分泌抗人CysC单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用的制作方法

分泌抗人cys c单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用
技术领域
1.本发明属于免疫学和体外诊断分支技术领域，具体涉及分泌抗人cys c单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用。


背景技术：

2.人cys c是胱抑素c的简称。胱抑素c是一种由122个氨基酸组成，分子量为13.3kda的低分子量、碱性非糖化蛋白质。人体几乎所有的细胞都可以产生胱抑素c，正常情况下，在人血清中的人cys c浓度(≤1.03mg/l)是恒定的，与性别、体重、年龄等差异无关。
3.胱抑素c在临床检测上有重要意义。胱抑素c仅经过肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，能高效准确的评估肾脏功能。当肾脏功能受损时，胱抑素c浓度会升高。有研究者认为，胱抑素c还可快速反映肾功能的恢复情况，尤其是在肾移植术临床应用中出现的急性排斥反应或药物治疗对肾脏造成的可能损害，给出快速的诊断。
4.虽然本领域虽然有一些检测检测胱抑素c的方法，其灵敏度和准确度还难以令人满意。因此本领域急需开发准确、特异性强、快速、灵敏地检测胱抑素c的抗体(尤其是可成对使用的单克隆抗体)和方法。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供两株分泌抗人cys c单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并用体内腹水法分别培养这两株杂交瘤细胞，制备两种抗人cys c单克隆抗体。通过这种方法获得的两种抗人cys c单克隆抗体分别作为标记抗体和包被抗体，用于制备检测人血清中人cys c含量的试剂盒。
6.本发明的第一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供两株分泌抗人cys c单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：选用原核表达的人cys c抗原对小鼠进行免疫，取免疫小鼠的脾脏淋巴细胞，和小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过阳性筛选与亚克隆得到该细胞株，命名为杂交瘤细胞株1h9和杂交瘤细胞株5f1，该细胞株能够稳定分泌抗人cys c单克隆抗体，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号依次为cctcc no.c2021188和cctcc no.c2021189。
8.本发明的第二个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供两种抗人cys c单克隆抗体。
9.为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：选取balb/c雌鼠，向小鼠腹腔注射液体石蜡，两周后腹腔注射由前面所述的保藏编号为cctcc no.c2021188的杂交瘤细胞，待其腹部膨胀明显后，收集腹水，离心，收集上清液，纯化，得到一种cysc-1h9单抗；同样的方法，向另外的balb/c雌鼠腹腔注射保藏编号为cctcc no.c2021189的杂交瘤细胞，得
到另一种cysc-5f1单抗。
10.本发明提供的两种抗人cys c单克隆抗体，亚型为igg1，对人cys c有特异性。
11.本发明提供的两种抗人cys c单克隆抗体，具有效价高、亲和力强、特异性好的特点。
12.本发明的第三个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供两种抗人cys c单克隆抗体在制备体外诊断试剂盒中的应用。
13.所述应用是基于双抗体夹心法。
14.在试剂盒中，cysc-1h9单抗作为标记抗体，cysc-5f1单抗作为包被抗体。
15.所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒、化学发光免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒及胶体金免疫检测试剂盒。
16.本发明的有益效果：
17.本发明提供的两株分泌抗人cys c单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其传代细胞株能够高效、稳定分泌两种抗人cys c单克隆抗体；抗人cys c单克隆抗体的特异性强。将两个抗体配对，在检测人cys c时，具有特异性好，灵敏度高的特点。广泛适用于人cysc的应用检测领域。
18.生物保藏说明1：
19.培养物名称：杂交瘤细胞株1h9，已于2021年8月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no.c2021188。
20.生物保藏说明2：
21.培养物名称：杂交瘤细胞株5f1，已于2021年8月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为cctcc no.c2021189。
附图说明
22.图1是实施例1杂交瘤细胞分泌抗体稳定性的检测结果；
23.图2是实施例3抗体效价、亲和力的检测结果；
24.图3是实施例3抗体亚型的检测结果；
25.图4是实施例3抗体性能检测结果。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
27.实施例1分泌抗人cys c单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
28.1、动物免疫
29.选用人cys c原核表达抗原免疫6周龄的雌性balb/c小鼠。初次免疫，抗原与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，经背部皮下多点免疫小鼠，免疫剂量为100μg/只。三周后，每隔15天进行一次加强免疫，抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合乳化，经背部皮下多点免疫小鼠，免疫剂量为50μg/只。每次加强免疫的第7天，对小鼠进行断尾采血测血清效价，血清效价达到5万以上方可进行融合，检测结果如表1所示。融合前3天，对小鼠进行腹腔注射免疫，不加佐剂，免疫剂量为100μg/只。
30.表1免疫小鼠血清效价检测结果
[0031][0032]
2、细胞融合
[0033]
在无菌条件下，取免疫小鼠的脾脏，充分研磨分散，选择200目筛网将研磨液过滤，去除未分散的组织块，1000rpm/min离心10min，收集小鼠淋巴细胞，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0按照10:1的比例混合，离心洗涤细胞，确保混合细胞中无胎牛血清；在37℃水浴中，1min内由慢到快的滴加1ml peg(分子量1450)进行细胞融合，轻柔混合，静置1min。用25ml无血清dmem终止融合，加入速度由慢到快，按照每分钟1ml、1ml、2ml、4ml、6ml、12ml的体积，在6min内终止反应。融合细胞放入37℃，含5％二氧化碳培养箱中孵育15min，800rpm/min离心10min，用hat培养基重悬，分装到96孔细胞培养板中，放入37℃，含5％二氧化碳培养箱中进行培养。
[0034]
3、杂交瘤细胞筛选和亚克隆
[0035]
融合细胞第七天时，用hat培养基全部换液，第九天通过经研究测试的间接elisa的方法检测培养上清。
[0036]
具体检测方法如下：
[0037]
用包被液将人cys c真核表达抗原稀释成0.5μg/ml，100μl/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。洗板3次。酶标板各孔加入150μl封闭液，37℃孵育2h。洗板3次。将待检测的细胞上清加入到酶标板中，100μl/孔，同时用小鼠免疫血清做阳性对照，37℃孵育1h。洗板3次。hrp标记的羊抗鼠抗体4万倍稀释，加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板5次。酶标板各孔加入100μl tmb显色液，37℃孵育10min；2m硫酸终止，50μl/孔，于450nm波长下读取数据。
[0038]
选择呈强阳性反应的细胞孔进行亚克隆，严格要求进行3次，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株。
[0039]
4、杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测
[0040]
将杂交瘤细胞进行传代培养，共培养30代，分别在1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30代时收集培养上清，用elisa的方法检测质控品，分析细胞分泌抗体的稳定性。这两株(1h9和5f1)分泌抗人cys c单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其传代细胞株能够高效、稳定分泌抗人cys c单克隆抗体。
[0041]
检测结果图1所示。
[0042]
5、杂交瘤细胞株保存
[0043]
选取生长稳定的杂交瘤细胞株，进行扩大培养。细胞密度达到指定的80％时，收集细胞，用细胞冻存液冻存细胞。
[0044]
经过细胞融合获得2株能稳定分泌抗人cys c单克隆抗体的杂交瘤细胞，且分别分泌的抗体以双抗体夹心法检测cysc抗原可配对，并于2021年8月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，杂交瘤细胞株1h9保藏编号为cctcc no.c2021188，杂交瘤细胞株5f1保藏编号为cctcc no.c2021189。
[0045]
实施例2抗人cys c单克隆抗体的制备
[0046]
1、腹水制备
[0047]
选取指定12周龄左右的balb/c小鼠，腹腔注射500μl的液体石蜡，2周后腹腔注射106个杂交瘤细胞/只，注射体积为100μl/只。5～7天后，持续观察小鼠，待其腹部膨胀明显后，收集腹水，12000rpm/min离心15min，去除杂质，置于-20℃冰箱保存。
[0048]
2、腹水纯化
[0049]
将腹水12000rpm/min离心10min，用粗滤纸进行过滤后再进行50％硫酸铵沉淀。之后参照博格隆protein-a柱说明书进行纯化。收集纯化的抗体，用10mm pbs进行透析，收集抗体，0.22μm滤膜过滤后，分装，置于-80℃冰箱中保存，用于后续检测和验证。
[0050]
实施例3单克隆抗体鉴定
[0051]
1、抗体效价和亲和力测定
[0052]
采用间接elisa的方法，对抗体的效价和亲和力进行检测。具体检测方法如下：
[0053]
用包被液将人cys c真核表达抗原稀释成2μg/ml,100μl/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。洗板3次。酶标板各孔加入150μl封闭液，37℃孵育2h。洗板3次。将待检测的抗体以1mg/ml的初始浓度，按照一定的比例进行稀释，加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板3次。hrp标记的羊抗鼠抗体4万倍稀释，加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。洗板5次。酶标板各孔加入100μl tmb显色液，37℃孵育10min；2m硫酸终止，50μl/孔，于450nm波长下读取数据。
[0054]
检测结果如图2所示，1h9的效价为10万，5f1的效价在100万以上。
[0055]
2、抗体亚型检测
[0056]
使用southern biotech公司的sba亚型检测试剂盒，按照说明书进行检测，两种抗人cys c单克隆抗体的亚型均为igg1。
[0057]
检测结果如图3所示。
[0058]
3、抗体配对筛选
[0059]
以单克隆抗体5f1作为包被抗体，单克隆抗体1h9作为标记抗体，通过双抗体夹心elisa方法，检测20份阳性血清和40份阴性血清，以p/n》2为阳性。检测结果如表2所示。
[0060]
表2抗体配对筛选结果
[0061][0062][0063]
5、抗体性能检测
[0064]
在荧光免疫平台上，与外购对照抗体比较，cys c-1h9单抗和cys c-5f1单抗配对测试，在信号值和线性等各方面，均优于外购对照抗体。
[0065]
检测结果如图4所示。
[0066]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。