一种基于PEG沉淀法与SEC柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用的制作方法

一种基于peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用
技术领域
1.本发明涉及一种试剂盒及应用，尤其涉及一种基于peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用。


背景技术：

2.外泌体，是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约30-150nm。外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳，外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性囊泡。外泌体内容物：1)核酸：rrna、mirna、cirrna、lncrna、mrna等。2)蛋白质：如微管蛋白、肌动蛋白、热休克蛋白、膜蛋白如：四跨膜蛋白(cd9，cd63，cd81，cd82)、整合素、膜联蛋白等。3)脂质：神经鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺等。
3.peg沉淀法或sec柱法也广泛应用到外泌体提取领域。peg沉淀法的原理为：通过聚合物劫持水分子，使得外泌体溶解度降低，进而在低速离心条件下发生沉降。如专利“一种基于沉淀试剂法的细胞上清液外泌体提取工艺”中应用到peg6000和peg4000沉降细胞上清液中的外泌体。专利“一种分离尿液中外泌体的方法”中使用的是商业化外泌体沉淀试剂。专利“一种从尿液中提取外泌体的方法及试剂”中也是使用peg沉淀法提取外泌体。但是peg沉淀法弊端是一些杂蛋白表面也有水分子，也会沉降下来，影响了外泌体纯度。此方法可以处理大量样本，但是杂蛋白多，纯度低。sec柱法即排阻色谱法，其原理为：多孔聚合物微球的柱子。分子根据其直径通过微球，半径小的分子需要更长的时间才能通过色谱柱的孔隙迁移，而大分子则从色谱柱中更早地洗脱。尺寸排阻色谱可以精确分离大小分子。与离心方法相比，色谱分离已被证明具有更多优势，因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响，不容易改变囊泡的结构。sec柱法是一种广泛接受的分离血液和尿液中外泌体的技术。如专利“一种用于排阻色谱法提取外泌体的出峰位置分子标记方法”中提到用丙烯葡聚糖凝胶分离柱来准确洗脱收集外泌体，外泌体样品为细胞培养上清或血液。sec柱法只适合少量样品处理，如从几毫升血液中提取有限的外泌体，并不适合大量样本的处理，如从大量尿液样品中直接提取外泌体就不适用。而且sec柱法处理的样品量越大，需要的柱填料越多，耗时越长，回收外泌体的浓度低，提取效果不理想。专利“基于排阻色谱和超滤技术的胞外囊泡分离和富集方法”是一种超滤和sec柱法结合的方法，但此法用sec柱法结合超滤法浓缩处理又大大提高了材料成本，而且收超滤管限制只能处理少量尿液样本。


技术实现要素：

4.本发明主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种解决了上述外泌体提取方法的弊端，实现了尿液外泌体提取样本处理量大，提取量多，操作简单，低成本，纯度高的一种基于peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用。
5.本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：
6.一种基于peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用，按如下步
骤进行实施：
7.(1)、最佳选择新鲜晨尿，在2～8℃，150～500
×
g离心5～15min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；
8.(2)、将(1)中获得的尿液上清液，在2～8℃，1000～2000
×
g离心5～20min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；
9.(3)、将(2)中获得的尿液上清液，置于﹣20～-80℃冰箱中冷冻30min或以上，2～8℃或常温解冻后，重复(2)中离心步骤，在2～8℃，1000～2000
×
g离心5～20min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液；
10.(4)、将(3)中获得的尿液上清液，转移到新的离心管；底部沉淀用dtt或tcep处理，37℃摇床震荡孵育10～30min；
11.(5)、将(3)中获得的尿液上清液，倒入(4)中沉淀处理后的离心管，加入适量peg溶解并混匀，使得终浓度为5％～20％；
12.(6)、将(5)中含5％～20％peg的尿液，于4℃冰箱，静置过夜；在2～8℃，5000～10000
×
g离心30min～1h，弃尿液上清液，倒扣于吸水纸上5～10min；
13.(7)、用移液枪吸取0.5～1ml的pbs溶液，反复吹打冲洗离心管中下端壁上和底部1～3min，收集悬浮沉淀；此处pbs溶液的ph值为7.2～7.4；
14.(8)、将(7)中收集的悬浮沉淀置于低速离心机150～500
×
g旋转30s～1min，弃残留的peg颗粒；收集上清，得到悬浮沉淀可置于-80摄氏度保存；
15.(9)、sec柱，经3倍柱体积pbs溶液润洗平衡，此处pbs溶液的ph值为7.2～7.4；底盖出口无液体流出后，封住底盖出口，准备好1.5～2ml离心管，按顺序写好编码；加入悬浮沉淀，打开底盖，按离心管编码顺序接取sec柱流通液；待底盖出口无液体流出，再加洗脱液pbs溶液，此处pbs溶液的ph值为7.2～7.4；继续接取sec柱流通液；除去空柱体积约1.5ml，收集所需外泌体的体积为空柱体积之后的1～2ml洗脱液；收集的外泌体于-80摄氏度保存。
16.作为优选，所述的步骤(4)中的dtt或tcep工作浓度为100～200mg/ml，每管沉淀使用量为50～500ul。
17.作为优选，所述的步骤(5)中的peg选用peg4000或peg6000中的一种。
18.作为优选，所述的步骤(5)中的peg溶解于处理后的尿液上清液，并使其混合液终浓度为5％～20％(g/v)。
19.作为优选，所述的步骤(7)中反复吹打冲洗离心管中下端壁上和底部1～3min，动作需轻柔，旋转离心管，让pbs沿着管壁将外泌体洗脱下来。
20.作为优选，所述的步骤(9)中sec柱为琼脂糖凝胶柱。
21.作为优选，所述的步骤(9)中琼脂糖凝胶柱型号分别包括2b、2b-l、4b、4b-l。
22.作为优选，所述的步骤(9)中sec柱，柱体积为5～10ml。
23.作为优选，所述的步骤(9)中收集所需外泌体的体积为空柱体积之后的1～2ml洗脱液。但若想得到更高浓度的外泌体，优选为收集1～1.5ml洗脱液。
24.创新点：
25.①
通过两步差速离心，在2～8℃，150～500
×
g离心5～15min，去除尿液中的杂质和活细胞。在2～8℃，1000～2000
×
g离心5～20min，去除尿液中的死细胞和残骸。此步骤在去除尿液死细胞和残骸前，先通过更低速的离心步骤，将活细胞和一些杂质先去除，这种方
式可以防止离心步骤导致活细胞破裂，内部蛋白等释放，降低后期分离外泌体的难度。
26.②
尿液上清液，置于﹣20～-80℃冰箱中冷冻30min或以上，2～8℃或常温解冻后，在2～8℃，1000～2000
×
g离心5～20min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液。此冻融的方法是我们一大创新点，可以让尿液中的尿结晶等杂质大量析出，低速离心后去除，以免残留于后续提取的尿液外泌体中，影响外泌体纯度。
27.③
高效收集外泌体的操作方法：一边旋转离心管，一边用移液枪吸取加入的pbs，沿离心管壁反复轻轻吹打冲洗离心管中下端和底部1～3min，让pbs沿着管壁将外泌体完全洗脱下来。
28.④
peg沉淀法与sec柱法相结合：解决了sec柱法只适合少量样品处理，peg沉淀法杂蛋白多，纯度低的弊端。此方法可以通过提高样本量多至500ml以上，获得更多外泌体。琼脂糖凝胶sec柱，流通液采点bca检测蛋白浓度，成功避开空柱体积，以及在外泌体后流通下来的杂蛋白区域，进一步提高了提取的外泌体纯度：
29.1、将含5％～20％peg(peg4000或peg6000)的尿液，于4℃冰箱，静置过夜。在2～8℃，5000～10000
×
g离心30min～1h，弃尿液上清液，倒扣于吸水纸上5～10min。
30.2、用移液枪吸取0.5～1ml的pbs溶液(ph7.2～7.4)，反复吹打冲洗离心管中下端壁上和底部1～3min，收集悬浮沉淀。
31.3、将收集的悬浮沉淀置于低速离心机旋转30s～1min，弃残留的peg颗粒。收集上清，得到悬浮沉淀可置于-80摄氏度保存。
32.4、sec柱(琼脂糖凝胶柱2b、2b-l、4b、4b-l)，柱体积为5～10ml，经3倍柱体积pbs溶液(ph7.2～7.4)润洗平衡，底盖出口无液体流出后，封住底盖出口，准备好1.5～2ml离心管，按顺序写好编码。加入悬浮沉淀，打开底盖，按离心管编码顺序接取sec柱流通液。待底盖出口无液体流出，再加洗脱液pbs溶液(ph7.2～7.4)，继续接取sec柱流通液。除去空柱体积约1.5ml，收集所需外泌体的体积为空柱体积之后的1～2ml洗脱液。收集的外泌体于-80摄氏度保存。
33.本发明通过差速离心先后去除细胞以及细胞碎片。此步骤在去除尿液死细胞和残骸前，先通过更低速的离心步骤，将活细胞和一些杂质先去除，这种方式可以防止离心步骤导致活细胞破裂，内部蛋白等释放，降低后期分离外泌体的难度。本发明采用冻融的新方法，通过冷冻﹑复融﹑析出﹑再离心的操作，去除了通过简单的离心步骤不能去除的大量的尿液结晶﹑蛋白等杂质，大大提高了尿液外泌体的提取质量。本发明将peg沉淀法与sec柱法巧妙结合，解决了sec柱法只适合少量样品处理，peg沉淀法杂蛋白多，纯度低的弊端。琼脂糖凝胶sec柱，流通液采点bca检测蛋白浓度，成功避开空柱体积，以及在外泌体后流通下来的杂蛋白区域，进一步提高了提取的外泌体纯度。本发明通过差速离心，冻融去杂质，peg沉淀法与sec柱法巧妙结合(一次可处理大量的尿液样本)，高效收集外泌体的创新组合实现了低成本，操作简单，得率高，纯度高。
34.本发明设计了一种基于peg沉淀法与sec柱相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用。通过提取方法的研究与改进，实现了尿液外泌体提取一次可处理大量尿液样本，操作简单，成本低，得率高，纯度高。本发明结合了两种外泌体提取方法的优点，扬长避短，大大提高了尿液外泌体提取效果。既解决了peg沉淀法提取外泌体杂蛋白多的问题，又解决了sec柱不适合大量样本处理的问题(如实施例1中，样本量为50ml，我们还可以将一次样本量提
高10倍甚至更多，来提高外泌体得率)，同时省去sec后续富集外泌体超滤的步骤。避开了超滤管处理尿液样本量小，超滤膜的成本较高的缺点。
35.本发明还在实验过程中，首次发现通过冻融尿液，可以析出大量的尿液结晶等杂质，通过低速离心去除，提高了后续外泌体提取的纯度。本发明通过流通液采点bca检测蛋白浓度，成功避开空柱体积，以及在外泌体后流通下来的杂蛋白区域，进一步提高了提取的外泌体纯度。
36.本发明通过差速离心，冻融去杂质，peg沉淀法与sec柱法巧妙结合(一次可处理大量的尿液样本)，高效收集外泌体的创新组合实现了低成本，操作简单，得率高，纯度高。
附图说明
37.图1为本发明的实验流程图；
38.图2为western blot方法验证peg沉淀法得到的三个不同个体的尿液外泌体，hsp70，tsg101，cd9和cd63为人类的外泌体标志性蛋白；
39.图3为peg沉淀法得到的尿液外泌体稀释1000倍上机，zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行nta检测。上机检测浓度为4.0
×
107particles/ml，原外泌体浓度为4.0
×
10
10
particles/ml；
40.图4为western blot方法重复验证peg沉淀法与sec柱2b结合得到的尿液外泌体，hsp70，tsg101，cd9为人类的外泌体标志性蛋白；
41.图5为peg沉淀法与sec柱2b结合得到的尿液外泌体稀释1000倍上机，zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行nta检测。上机检测浓度为3.1
×
107particles/ml，原外泌体浓度为3.1
×
10
10
particles/ml；
42.图6为western blot方法重复验证peg沉淀法与sec柱2b-l结合得到的尿液外泌体，hsp70，tsg101，cd9为人类的外泌体标志性蛋白；
43.图7为peg沉淀法与sec柱2b-l结合得到的尿液外泌体稀释1000倍上机，zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行nta检测。上机检测浓度为1.8
×
107particles/ml，原外泌体浓度1.8
×
10
10
particles/ml；
44.图8为western blot方法重复验证peg沉淀法与sec柱4b结合得到的尿液外泌体，hsp70，tsg101，cd9为人类的外泌体标志性蛋白；
45.图9为peg沉淀法与sec柱4b结合得到的尿液外泌体稀释1000倍上机，zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行nta检测。上机检测浓度为1.4
×
107particles/ml，原外泌体浓度1.4
×
10
10
particles/ml；
46.图10为western blot方法重复验证peg沉淀法与sec柱4b-l结合得到的尿液外泌体，hsp70，tsg101，cd9为人类的外泌体标志性蛋白；
47.图11为peg沉淀法与sec柱4b-l结合得到的尿液外泌体稀释1000倍上机，zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行nta检测。上机检测浓度为2.3
×
107particles/ml，原外泌体浓度2.3
×
10
10
particles/ml；
48.图12为sec柱过柱的流动相进行bca检测。从左到右，依次为空柱体积，外泌体收集区域，杂蛋白区域。外泌体先于杂蛋白等通过sec柱被洗脱下来，实现外泌体纯化；
49.图13为western blot 1，2重复为商业化试剂盒q提取外泌体效果，3，4重复为我们
的peg沉淀法与sec柱相结合的尿液外泌体提取试剂盒提取效果。hsp70，tsg101，cd9为人类的外泌体标志性蛋白。
具体实施方式
50.下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
51.实施例1：如图所示，外泌体制备：
52.一种基于peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用，包括如下步骤：
53.(1)新鲜晨尿50ml，在4℃，180
×
g离心10min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液。
54.(2)将(1)中获得的尿液上清液，在4℃，1550
×
g离心20min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液。
55.(3)将(2)中获得的尿液上清液，置于-80℃冰箱中冷冻30min，常温解冻后，重复(2)中离心步骤，在4℃，1550
×
g离心10min，弃去离心后底部沉淀，获得尿液上清液。
56.(4)将(3)中获得的尿液上清液，转移到新的离心管。底部沉淀用100ul的200mg/ml dtt或tcep处理，37℃摇床震荡孵育30min。
57.(5)称4g peg6000加入沉淀处理后的离心管，将(3)中获得的尿液上清液，倒入，定容到50ml，使得终浓度为8％。
58.(6)将(5)中含8％peg6000的尿液，于4℃冰箱，静置过夜。在4℃，10000
×
g离心1h，弃尿液上清液，倒扣于吸水纸上5min。
59.(7)用移液枪吸取0.5ml的pbs溶液(ph7.2～7.4)，反复吹打冲洗离心管中下端壁上和底部3min，收集0.5ml悬浮沉淀。
60.(8)将(7)中收集的悬浮沉淀置于低速离心机180
×
g旋转30s，弃残留的peg颗粒。收集上清，得到悬浮沉淀可置于-80摄氏度保存。
61.(9)sec柱选用琼脂糖凝胶2b柱。柱体积为8ml，柱子用24ml pbs溶液(ph7.2～7.4)润洗平衡，底盖出口无液体流出后，封住底盖出口，准备好1.5ml离心管，按顺序写好编码。加入0.5ml悬浮沉淀，打开底盖，按离心管编码顺序接取sec柱流通液。待底盖出口无液体流出，再加洗脱液pbs溶液(ph7.2～7.4)，继续接取sec柱流通液。除去空柱体积约1.5ml，收集所需外泌体的体积为空柱体积之后的1ml洗脱液。收集的外泌体于-80摄氏度保存。
62.实施例2：外泌体鉴定：
63.一种基于peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用，提取的外泌体分别用western blot方法以及zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行鉴定。
64.图2western blot方法验证peg沉淀法得到的三个不同个体的尿液外泌体，hsp70，tsg101，cd9和cd63为人类的外泌体标志性蛋白。
65.图3peg沉淀法得到的尿液外泌体稀释1000倍上机，zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行nta检测。上机检测浓度为4.0
×
107particles/ml，原外泌体浓度为4.0
×
10
10
particles/ml。
66.图4western blot方法重复验证peg沉淀法与sec柱2b结合得到的尿液外泌体，hsp70，tsg101，cd9为人类的外泌体标志性蛋白。
67.图5peg沉淀法与sec柱2b结合得到的尿液外泌体稀释1000倍上机，zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行nta检测。上机检测浓度为3.1
×
107particles/ml，原外泌体浓度为3.1
×
10
10
particles/ml。
68.图6western blot方法重复验证peg沉淀法与sec柱2b-l结合得到的尿液外泌体，hsp70，tsg101，cd9为人类的外泌体标志性蛋白。
69.图7peg沉淀法与sec柱2b-l结合得到的尿液外泌体稀释1000倍上机，zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行nta检测。上机检测浓度为1.8
×
107particles/ml，原外泌体浓度1.8
×
10
10
particles/ml。
70.图8western blot方法重复验证peg沉淀法与sec柱4b结合得到的尿液外泌体，hsp70，tsg101，cd9为人类的外泌体标志性蛋白。
71.图9peg沉淀法与sec柱4b结合得到的尿液外泌体稀释1000倍上机，zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行nta检测。上机检测浓度为1.4
×
107particles/ml，原外泌体浓度1.4
×
10
10
particles/ml。
72.图10western blot方法重复验证peg沉淀法与sec柱4b-l结合得到的尿液外泌体，hsp70，tsg101，cd9为人类的外泌体标志性蛋白。
73.图11peg沉淀法与sec柱4b-l结合得到的尿液外泌体稀释1000倍上机，zetaview纳米颗粒跟踪分析仪进行nta检测。上机检测浓度为2.3
×
107particles/ml，原外泌体浓度2.3
×
10
10
particles/ml。
74.实施例3：外泌体分离纯化效果鉴定：
75.一种基于peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用，外泌体分离纯化，去除杂蛋白效果鉴定。
76.图12sec柱过柱的流动相进行bca检测。从左到右，依次为空柱体积，外泌体收集区域，杂蛋白区域。外泌体先于杂蛋白等通过sec柱被洗脱下来，实现外泌体纯化。
77.实施例4：一种基于peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用，提取外泌体的效果与商业化试剂盒q进行对比。
78.结果显示我们的peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒提取的外泌体三个阳性标志物明显强于商业化试剂盒q，提取效果好很多。
79.图13western blot 1，2重复为商业化试剂盒q提取外泌体效果，3，4重复为我们的peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒提取效果。hsp70，tsg101，cd9为人类的外泌体标志性蛋白。