用于培养软骨及其球状体的方法与流程

用于培养软骨及其球状体的方法
1.说明书
2.本发明涉及用于增殖或富集软骨细胞并且提供其球状体的方法，其中所述球状体对于自体软骨细胞植入(autologous chondrocyte implantation；aci)产品来说是有用的。因此，本发明特别地涉及从关节软骨来产生球状体，以及其用途。
3.虽然关节软骨显示出值得注意的复原力，但是该组织不能或几乎不能修复自身，并且未治疗的损害可以导致例如骨关节炎。这种低的进行自发再生的潜力已经导致了细胞疗法(例如，自体软骨细胞植入(aci))的发展，以力求提供功能性的和无痛的关节软骨缺损的修复。但是，该类型的技术无法保证软骨再生，并且以前没有任何足够的长期研究。因此，存在高的对于用于软骨再生的方法的需求，例如在具有创伤性损害或甚至具有软骨变性症状的年轻的有活力的患者中。
4.已经用从牛、兔子或绵羊中分离出的软骨细胞进行了许多研究。但是，无法将所获得的数据和该类型的基于动物的概念转移至人的情形。用人软骨细胞的详细生物化学和分子研究受到一系列因素的阻碍，例如与非常少数目的在活组织检查中可用的细胞相联系的人组织的可得性不足，经培养的软骨细胞的有限的增殖能力和高的表型不稳定性。
5.软骨细胞是一种来源于成软骨细胞并定居在软骨组织中的细胞。与细胞间质(细胞外基质(ecm))一起，软骨细胞构成软骨的主要组成部分。
6.天然关节软骨具有相对于关节组织的湿重而言大约60-80％的水的所形成的细胞外基质的组成。高的含水量对于软骨组织的机械负荷能力来说是重要的，并且与蛋白聚糖一起对于“海绵效应”来说是重要的。除了水之外，天然软骨关节还包含基质的结构大分子，例如胶原、蛋白聚糖和非胶原蛋白质。在该情况下，结构大分子总计为关节软骨组织的湿重的大约20-40％。
7.已经知道，例如通过模拟胚胎发育的某些过程，例如在琼脂糖基底上三维地培养人软骨细胞，从而产生在其分化状态方面优于单层细胞并且具有例如软骨样特性的细胞聚集体。尽可能准确地反映了天然关节软骨组织的这些特性以胶原ii(透明软骨的细胞外基质中的主要结构蛋白质)、蛋白聚糖(例如，聚集蛋白聚糖)和细胞内的软骨细胞特异性的蛋白s100的表达为特征。另外，希望的是，在以单层培养物的细胞扩增期期间必然被上调的胶原i的表达在细胞聚集体中重又降低，这是因为这种蛋白质在天然关节软骨中实际上不存在。自2002年以来，如此产生的细胞聚集体(球状体)已例如由申请人(co.don ag)提供以便因此主要治疗由损伤引起的较小的软骨缺损。为此，从患者中取出天然关节软骨组织，并且将从中分离出的细胞在扩增和3d培养后作为球状体进行移植。一种自体软骨细胞植入(aci)产品称为
8.以三维细胞聚集体的形式(特别是以称为球状体的形式)的人细胞的培养已经被批准用于在人中的临床应用，例如作为自体软骨移植物(de 100 13 223)。de 100 13 223涉及用于在体外从骨干细胞、软骨干细胞或间充质干细胞产生三维软骨组织和骨组织的方法。在该情况下，将细胞首先以单层培养物进行培养，然后以悬浮液进行培养，直至产生细胞聚集体，其包含至少40体积％的细胞外基质，在其中包埋有经分化的细胞。在所述方法
中，通过将细胞在包覆有琼脂糖的细胞培养容器中培养至少1-2周来产生细胞聚集体。
9.us 7 887 843 b2公开了一种用于在体外产生三维软骨组织和骨组织的方法，其中通过将1
×
105个细胞培养至少两周来从骨干细胞、软骨干细胞或间充质干细胞产生球状体。根据us 7 887 843 b2所产生的球状体在一周后具有500-700μm的直径。按照该方法，将1
×
105或2
×
105个软骨细胞培养5天、2周、1个月、2个月和3个月以便产生球状体。
10.根据本发明，将源自患者的组织活组织检查物用作起始材料。根据常规方法从活组织检查物中分离出构建组织的细胞，其中使用组织的酶促消化、迁移或识别靶细胞的试剂。
11.根据本发明，然后使这些细胞经历静止培养，其中在细胞培养容器(特别地具有疏水表面)中通过使用常规培养基，将细胞首先以基底支持的单层培养物(二维的)进行培养，然后在悬浮液中以没有基底的简单方式进行培养，直至形成三维细胞聚集体，其包括至少40体积％和直至最大95体积％的细胞外基质(ecm)，其具有包埋在其中的经分化的细胞。在本发明的意义下将如此形成的聚集体称为球状体。
12.作为根据本发明的细胞培养容器，在悬浮液中的培养步骤需要使用具有疏水的(即防粘附的)表面，例如聚苯乙烯或teflon等的那些细胞培养容器。具有非疏水表面的细胞培养容器可以优选地通过用琼脂或琼脂糖进行包覆来疏水化。不需要进一步的添加剂。优选地，使用96-孔平板作为细胞培养容器。
13.值得注意的是，整合在根据本发明而产生的球状体中的细胞存活，并且甚至在培养后期之后内部的细胞也不坏死。随着培养时间增加，在聚集体内部的细胞经历分化以形成由ecm、经分化的细胞和外周增殖区带组成的球状体。形成具有所包埋的细胞的组织特异性基质的过程与在身体内组织形成或新生和再组织的过程高度相似。在细胞培养物中进行分化期间，由于组织特异性基质的形成，所聚集的细胞的间隔增加。组织组织学在球状体内部发展，这与天然组织高度相似。如在天然软骨中那样，在球状体内部的细胞仅通过扩散被供给营养物。在球状体产生的进一步过程中，在球状体的边界处形成能够增殖和迁移的细胞的区带。该区带是无价地有利的，因为在球状体掺入到缺损中之后，位于该外周区带中的细胞能够迁移以与周围组织进行主动接触和/或使得在体外产生的组织能够整合到其环境中。因此，所产生的组织特异性细胞聚集体出色地适合于在组织缺损的治疗中和在组织的体外和体内新生中使用。
14.但是，本发明的一个目标是改进已知的方法和至此为止可获得的球状体，特别是减少非应答者或治疗失败的患者或患者群体的结果并且提供用于更高患者临床安全性的方法。这样的非应答者患者可以通过相比于手术前情形而言8-10个点的所谓的koos值变化来鉴定(roos em,lohmander ls.the knee injury and osteoarthritis outcome score(koos):from joint injury to osteoarthritis.health qual life outcomes 2003,1:64)。
15.令人惊讶地，发明人从一项包括120名患者的研究(nct01225575和nct0122259)中得出结论，与方法相关的运作范围或过程参数对于球状体的效力具有有价值的影响。
16.因此，作为基础的技术问题通过至少一个声索项而得到解决，其中培养时间是一个关键特征。
17.特别地，本发明涉及用于增殖或富集软骨细胞并且提供其球状体的方法，所述方
法包括下列步骤：
18.a)从人或动物来源的组织中分离出软骨细胞，
19.b)以扩展单层(2d)的方式来培养来自a)的细胞，其中所述单层被放置于基底上，
20.c)取来自a)的单层并且在3d环境中在悬浮液中培养所述细胞，
21.d)其中步骤b)和步骤c)的总培养时间等于或小于55天，其是从步骤a)的开始时间起进行计算的，并且其中步骤b)的持续时间大于10天，
22.e)选择所获得的球状体。
23.在本发明的一个优选的实施方案中，步骤b)的持续时间小于38天，和/或步骤c)的持续时间小于28天。
24.在本发明的一个优选的实施方案中，步骤b)的持续时间大于10天或大于16天或大于20天且小于38天。
25.在本发明的一个优选的实施方案中，步骤b)的持续时间大于10天且等于或小于16天。
26.令人惊讶地，对所获得的球状体分别就数量和大小(直径)进行优化并因此提供了具有最好效力的球状体，这导致非应答者或治疗失败的患者或患者群体(特别是具有《8的koos值的患者，如下面所概述的)的可持续减少。
27.因此，所获得和所选择的球状体由在3,000至200,000个细胞的优化范围内，优选地在3,500至75,000个细胞的范围内的细胞组成。
28.此外，球状体的直径(尺寸)在100至1,000μm，优选地200至900μm，或者优选地240至870μm的优化范围内。
29.所获得或所选择的此类球状体对于治疗10cm2缺损来说是最有效的并且可治愈的，其中使用10-70个球状体/cm2的量。
30.将以这种方式获得的球状体进一步进行处理以形成药用制备物。
31.在本发明的意义之内，“基底”应当意指任何适合于承载单层的材料。
32.培养通过使用本领域普通技术人员已知的细胞培养条件和培养基来进行(schubert t,anders s,neumann e, j,f,grifka j,m
ü
ller-ladner u,libera j,schedel j.int j mol med.2009apr,23(4):455-60)。
33.本发明的方法允许软骨细胞及其球状体的有利的富集和增殖。
34.根据本发明，在koos值与过程参数例如第一次传代前的单层培养时间(简称：p0)(斯皮尔曼(spearman)，p＝0.025)(图1a)、球状体培养时间(简称：3d)(p＝0.026)(图1c)和以单层(简称：ml)和球状体的软骨细胞的总培养时间(p＝0.007)(图1e)之间发现了负相关。在图1中，对于患者的每个球状体批次，将koos总体δ得分相对于在p0、3d和ml 3d方面的细胞培养时间进行作图，其显示出负相关(图1a-c)。这些初步发现暗示，较短的培养时间有益于产品的品质，其表现为在植入后更好的临床结果。这得到了下述观察结果的支持：非应答者组(koos《8)已接受了以相比于应答者组而言显著更长的在p0方面的培养时间制备的球状体批次(图5a)。此外，ml和3d的总细胞培养持续时间看起来在非应答者组中平均更长(图5b)。这强调了需要基于研究数据来重新定义和限制关于细胞培养时间的运作范围或过程参数，以避免对于球状体效力的负影响和对于患者结果的不利之处。
35.为了确定关于软骨细胞培养的临时最大时间，随后从数据集中删除具有最长培养
时间的批次，直至负相关消失(斯皮尔曼相关系数)。对于第一次传代前的ml培养时间(p0)，在19天定义出对于临床结果没有负效应的最大培养时间。但是，在p0方面的19天的培养之时，该批次属于非应答者。因此，将临时最大培养时间设定在18天(图1d)。将关于球状体培养的临时最大允许时间设定在31天(图1e)。对于在ml和3d方面的总培养时间，当从数据集中去除已培养了超过16天(在p0方面)和28天(在3d方面)的那些批次时，仅剩下了具有直至55天的培养时间的批次。在该组患者/批次中，令人惊讶地发现在总培养时间与效力之间没有相关性(图1f)。
36.由于在临床结果与p0、3d和总培养时间之间的相关系数是非常低的(-0.2)，因而就非应答者(koos得分《8)的出现率进一步分析以高培养时间产生的批次。这在用以19至28天的ml p0进行培养的球状体批次进行治疗的患者组中揭示了80％的值得注意地高的非应答者比率，而对于以16至28天进行培养的批次揭示了61.5％(参见表1)。以直至16天进行培养的批次展示出28％的非应答者比率，其相比于在完全临床研究组中31.7％的非应答者而言是显著更低的。通过与在制备期间培养时间的可行性一起来考虑非应答者比率，将临时最大培养时间定义在(但不进一步限制超过)16天。
37.进行相同的分析以定义关于球状体培养时间的临时界限。在从数据集中删除已培养了长于32天的球状体批次后，负相关消失了(图1e)。但是，将临时界限设定在31天，因为培养了32天的球状体批次均属于非应答者(n＝4)。进一步地，用以3d培养了32至42天的球状体进行治疗的患者显示出59％的相对高的非应答者比率(n＝17)(参见表2)，这强调了还要限定3d培养时间的需求。考虑了直至28天的可能限制以进一步降低非应答者比率。的确，在29和42天的培养之间，50％的非应答者比率表明在3d方面的培养时间的进一步限定可以改善应答者比率。与此相一致，当将培养从42天限制至直至最大28天时，在该组中非应答者比率是更低的；非应答者比率分别为31.7％对26.6％(参见表2)。再次，不仅基于非应答者比率，而且还基于关于球状体培养时间的可行性，将球状体培养时间进一步限制于最大28天。
38.如从ml和3d培养时间的分开的评估所预期的，总培养时间也与临床结果负相关(图1c)。为了鉴定在制备过程期间ml和3d的累加效应，首先通过从包含52％非应答者的数据集中去除培养超过16天(在p0方面)和超过28天(在3d方面)的批次来排除独个的效应(参见表3)。将仍留在该分析中的球状体批次的组培养等于或小于55天。在该组中，在培养时间与临床结果之间未能发现相关性，从而证明当在新定义的培养时间之内培养批次时，不存在p0和3d一起的累加效应(图1f)。因此，基于非应答者比率的进一步限制将会仅考虑整个培养时间(ml 3d)对于临床效力和安全性的影响。已培养了直至55天的批次的组显示出26.1％的非应答者比率，其相比于总批次组的31.7％而言是显著的改善。
39.因此，根据本发明的最佳方案，将总培养时间限定至等于或小于55天。
40.总之，这些分析证明了具有长的培养时间的批次的高的非应答者比率，并且强调了需要调整关于软骨细胞培养时间的运作范围。
41.考虑到在用具有长的培养时间的批次进行治疗的患者之中高的非应答者出现率，就在新定义的界限之外的延伸的培养时间比较了非应答者组和应答者组。从该点起，仅进一步分析了在该研究中所包括的患者，因为该研究组使得能够进行与微小骨折(mfx)治疗组的比较。在该研究中，总患者组的25％(n＝12)在植入后1年之后对于aci治疗没有作出应
答。如果我们查看该组，12名非应答者中的两名(16.7％)看起来已经培养了长于16天(在p0方面)，而仅8.5％的应答者是这种情况(n＝36人中的3人)。对于延长的3d培养时间，在非应答者与应答者之间看到更引人注目的差异；属于非应答者组的12个批次中的7个(58.3％)以3d培养了长于28天，而仅16.6％的应答者批次(n＝8)是这种情况。相比于应答者组(22.2％)而言，在非应答者组(66.7％)中在新限制的培养时间之外制备的批次的过多呈现再次证明了需要调整培养时间。在总研究组中，67％的批次按照更严格的运作范围(operational range；or)来产生，亚组1，和33％的批次在新定义的培养界限之外产生，亚组2。
42.如果运作范围或过程参数不与临床效力相关，那么在aci后未导致临床改善的批次的分布将会在具有短的和长的培养时间的批次组之间相等地分布。因此，这些分析表明了koos与培养时间之间的初始相关性分析，并且表明制备过程可以至少部分地引起用于aci的软骨细胞球状体的效力的丧失。
43.如果细胞培养时间的限制是有效的从而可以预期到aci治疗的临床效力的改善，那么就通过与比较者mfx的比较来定量关于研究批次的可能改善。在定义了新的关于在ml、3d和总培养时间方面的细胞培养时间的界限后，进行临床数据的回顾性评估。在该情况下，将患者分为两个组。该划分是基于从研究数据集中去除批次，如前面所描述的。所述亚组由下列组成：在新定义的关于过程参数p0、3d和ml 3d的运作范围之内产生的球状体批次，亚组1；或者在这些范围之外在所述培养阶段中的至少一个之中产生的球状体批次，亚组2。在图2中描绘了在所述两个亚组之间的培养时间的差异。
44.在该情况下，显示了在亚组2的批次中，在单层(ml)和3d和总培养时间(ml 3d)方面的培养时间是显著更长的(图2b-d)。但是，对于p0，在这两个亚组之间没有统计学上显著的差异(图2a)。这归因于这样的事实，即一些具有延伸的3d培养时间并因此被分配至亚组2的批次仍然具有在新定义的范围之内的p0培养时间。
45.将由32名用以经限制的培养时间所产生的软骨细胞球状体进行治疗的患者组成的亚组1与总研究患者组进行比较，以发现在临床结果方面的差异。相比于总研究组中的75％而言，该亚组包含87.5％的更高数量的应答者(图3)。相反地，16名用在新定义的运作范围之外进行培养的球状体批次进行治疗的患者的亚组在植入后1年之后显示出仅50％阳性临床结果(图3)。
46.为了比较用通过经调整的制备过程而产生的球状体进行治疗的患者的临床改善，在这些批次与微小骨折治疗(mfx)之间进行优效性(superiority)分析，参见表4。
47.表4：
48.49.在植入aci产品后1年之后的研究临床结果显示出相比于微小骨折(mfx)外科手术而言并不差(图4)。相比于mfx而言基于软骨细胞球状体的aci的koos(总体δ)平均值之间的差异支持aci治疗，其中在植入后1年之后具有5.75个点。以95％的置信区间(ci95％)，-1.03的下限证明了相比于mfx而言aci治疗的非劣效性(non-inferiority)(图4)。为了探究在新定义的运作范围之内制备的亚组的基于koos的临床结果的可能改善，计算了在aci亚组1和mfx koos得分之间的平均值的差异。该球状体批次亚组代表了的当前的商业制备过程，并且相比于mfx而言10.21的平均值差异(ci 95％)和2.53的下限现在显示了相对于mfx的优效性(图4)。因此，从数据集中回顾性地去除具有长培养时间的特定批次组导致在该组中更高的平均koos得分。
50.本发明进一步涉及通过根据本发明的方法可获得的植入物、移植物和功能替代组织。可以将在体外或在体内产生的植入物、移植物或功能替代组织引入到接受者的周围天然组织中，优选地通过注射。在通过根据本发明的方法而产生的球状体中，也就是说也在所述植入物、移植物或功能替代组织中，没有细胞分裂发生。如果将所述功能组织引入到天然组织中，那么球状体就会附着至该天然组织(粘附)并且迁移入间隙中(迁移)，但是没有分裂。因此确保了最佳的供应/恢复，但是没有所述功能替代组织的不受控增殖的风险。为此，将所获得的在体外产生的本发明的球状体注射到患病或降解的组织中。为此，注射针头或其他合适的施加系统必须至少具有球状体的直径。合适的运输和注射系统公开在申请人的de102009025347a1和ep2345450b1中。
51.本发明还涉及制备物，特别是药用制备物或组织制备物，药物，移植物，或植入物，其由下列组分组成或者包含下列组分：通过根据本发明的方法可获得的球状体，和任选地，进一步的赋形剂和添加剂。
52.本发明还涉及药用制备物、组织制备物和药物，特别是悬浮液和溶液，特别是注射溶液，其包含根据本发明的球状体，和任选地，进一步的赋形剂和添加剂。
53.本发明还涉及根据本发明的药用制备物、组织制备物、根据本发明的药物、根据本发明的移植物或根据本发明的植入物的特定的治疗学/药学用途，所述用途为用于治疗软骨缺损和/或骨缺损，特别是创伤性软骨缺损和/或骨缺损，损害，特别是创伤性损害，软骨变性，骨变性，骨关节炎，和用于体内治疗性软骨再生和/或骨再生。
54.下面的附图和实施例将会解释本发明，但并不将本发明限制于这些附图和实施例。
55.将该研究(见上文)的总共120名患者用于在临床结果与运作范围或过程参数之间的统计学相关性分析。在该研究中所使用的用于就临床效力进行测量的主要终点(primary endpoint)为从基线开始的“膝盖损伤和骨关节炎结果得分(knee injury and osteoarthritis outcome scores)”(koos)变化。在本研究中评估了来自72名患者、48名具有aci的患者和49名具有mfx治疗的患者的数据，并且将其提供在表5中。
56.表5：来自该研究的患者人口统计学数据
[0057][0058]
aci：自体软骨细胞植入。mfx：微小骨折外科手术。n：数目。bmi：体重指数。sd：标准偏差。最小：最小值。最大：最大值。n.a.：未注释。icrs：国际软骨再生和关节保护协会(international cartilage regeneration&joint preservation society)。
[0059]
使用在关节内窥镜检查之前(＝基线)和在植入后1年之后的总体koos得分(包括所有分量表)[19]。在这两个得分之间至少8个点的差异处将临床结果定义为是正的；从基线开始的总体变化是基于8-10的最小重要变化(minimal important change；mic)，如在关于koos调查表的用户指南中所描述的(www.koos.nu)。
[0060]
针对关于为了该研究而产生的每个批次的临床结果，在统计学上评估了在制备过程中所使用的在不同细胞培养物代系之间的单层培养时间、球状体培养时间和总培养时间的运作范围。
[0061]
为了随后了解新定义的用于细胞培养时间的范围和界限是否可能对于产品的效力具有影响，将该研究的48名患者分为用根据新定义的细胞培养时间而产生的批次进行治疗的一个组(亚组1)和在这些界限之外产生的批次的第二个组(亚组2)。将总组、亚组1和亚组2的koos总体δ得分的平均值分别与mfx组进行比较(优效性分析)。这两个亚组的患者特征列于表1中。
[0062]
统计学分析
[0063]
使用mann-whitney非配对t-检验(双尾，其中p-值《0.05被认为是显著的)来检验在平均值之间的差异。使用斯皮尔曼相关系数来进行相关性分析，其中p《0.05被认为是显著的。相比于mfx治疗而言的aci治疗的优效性/非劣效性分析通过具有welch校正的非配对t-检验来进行，其中置信区间为95％。所有统计学分析都通过使用graphpad prism v6(graphpad software,usa)来进行。
[0064]
图1.临床结果与细胞培养时间相关
[0065]
从在该研究中所使用的120个球状体批次中，针对在植入后1年之后的临床结果来评估运作范围。长的第一次传代前的以单层的培养时间(p0)(a)、以3d(球状体)的培养时间(b)和以ml和3d的总培养时间(c)与低的koos总体δ得分相关。从数据集中去除以长培养时间产生的球状体批次导致在p0(d)、3d(e)和总培养时间(f)方面相关性的丧失。这使得能够设定关于最大培养时间的临时界限(箭头)，从而培养时间对于药物产品的效力不具有负效应。将最大培养时间对于p0设定在18天(d)，对于3d设定在31天(e)，和对于以ml和3d的总培养时间设定在55天(f)。r＝斯皮尔曼相关系数，其中p-值《0.05被认为是显著的。koos＝膝盖损伤和骨关节炎结果得分。
[0066]
图2.在该研究的亚组1和亚组2中的软骨细胞培养时间
[0067]
将研究批次分为两个亚组；在新定义的最大培养时间之内进行培养的亚组1，和在这些界限之外进行培养的亚组2。在亚组2中球状体批次培养经过显著更长的时间，考虑到ml总培养时间，p＝0.003(b)，3d，p《0.001(c)，和以ml和3d的总培养时间，p《0.001(d)。在p0(a)中，培养时间在这两个亚组之间并不显著不同(p＝0.075)，因为该亚组包含在p0方面的or之内(《16天)进行培养的具有长的3d培养时间(》28天)的批次。通过使用mann-witney t-检验(双侧)来分析组之间的平均值，其中p-值《0.05被认为是显著的。
[0068]
图3.具有短的培养时间的球状体批次显示出经改善的应答者比率
[0069]
将经历了aci的患者分为两个亚组：由用以经限制的培养时间制备的球状体批次进行治疗的患者组成的亚组1，和用具有更长的培养时间的球状体批次进行治疗的亚组2。a：从总患者研究组中，75％的球状体批次属于应答者患者(koos》8)。b：在亚组1中，87.5％的患者显示出有关的临床改善(koos》8)，而在亚组2(c)中，仅50％的患者是这样。d：在研究比较者组(mfx)中，69％的患者在1年后显示出临床改善(koos》8)。
[0070]
图4.亚组1和2的优效性/非劣效性分析
[0071]
在移植后1年来自在该研究中所包括的患者的临床结果显示出相比于微小骨折(mfx)而言的非劣效性。两个亚组源自这样的研究，其包括在新定义的or之内进行培养的球状体批次(亚组1)或者在新定义的or之外进行培养的球状体批次(亚组2)。在治疗后1年，将总患者组、亚组1和亚组2的koos总体δ得分的平均值与经mfx治疗的患者的平均koos总体δ得分进行比较。对于在更多地经限制的培养时间之内制备的球状体批次的回顾性选择导致选择出具有显示出超过mfx治疗的优效性的临床结果的患者。
[0072]
图5a、5b.在非应答者患者组中的更长的软骨细胞培养时间
[0073]
从在该研究中所包括的120患者中，非应答者患者(koos总体δ得分《8)接受了以显著更长的在p0方面的培养时间(a)和总培养时间(b)产生的球状体批次。具有p《0.05的mann-witney t-检验被认为是显著的。p0＝第一次传代前的分离的软骨细胞的单层培养时间。
[0074]
表1：通过使用相关于细胞培养时间的非应答者比率来定义本发明的过程的运作范围(or)。标记有“n”的灰色的患者id相应于非应答者患者(koos《8)。
[0075]
表2：通过使用相关于球状体培养时间的非应答者比率来定义本发明的过程的运作范围(or)。标记有“n”的灰色的患者id相应于非应答者患者(koos《8)。
[0076]
表3：通过使用相关于总培养时间(单层和3d)的非应答者比率来定义本发明的过
程的运作范围(or)。标记有“n”的灰色的患者id相应于非应答者患者(koos《8)。
[0077]
进一步的参考文献：
[0078]
niemeyer p,laute v,john t,becher c,diehl p,kolombe t等人,the effect of cell dose on the early magnetic resonance morphological outcomes of autologous cell implantation for articular cartilage defects in the knee:a randomized clinical trial.am j sports med 2016.becher c,laute v,fickert s,zinser w,niemeyer p,john t等人,safety of three different product doses in autologous chondrocyte implantation:results of a prospective,randomised,controlled trial.j orthop surg res 2017；12:71.
[0079]
schubert t,anders s,neumann e,scholmerich j,hofstadter f,grifka j等人,long-term effects of chondrospheres on cartilage lesions in an autologous chondrocyte implantation model as investigated in the scid mouse model.int j mol med 2009；23:455-460.
[0080]
表1：
[0081]
[0082]
[0083]
[0084][0085]
r：应答者。n：非应答者。or：运作范围。
[0086]
表2：
[0087]
[0088]
[0089][0090]
r：应答者。n：非应答者。or：运作范围。
[0091]
表3：
[0092]
[0093]
[0094][0095]
r：应答者。n：非应答者。or：运作范围。