一种高荧光强度纳米聚合物微球的制备方法

1.本发明涉及一种高荧光强度纳米聚合物微球的制备方法。


背景技术：

2.免疫层析技术具有简单快速、成本低廉、无需复杂设备、结果可视等优势，在食品安全、水质监测、医疗诊断等领域被广泛应用。但相对于其他检测技术，如电化学传感器、酶联免疫等，传统的免疫层析方法灵敏度低，已不能满足各领域日益增长的检测要求。免疫层析技术灵敏度的进一步提升成为急需解决的瓶颈问题。提高免疫层析技术灵敏度的策略主要有以下四种：选用高特异性抗体，提高偶联效率；改进试纸条材料、加样方式及层析条件，提高标记物与检测区结合效率；开发新型纳米标记物及转换信号读取方式。四种策略中，制备信号更强的纳米标记物成为众多研究者关注的重点。
3.在免疫层析技术中所用到的标记材料需要满足两个要求：能够进行抗体标记及信号可读。传统的代表性颜色型标记物胶体金，其表面含大量负电荷，可通过静电吸附进行相对温和的偶联，较大程度上保留了生物分子活性，被广泛应用于免疫层析技术中。但其检测信号具有一定的局限性，灵敏度不高。相比之下，荧光型标记物如聚合物荧光微球，其信号强度更高，更符合各领域内精确定量的检测要求。聚合物荧光微球的制备方法有很多种，其中，通过吸附、键合等一些表面修饰方法制得的微球，由于荧光分子暴露在微球外侧，稳定性较差，容易受外界条件影响，出现脱落、泄露的问题；采用包埋、共聚等方法制备微球时，由于荧光分子在聚合过程中加入，可能会干扰聚合反应，导致聚合物微球粒径分布变宽。相比之下，溶胀法操作简单，获得的微球荧光性能稳定，溶胀前后微球的形态和粒径基本不变，单分散性较好。但聚合物微球高分子链紧密缠绕，染料分子难以渗透到微球内部，影响溶胀效率。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明的目的是提供一种高荧光强度纳米聚合物微球的制备方法，该制备方法通过改善聚合物微球高分子链结构，从而有效提高溶胀时荧光分子在聚合物微球中的渗入量，进而提高溶胀效率，增加荧光强度。
5.技术方案：本发明所述的高荧光强度纳米聚合物微球的制备方法，在制备纳米聚合物微球时加入增塑剂和羧基功能单体进行共聚，得到聚合物微球，再通过溶胀法将荧光染料掺入聚合物微球中得到纳米聚合物荧光微球。
6.其中，上述制备方法具体包括如下步骤：
7.(1)采用无皂乳液聚合法，在惰性气体保护下，将苯乙烯、增塑剂和羧基功能单体进行共聚，得到纳米聚合物微球；
8.(2)采用溶胀法将荧光染料掺入步骤(1)的纳米聚合物微球中，得到纳米聚合物荧光微球。
9.其中，步骤(1)中，无皂乳液聚合法具体过程为：先将苯乙烯分散在水中，用惰性气
体置换反应装置内空气，加热搅拌，升至反应温度后加入引发剂，反应后再加入增塑剂和羧基功能单体进行共聚，反应结束后，冷却至室温，得到纳米聚合物微球。分步聚合，反应一段时间后再添加其它共聚单体，避开成核期，有效防止粒径分布变宽，得到分散性良好的聚合物微球。
10.其中，聚合温度为75～76℃，聚合时间为18～24h。
11.其中，引发剂为过硫酸钾或过硫酸铵，引发剂加入量为苯乙烯单体用量的1.5～2wt％。
12.其中，增塑剂为顺丁烯二酸二辛酯、甲基丙烯酸十二酯或甲基丙烯酸十四酯。增塑剂在与苯乙烯进行共聚时，能够使得到的聚合物高分子链具有良好的柔韧性，易于运动打开。
13.其中，羧基功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、琥珀酸单[2-[(2-甲基-丙烯酰基)氧]乙基]酯或马来酸单-2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯。羧基功能单体使得到的纳米聚合物微球表面带有羧基基团，便于和抗体或抗原偶联应用于生物医学检测。
[0014]
其中，苯乙烯、增塑剂和羧基功能单体所用体积比为10：1.5～2：1。
[0015]
其中，步骤(2)中，溶胀法中，溶胀剂为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮或甲苯；溶胀介质为十二烷基磺酸钠。溶胀剂与聚合物溶解度比较接近，能够使缠绕成球的聚合物高分子链在其中发生运动松散打开。
[0016]
其中，步骤(2)中，荧光染料为尼罗红、罗丹明类衍生物、稀土铕配合物或稀土铽配合物。
[0017]
其中，荧光染料和聚合物微球的质量比为0.5～1.0:10；溶胀时间为7～8h。
[0018]
有益效果：相比于现有技术，本发明具有的显著优点为：(1)本发明方法不仅可得到单分散性好、表面洁净的纳米聚合物微球，还能够避免稳定剂、表面活性剂等添加剂对微球性能(稳定剂或表面活性剂较多时会包覆微球，从而影响后期与抗体的偶联)的影响；(2)本发明方法制得的聚合物微球具有良好的柔韧性，能够在溶胀时快速松散打开，从而利于染料分子快速渗透到微球内部，提高溶胀效率；(3)本发明方法制得的荧光微球具有高的荧光分子掺入量，从而大大提高了聚合物微球的荧光强度，有效提高检测灵敏度；且还具有良好的抗光漂白性；(4)本发明方法制得的荧光微球表面带有羧基基团，便于和抗体或抗原偶联应用于生物医学检测。
附图说明
[0019]
图1为本发明实施例1纳米聚合物微球的扫描电镜图；
[0020]
图2为本发明实施例2纳米聚合物微球的扫描电镜图；
[0021]
图3为本发明实施例1纳米聚合物荧光微球的扫描电镜图；
[0022]
图4为本发明实施例2纳米聚合物荧光微球的扫描电镜图；
[0023]
图5为本发明实施例2纳米聚合物微球的红外光谱图；
[0024]
图6为本发明实施例2中纳米聚合物微球和纳米聚合物荧光微球的激光粒度分析仪测试结果图；
[0025]
图7为本发明实施例1和实施例2纳米聚合物荧光微球的荧光光谱图；
[0026]
图8为本发明实施例1和实施例2纳米聚合物荧光微球的光漂白曲线；
[0027]
图9为实施例1和实施例2纳米聚合物荧光微球应用于免疫层析试纸条的测试结果图。
具体实施方式
[0028]
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
[0029]
实施例1
[0030]
本发明纳米聚合物荧光微球的制备方法，包括如下步骤：
[0031]
(1)采用无皂乳液聚合法制备纳米聚合物微球：将1ml苯乙烯加入29ml去离子水中，用高纯氮气驱赶反应装置中的空气，磁力搅拌0.5h后升温至75℃，加入1ml过硫酸钾水溶液(18mg/ml)，反应5h后加入0.1ml琥珀酸单[2-[(2-甲基-丙烯酰基)氧]乙基]酯进行共聚反应，反应18h后冷却至室温，取出微球乳液，用无水乙醇和去离子水离心洗涤5次，得到球形良好、粒径均一的纳米聚合物微球；
[0032]
(2)采用溶胀法将染料分子掺入纳米聚合物微球中：取0.1g聚合物微球分散在10ml 0.25wt％十二烷基磺酸钠水溶液中，加入1ml溶有0.01g稀土铕配合物的二氯甲烷溶液，超声10min混合均匀，室温磁力搅拌8h，反应结束后旋蒸除去二氯甲烷，离心弃去上清液，加水重悬，反复洗涤5次，得到纳米聚合物荧光微球。
[0033]
实施例2
[0034]
本发明纳米聚合物荧光微球的制备方法，包括如下步骤：
[0035]
(1)采用无皂乳液聚合法制备纳米聚合物微球：采用无皂乳液聚合法制备纳米聚合物微球：将1ml苯乙烯加入29ml去离子水中，用高纯氮气驱赶反应装置中的空气，磁力搅拌0.5h后升温至75℃，加入1ml过硫酸钾水溶液(18mg/ml)，反应2h后加入0.2ml甲基丙烯酸十二酯(具有多个双键的不饱和烯烃，能够在聚合时双键打开，从而改善分子链结构，提高分子的柔韧性)，再反应3h后加入0.1ml琥珀酸单[2-[(2-甲基-丙烯酰基)氧]乙基]酯，反应18h后冷却至室温，取出微球乳液，用无水乙醇和去离子水离心洗涤5次，得到球形良好、粒径均一的纳米聚合物微球；
[0036]
(2)采用溶胀法将染料分子掺入纳米聚合物微球中：取0.1g聚合物微球分散在10ml 0.25wt％十二烷基磺酸钠水溶液中，加入1ml溶有0.01g稀土铕配合物的二氯甲烷溶液，超声10min混合均匀，室温磁力搅拌8h，反应结束后旋蒸除去二氯甲烷，离心弃去上清液，加水重悬，反复洗涤5次，得到纳米聚合物荧光微球。
[0037]
通过图4可知，本发明方法得到的聚合物荧光微球单分散性好，无团聚，从而能够在后续免疫层析应用时进行毛细管作用。放大电镜图pdi值为＜0.05。
[0038]
通过图5可知，实施例2制得的聚合物微球出现了酯羰基的吸收峰，表明甲基丙烯酸十二酯成功聚合到了聚苯乙烯高分子链上。通过图6可知，本发明方法得到的聚合物微球在溶胀前后微球粒径及分散性未发生明显变化。通过图7可知，实施例2荧光微球的荧光强度远高于实施例1，说明在聚合过程中添加增塑剂有利于后期溶胀，从而可制备出高荧光强度的聚合物荧光微球。通过图8可知，在365nm激发波长下持续照射30min，实施例2制得的聚合物荧光微球荧光强度几乎没有变化，仍具有优异的抗光漂白性能，说明实施例2制得的聚合物荧光微球在长时间光照下，荧光分子不脱落，荧光强度稳定，几乎无变化，通过与实施例1的荧光微球对比，说明增加添加剂实施例2的荧光微球性能没有受到影响。
[0039]
实施例1和实施例2的纳米聚合物荧光微球应用于免疫层析测试：用缓冲溶液稀释待检物，从左至右待检物的浓度分别为0、1、2、4、8、16μg/ml，以能观察到阳性结果即t线有荧光为判定标准，采用实施例2制得的荧光微球检测灵敏度可达到1μg/ml，高于实施例1，说明实施例2的荧光微球具有高的荧光强度，从而具有高的检测灵敏度。