柱30min，最后用5ml甲醇溶液以3ml/min流速洗脱固相萃取柱，收集洗脱液；
61.s2-3、定容：将洗脱液在40℃条件下水浴加热30min，并使用35℃的氮气吹至近干燥，近干燥的含水率为2％，最后用甲醇溶液定容至1.0ml，再过聚四氟乙烯滤膜，聚四氟乙烯滤膜的率孔直径为0.45μm，得到样品溶液。
62.实施例5
63.本实施例与实施例1不同之处在于：步骤s2中固相萃取富集浓缩的参数不同。
64.s2、固相萃取富集浓缩：
65.s2-1、活化固相萃取柱：取固相萃取柱，固相萃取柱为watersoasishlb 固相萃取柱，规格为6cc/500mg，60μm，使用5ml甲醇溶液活化固相萃取柱，流速为6ml/min，再使用10ml去离子水活化固相萃取柱，流速为10ml/min；
66.s2-2、洗脱液收集：将步骤s1中得到的50ml水样过活化后的固相萃取柱，流速为5ml/min，随后使用5ml去离子水冲洗固相萃取柱，流速为20ml/min，随后干燥固相萃取柱30min，最后用5ml甲醇溶液以3ml/min流速洗脱固相萃取柱，收集洗脱液；
67.s2-3、定容：将洗脱液在40℃条件下水浴加热30min，并使用40℃的氮气吹至近干燥，近干燥的含水率为5％，最后用甲醇溶液定容至1.0ml，再过聚四氟乙烯滤膜，聚四氟乙烯滤膜的率孔直径为0.45μm，得到样品溶液。
68.使用本发明步骤s2中的工艺参数范围均能够实现固相萃取富集浓缩的目的，定容中近干燥的含水率优选为实施例1中的3％。
69.实施例6
70.本实施例与实施例1不同之处在于：步骤s3中高压液相色谱-质谱仪检测的参数不同。
71.s3、高压液相色谱-质谱仪检测：
72.s3-1、标准溶液的制备：称取标准品微囊藻毒素-lr，使用甲醇溶液溶解，配成0.2mg/ml的标准储备溶液，使用时根据微囊藻毒素-lr的响应，用甲醇溶液稀释成标准工作液；
73.s3-2、标准工作液和样品溶液的检测：由自动进样器分别吸取标准工作液和样品溶液，注入高压液相色谱-质谱仪中，样品溶液中和标准溶液的微囊藻毒素-lr组分经液相色谱柱分离，随后经质谱仪检测，质谱仪的质量分析器为三重四级杆，扫描模式为正离子-反应监测模式，离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为3.0kv，去溶剂温度为350℃，去溶剂气体流速为800l/h，步骤s2、s3中所用到的甲醇溶液均为质量浓度为95％的甲醇溶液；液相色谱柱分离的色谱柱为beh-c18，色谱柱的粒度为1.7μm，色谱柱的内径为2.1mm，柱长为50mm，流动相包括第一流动相和第二流动相，第一流动相为质量浓度0.1％的甲酸溶液，第二流动相为质量浓度50％的乙腈溶液，柱温为27℃，在进行液相色谱柱分离时进行梯度洗脱：
74.s3-2-1、一次洗脱：以质量分数计，使用80％的第一流动相和20％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.2ml/min，洗脱时间为第0-1min；
75.s3-2-2、二次洗脱：以质量分数计，使用40-80％的第一流动相和20-60％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.3ml/min，洗脱时间为第1-3min；
76.s3-2-3、三次洗脱：以质量分数计，使用20-40％的第一流动相和60-80％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.4ml/min，洗脱时间为第3-4min；
77.s3-2-4、四次洗脱：以质量分数计，使用20％的第一流动相和80％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.2ml/min，洗脱时间为第4-7min。
78.实施例7
79.s3、高压液相色谱-质谱仪检测：
80.s3-1、标准溶液的制备：称取标准品微囊藻毒素-lr，使用甲醇溶液溶解，配成0.2mg/ml的标准储备溶液，使用时根据微囊藻毒素-lr的响应，用甲醇溶液稀释成标准工作
液；
81.s3-2、标准工作液和样品溶液的检测：由自动进样器分别吸取标准工作液和样品溶液，注入高压液相色谱-质谱仪中，样品溶液中和标准溶液的微囊藻毒素-lr组分经液相色谱柱分离，随后经质谱仪检测，质谱仪的质量分析器为三重四级杆，扫描模式为正离子-反应监测模式，离子源为电喷雾离子源，喷雾电压为3.0kv，去溶剂温度为350℃，去溶剂气体流速为800l/h，步骤s2、s3中所用到的甲醇溶液均为质量浓度为99％的甲醇溶液；液相色谱柱分离的色谱柱为beh-c18，色谱柱的粒度为1.7μm，色谱柱的内径为2.1mm，柱长为50mm，流动相包括第一流动相和第二流动相，第一流动相为质量浓度0.1％的甲酸溶液，第二流动相为质量浓度50％的乙腈溶液，柱温为32℃，在进行液相色谱柱分离时进行梯度洗脱：
82.s3-2-1、一次洗脱：以质量分数计，使用80％的第一流动相和20％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min，洗脱时间为第0-1min；
83.s3-2-2、二次洗脱：以质量分数计，使用40-80％的第一流动相和20-60％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.6ml/min，洗脱时间为第1-3min；
84.s3-2-3、三次洗脱：以质量分数计，使用20-40％的第一流动相和60-80％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.8ml/min，洗脱时间为第3-4min；
85.s3-2-4、四次洗脱：以质量分数计，使用20％的第一流动相和80％的第二流动相进行洗脱，洗脱速度为0.5ml/min，洗脱时间为第4-7min。
86.对比实施例1和实施例6、7，在保持柱温为常温的前提下，选择实施例1 中的梯度洗脱参数能够使梯度洗脱更为平稳，能够有效避免沟渠效应。
87.实验例
88.下面结合附图1-2对本发明的高压液相色谱-质谱联用检测水中微囊藻毒素
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lr含量的方法作进一步说明：
89.以实施例1的实验参数为例，选择微囊藻毒素-lr作为标准品，进行高压液相色谱-质谱联用检测水中微囊藻毒素-lr含量：
90.s4、数据分析：以步骤s3中分离出的含微囊藻毒素-lr的化合物的母离子和子离子为定量离子和定性离子，以标准工作液的质量浓度x为横坐标，定量定性离子的峰面积y为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行单离子外标法定量，用样品溶液中出现的色谱峰保留时间和母离子/子离子对进行定性，如图1，表1、2所示。
91.表1浓度与峰面积数据
92.[0093][0094]
表2微囊藻毒素-lr的质谱参数
[0095][0096]
将表2结合图2可以看出，根据本发明实施例1的工艺方法能够得到两种条件的色谱图，即样品溶液中出现的色谱峰保留时间和母离子/子离子为 498/106.9和498/135.1这两种条件下的色谱图，经检测对于微囊藻毒素-lr检测限为0.2ug/l，添加回收率为90-100％，相对标准偏差小于3％。