一种调节鱼类肠道健康的重组蛋白及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种调节鱼类肠道健康的重组蛋白及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肿瘤坏死因子fasl(factor associated suicide ligand)又称cd95l、cd178或tnfsf6，是一种重要的细胞凋亡因子，是机体免疫调控的重要组分，其功能活性包括诱发细胞凋亡、介导细胞毒反应、提高吞噬细胞吞噬活性、调节相关细胞因子和免疫效应物质的表达等多种功能，在机体的正常或病理条件下均发挥着重要的调控作用。然而，与高等动物广泛深入的研究状态相比，鱼类fasl的研究刚刚起步，有关fasl功能和应用性研究严重匮乏。
3.草鱼(ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，是我国淡水养殖的四大家鱼之一，其生长迅速，饲料来源广，具有重要的经济价值。但草鱼抗病力和成活率较低，易患出血病、烂鳃病、赤皮病和肠炎病等。加之高密度养殖增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会，使病害日益加剧，因此研究草鱼免疫系统的各类免疫反应及其调节机制十分重要。另外，由于肿瘤坏死因子在鱼类炎症反应中具有广泛生物学活性及其在免疫调控中的重要性，且鱼类肿瘤坏死因子与其他高等动物在结构和功能方面存在较大差距，因此开展鱼类fasl表达及活性研究具有重要的理论和应用价值。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种调节鱼类肠道健康的重组蛋白及其制备方法和应用。
5.为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
6.一种调节鱼类肠道健康的重组蛋白，所述重组蛋白为草鱼sfasl重组蛋白；所述草鱼sfasl重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种编码上述的调节鱼类肠道健康的重组蛋白的基因，所述基因的cdna序列如seq id no.2所示。
8.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种含有上述的基因的表达载体。
9.上述的表达载体，进一步改进的，所述表达载体为重组质粒pgex-4t-1-sfasl。
10.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种用于构建上述的表达载体的特异性引物，所述特异性引物中包含pgex-4t-1酶切位点ecor i/xho i以及6个his标签。
11.上述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物为cifasl-f2和cifasl-r2；所述cifasl-f2的序列如seq id no.5所示；所述cifasl-r2的序列如seq id no.6所示。
12.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的调节鱼类肠道健康的重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
13.s1、克隆草鱼fasl基因；
14.s2、根据草鱼fasl基因cdna序列，构建fasl功能结构域表达载体，得到草鱼sfasl蛋白基因；
15.s3、采用ecor i和xho i对草鱼sfasl蛋白基因、pgex-4t-1质粒进行双酶切，连接后转化，得到重组质粒pgex-4t-1-sfasl；
16.s4、将重组质粒pgex-4t-1-sfasl进行iptg诱导表达，得到重组蛋白，经纯化、复性后得到调节鱼类肠道健康的重组蛋白。
17.上述的制备方法，进一步改进的，步骤s1中，以构建好的草鱼cdna文库为模板，以cifasl-f1和cifasl-r1为引物进行pcr反应，得到草鱼fasl基因；所述cifasl-f1的cdna序列如seq id no.3所示；所述cifasl-r1的cdna序列如seq id no.4所示。
18.上述的制备方法，进一步改进的，步骤s2中，还包括以下步骤：根据草鱼fasl基因的cdna序列设计用于构建表达载体的特异性引物；所述特异性引物中包含pgex-4t-1酶切位点ecori/xhoi以及6个his标签；所述特异性引物为cifasl-f2和cifasl-r2；所述cifasl-f2的序列如seq id no.5所示；所述cifasl-r2的序列如seq id no.6所示。
19.上述的制备方法，进一步改进的，步骤s4中，所述iptg诱导表达为：在20℃下培育16h；所述iptg诱导表达过程中控制体系中iptg的浓度为0.05mm。
20.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的调节鱼类肠道健康的重组蛋白的应用，所述重组蛋白用于制备鱼类肿瘤坏死因子抗体。
21.作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的调节鱼类肠道健康的重组蛋白的应用，所述重组蛋白用于制备防治鱼类肠炎的药物或饲料添加剂。
22.与现有技术相比，本发明的优点在于：
23.(1)本发明中，首次从草鱼中获得的fasl基因cdna序列，为后续设计定量引物开发检测fasl表达水平的诊断试剂盒提供支撑，同时也将为进一步在预防和治疗肠炎中基于此序列开展rnai、基因敲除实验奠定基础。
24.(2)本发明开发了一种草鱼fasl原核表达载体，具体为重组质粒pgex-4t-1-sfasl，可在草鱼sfasl重组蛋白中同时引入gst标签和6
×
his标签蛋白序列，因而在蛋白纯化时可以同时利用2种标签蛋白进行纯化，获得高纯度和特异性的目的蛋白。与传统原核表达和纯化工艺相比，可以避免单独利用pgex和pet系列载体蛋白表达后掉标签而出现纯化难的现象，将有利于简化后续蛋白纯化工艺、降低成本、同时获得高质量的目的蛋白，实现工业化生产。
25.(3)本发明提供的草鱼sfasl重组蛋白，可用于制备相应鱼类肿瘤坏死因子抗体，也可用于制作饲料添加剂以及病害防治药物等，具备应用范围广、效益大的特点；同时，相比以往的fasl重组产物，本发明中草鱼sfasl重组蛋白具有很好的生物学活性和广泛的生物学功能，能够在短时间内显著改善肠道凋亡水平，降低肠道炎症因子的表达，显著缓解肠道炎症反应，有利于提高鱼类的抗病能力，容易推广应用。
附图说明
26.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
27.图1为本发明实施例1中草鱼fasl蛋白的sds-page分析图。
28.图2为本发明实施例1中草鱼sfasl重组蛋白的纯化效果图。
29.图3为本发明实施例1中草鱼sfasl重组蛋白诱导肠道凋亡通路基因的表达水平
图。
30.图4为本发明实施例1中草鱼sfasl重组蛋白抑制肠道炎症因子的表达水平图。
具体实施方式
31.以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
32.以下实施例中，若无特别说明，所采用的原料和仪器均为市售。
33.实施例1
34.一种调节鱼类肠道健康的重组蛋白，该重组蛋白为草鱼sfasl重组蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
35.一种上述本实施例中的调节鱼类肠道健康的重组蛋白(草鱼sfasl重组蛋白)的制备方法，包括以下步骤：
36.(1)草鱼肠道总rna提取：
37.取健康的鲜活草鱼(平均体重30g左右)，用消毒的镊子和剪刀解剖草鱼，分离草鱼肠道组织样品。肠道样品总rna使用rnaiso(takara)试剂提取，具体步骤如下：取100mg草鱼肠道组织于液氮预冷的研钵中，将组织磨成粉末之后，转移到装有1ml rnaiso的离心管中，吹打、混匀；加入200μl氯仿，剧烈震荡40s，室温放置5min；4℃，12,000
×
g离心15min，吸取上清0.5ml转移至新管；加入0.5ml的异丙醇，混匀；4℃，12,000
×
g离心10min，弃上清；用1ml 75％乙醇清洗rna沉淀；弃上清，加入30μl depc水溶解rna；用1.2％琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白定量仪分别检测rna的完整性和浓度。
38.(2)草鱼肠道cdna文库构建：
39.草鱼肠道cdna文库构建使用primescript
tm 1st strand cdna synthesis kit(takara)，具体步骤如下：在microtube管中制备cdna反转录反应液，包括1μl oligo dt primer(50μm)，1μg草鱼肠道总rna，1μl dntp mixture(10mm each)，加rnase free h2o将总体积补至10μl；65℃保温5min后，冰上迅速。在上述microtube管中配制下列反转录反应液：10μl上述变性后反应液，4μl 5
×
primescript buffer，0.5μl rnase inhibitor(40u/μl)，4.5μl rnase free h2o和1μl primescript rtase(200u/μl)；反应体系轻弹混匀，稍离心；42℃，60min；95℃，5min使反转录酶失活；冰上冷却，-20℃保存。
40.(3)草鱼fasl基因cdna序列克隆：
41.根据草鱼肠道转录组数据库中筛选到的序列信息，设计一对包含草鱼fasl基因的开放阅读框的特异性引物cifasl-f1和cifasl-r1，如下所示：
42.cifasl-f1：5'-tctcttgttgttcacaccttcac-3'(seq id no.3)；
43.cifasl-r1：5'-acccctgtaaacaccatacctaa-3'(seq id no.4)。
44.以构建好的cdna文库为模板，以cifasl-f1和cifasl-r1为引物进行pcr反应。
45.pcr反应体系为：37.75μl ddh2o,0.25μl ex taq dna polymerase(5u/μl,takara),5μl10
×
ex pcr buffer(mg
2
plus),4μl dntp mixture(2.5mm each),1μl正反引物(10μm),和1μl cdna模板。
46.pcr反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s、56℃30s、72℃90s(35个循环)；72℃10min；4℃保存。
urea,50mm tris,300mm nacl,0.1％triton x-100,ph8.0)溶解、超声破碎，离心收集上清粗蛋白；取5ml ni-nta，用5倍柱床体积的binding buffer(8m urea,50mm tris,300mm nacl,ph8.0)清洗平衡柱子，流速5ml/min；将粗蛋白与平衡后的柱填料孵育1h；将孵育后的产物上柱，收集流出；用binding buffer清洗平衡柱子；用washing buffer(8m urea,50mm tris,300mm nacl,20/50mm imidazole,ph8.0)洗柱子，并收集流出；用elution buffer(8m urea,50mm tris,300mm nacl,500mm imidazole,ph8.0)洗脱，收集流出；对粗蛋白、洗杂流出、洗脱流出分别处理，制样，准备sds-page检测；将纯度较好的组分透析到500mm l-arginine,2mm dtt,0.1％skl,ph 8.0缓冲液中。透析结束后接着透析至10mm tris-hcl,2mm dtt,0.1％skl,1mm edta,10％glycerol,ph 8.0。透析结束后蛋白用peg20000浓缩，0.45μm滤膜过滤后分装1ml/tube，-80℃保存，得到草鱼sfasl重组蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示，含有183个氨基酸。
60.草鱼sfasl重组蛋白的检测：
61.sds-page检测：将纯化后的蛋白质与2
×
上样缓冲液1︰1混匀，100℃水浴10min后取出待用；用蛋白胶试剂盒(bio-rad)制作sds-page蛋白胶；将样品和蛋白质分子marker分别以10μl上样，电泳开始时恒压80v，样品进入分离胶后恒压120v，直至溴酚蓝走至前沿为止。电泳结束后，考马斯亮蓝染色和脱色液脱色，观察实验结果如图2a所示。
62.western-blot验证：蛋白质样品经sds-page电泳后，将其置于半干电转仪(bio-rad)中250ma转膜90min；5％脱脂奶粉封闭摇床2h；加入一抗(兔抗gst标签，稀释比例1：500，上海生工生物)后置于摇床上室温孵育60min，用pbs洗膜3次，每次10min，随后用二抗(羊抗兔，稀释比例1：8000，上海生工生物)室温孵育60min，再经pbs洗膜3次，最后用tmb显色试剂盒(上海生工生物工程有限公司)显色5min，并用化学发光成像系统(bio-rad)成像观察，观察实验结果如图2b所示。图2中，a为sds-page分析图，b为western blot分析图。由图2可知，在理论分子量
±
5kda相应位置出现明显条带，可初步确定草鱼sfasl重组蛋白成功得到了纯化，通过western blot检测进一步验证了我们获得的纯化蛋白为目的蛋白。
63.草鱼sfasl重组蛋白的生物学活性检测：
64.①
样品收集：
65.取健康的鲜活草鱼(平均体重30g左右)，平均分为2组。实验组草鱼采用腹腔注射100μl sfasl蛋白溶液(300μg/ml)，对照组每条鱼注射等体积的gst标签蛋白(300μg/ml)。注射后的草鱼立即放回养殖桶，同时每组随机取样3条作为0h的样品。在注射后3、6、12、24、48和72小时随机取每组的3条草鱼，用消毒的镊子和剪刀解剖鱼体并取出肠道组织，样品置于液氮中保存用于总rna的提取。
66.取健康的鲜活草鱼(平均体重30g左右)，采用组织块法分离培养草鱼肠道原代细胞(该草鱼肠道原代细胞的培养方法参照本研究团队前期提出的专利申请202110018244.2，具体为实施例1中涉及的实验方法)。利用不同浓度草鱼sfasl重组蛋白(0ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml和10μg/ml)处理草鱼肠道原代细胞(该草鱼肠道原代细胞的处理方法，参照本研究团队前期提出的专利申请202110018244.2，具体为实施例2中涉及的实验方法)。在处理24小时后收集草鱼肠道细胞，样品置于液氮中保存用于总rna的提取。
67.②
总rna提取：提取方法同实施例1的步骤(1)。
68.③
cdna文库构建：
69.草鱼肠道cdna文库构建使用primescript
tm rt reagent kit with gdnaeraser(takara)，具体步骤如下：
①
去除基因组dna反应：在microtube管中配制反应液，包括2.0μl 5
×
gdna eraser buffer，1.0μl gdna eraser，1μg草鱼肠道总rna，加rnase free h2o将总体积补至10μl；42℃，2min，4℃结束。
②
反转录反应：在上述microtube管中配制反转录反应液，包括步骤1中10μl反应液，4μl 5
×
primescript buffer 2(for real time)，1.0μl primescript rt enzyme mix 1，4.0μl rnase free h2o和1μl rt primer mix；反应体系轻弹混匀，稍离心；37℃，15min；85℃，5s使反转录酶失活；冰上冷却，-20℃保存。
70.④
基因表达水平的检测：
71.以步骤
③
中构建的cdna为模板进行荧光定量pcr反应，并以草鱼看家基因β-actin的转录水平作为内参对照。
72.基因定量引物序列如下：
73.cifasl-f3：5'-ctccaggtcaatgaaagcggtt-3'(seq id no.7)；
74.cifasl-r3：5'-ttgtgagcgtgatagtctgcgg-3'(seq id no.8)；
75.ciβ-actin-f：5'-cttgacttcgagcaggag-3'(seq id no.9)；
76.ciβ-actin-r：5'-ggcatacaggtctttacgg-3'(seq id no.10)；
77.cifadd-f：5'-ttggacttcaagacactcagc-3'(seq id no.11)；
78.cifadd-r：5'-cctccactctggcgtttactt-3'(seq id no.12)；
79.cicaspase-8-f：5'-gttgaggtgctggatgat-3'(seq id no.13)；
80.cicaspase-8-r：5'-gcgtaatagcgtgagaca-3'(seq id no.14)；
81.cicaspase-3-f：5'-gctgtgcttcatttgtttg-3'(seq id no.15)；
82.cicaspase-3-r：5'-tctgagatgttatggctgtc-3'(seq id no.16)；
83.citnfα-f：5'-cgctgctgtctgcttcac-3'(seq id no.17)；
84.citnfα-r：5'-cctggtcctggttcactc-3'(seq id no.18)；
85.ciil-1β-f：5'-agagtttggtgaagaagagg-3'(seq id no.19)；
86.ciil-1β-r：5'-ttattgtggttacgctgga-3'(seq id no.20)；
87.ciil-8-f：5'-atgagtcttagaggtctgggt-3'(seq id no.21)；
88.ciil-8-r：5'-acagtgagggctaggaggg-3'(seq id no.22)；
89.ciil-6-f：5'-cagcagaatgggggagttatc-3'(seq id no.23)；
90.ciil-6-r：5'-ctcgcagagtcttgacatcctt-3'(seq id no.24)；
91.pcr反应体系为：5.68μl ddh2o,8.0μl tb green premix ex taq(tli rnaseh plus)(2
×
,takara),0.32μl rox reference dye ii(50
×
),4μl dntp mixture(2.5mm each),0.5μl正反引物(10μm),和1μl cdna模板。
92.荧光定量pcr反应结束后，根据收集到的目的基因与内参基因的ct值，运用2-δδct
方法计算相对表达量，结果如图3和图4所示。
93.由图3可知，本发明利用实时荧光定量pcr技术检测发现，草鱼肠道细胞凋亡通路关键基因fasl、fadd、caspase-8和caspase-3基因在注射草鱼sfasl重组蛋白后表达水平显著上调(p《0.05)，揭示了本发明研制的草鱼sfasl重组蛋白具有较好的生物学活性。
94.由图4可知，本发明利用实时荧光定量pcr技术检测发现，草鱼sfasl重组蛋白能够
显著降低草鱼肠道炎症因子il-1β、il-6、il-8和tnfα表达水平(p《0.05)，表明本发明研制的草鱼sfasl重组蛋白具有缓解肠道炎症反应的功效，可开发作为鱼类肠炎防治的绿色产品，例如，可作为鱼类饲料添加剂以及肠炎病害防治药物。
95.由此可见，本发明中，利用分子克隆技术得到草鱼肿瘤坏死因子家族成员fasl基因的orf序列，通过载体构建方法成功获得了同时兼具gst和6
×
his组氨酸标签蛋白的原核表达载体pgex-4t-1-fasl，利用合适的温度和iptg浓度筛选得到高效表达草鱼sfasl的原核表达体系，利用亲和层析对表达产物进行多级纯化，获得高纯度体外表达重组草鱼肿瘤坏死因子sfasl蛋白，通过草鱼活体腹腔注射和肠道细胞培养实验发现，草鱼sfasl重组蛋白具有很好的生物学活性，能够显著调节肠道的凋亡和炎症水平，有效改善鱼类肠道健康，通过本发明的技术方案可以工业化生产草鱼sfasl重组蛋白，不仅可用于制备相应鱼类抗体和其它鱼类免疫机制的理论研究，同时可显著缓解鱼类肠道炎症反应，用于制作饲料添加剂、病害防治药物以及其它医药产品等应用研究。因此，本发明制备的草鱼sfasl重组蛋白，可用于制备相应鱼类肿瘤坏死因子抗体，也可用于制作饲料添加剂以及病害防治药物等，具备应用范围广、效益大的特点；同时，相比以往的fasl重组产物，本发明中草鱼sfasl重组蛋白具有很好的生物学活性和广泛的生物学功能，能够在短时间内显著改善肠道凋亡水平，降低肠道炎症因子的表达，显著缓解肠道炎症反应，有利于提高鱼类的抗病能力，容易推广应用。
96.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。