一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，更具体的说涉及一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法。


背景技术：

2.西格列汀(sitagliptin,sgt)是一种二肽基肽酶4(dpp-4)抑制剂，在2型糖尿病患者中可通过增加活性肠促胰岛激素的水平而改善血糖控制。肠促胰岛激素包括胰高糖素样多肽-1(glp-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(gip)，由肠道全天释放，并且在进餐后水平升高。西格列汀能够防止dpp-4水解肠促胰岛激素，从而增加活性形式的glp-1和gip的血浆浓度。通过增加活性肠促胰岛激素水平，西格列汀能够以葡萄糖依赖的方式增加胰岛素释放并降低胰高糖素水平。对于存在高血糖症的2型糖尿病患者，胰岛素和胰高糖素水平发生的上述变化可降低糖化血红蛋白a1c(hba1c)并降低空腹血糖和餐血糖水平。
3.目前现有技术检测人血浆中的西格列汀的分析方法参差不齐，多采用非同位素内标，无法保证待测物与内标洗脱方式的一致性。为满足临床生物样品分析的需求，需开发更简单、可靠、省时的人血浆中西格列汀浓度测定的方法，本专利建立了检测血浆西格列汀浓度的高效液相质谱法，专属性高、操作简单、成本低廉，特别适合大批量样品的自动化检测工作。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法，以西格列汀-d4为内标，加入沉淀剂进行蛋白沉淀，取上清液加稀释剂，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测，检测速度快，精度高，灵敏度好。
5.本发明技术方案一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.(1)血浆样品预处理：
7.以k2edta为抗凝剂，以西格列汀-d4为内标；在96孔板的孔中加入50μl样品，加入50μl浓度为100.000ng/ml的内标西格列汀-d4工作溶液，混匀后每一个样品孔中加入300μl甲醇，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液100μl至另一96孔收集板中，加入300μl 50％甲醇，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，获得测试样品；
8.(2)试样测定：
9.取1μl测试样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的西格列汀和内标西格列汀-d4的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的西格列汀浓度；
10.液相色谱条件为：
11.色谱柱：welch ultimate xb-c
18
，柱规格为2.1
×
100mm，5μm；色谱柱温：40℃；流动相a：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相b：甲醇；强洗液：水/甲醇/甲酸的体积百分比为20/80/0.1；柱塞清洗液：水/甲醇体积百分比为90/10；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，
流速为0.5ml/min，进样量为1μl，分析时间4min；西格列汀和西格列汀-d4预期保留时间约在1.55min；
12.质谱条件为：
13.离子源为电喷雾离子源，离子传输管温度为325℃，蒸汽温度为350℃，驻留时间为200ms。西格列汀和西格列汀-d4的碰撞电压分别为18v、19v，正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测。
14.优选地，梯度洗脱程序为：
[0015][0016]
优选地，步骤(2)中，采用内标法，以西格列汀和内标西格列汀-d4的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的西格列汀的浓度。
[0017]
优选地，标准曲线方程的建立包括以下步骤：
[0018]
取190μl空白血浆置于聚丙烯管中，以工作液的形式分别添加10μl浓度分别为40.00、80.000、200.000、1000.000、4000.000、8000.000、16000.000、20000.000ng/ml的西格列汀工作溶液，混匀后分别取50μl标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8、零浓度样本加入50μl的100.000ng/ml的内标西格列汀-d4溶液，向双空白样本中加入50μl的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后每一个样品孔中加入300μl甲醇，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液100μl至另一96孔收集板中，加入300μl 50％甲醇，封板，混匀10min；样品在4℃，2623g离心10min，得标准样品，待进样；
[0019]
分别取1μl标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的西格列汀和内标西格列汀-d4的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于回算所述血浆样品中的西格列汀的浓度。
[0020]
优选地：质量控制的建立包括以下步骤：
[0021]
配制西格列汀浓度为40.000、120.000、1200.000、6000.000、15000.000μg/ml的质控样品工作液。取380μl空白血浆置于聚丙烯管中，分别添加质控工作液20μl混匀后分别取质控样品50μl加入50μl的100.000ng/ml的内标西格列汀-d4溶液，混匀后每一个样品孔中加入300μl甲醇，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液100μl至另一96孔收集板中，加入300μl 50％甲醇，封板，混匀10min；样品在4℃，2623g离心10min，获得质控标准样品；
[0022]
分别取1μl标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测质控样品中的西格列汀和内标西格列汀-d4的色谱峰，并根据标准曲线回算出质控样品测定浓度。
[0023]
本发明技术方案的一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法的有益效果是：
[0024]
1、使用同位素内标，保证待测物与内标洗脱的一致性；
[0025]
2、预处理方法较简便，适用于高通量测定；
[0026]
3、专属性强：在本实验所用的色谱条件下，西格列汀保留时间为1.55min左右，内标西格列汀-d4保留时间在1.55min左右。西格列汀和内标西格列汀-d4的峰形良好，无杂峰明显干扰测定，基线平稳；
[0027]
4、本发明方法快速、准确、特异性强为西格列汀的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围为2.000～1000.000ng/ml。
附图说明
[0028]
图1为人血浆中西格列汀的lc-ms/ms检测方法中西格列汀的产物离子扫描质谱图；
[0029]
图2为人血浆中西格列汀的lc-ms/ms检测方法中西格列汀-d4的产物离子扫描质谱图；
[0030]
图3为人空白血浆的lc-ms/ms图；
[0031]
图4为人空白血浆加入西格列汀和西格列汀-d4的lc-ms/ms图；
[0032]
图5为lc-ms/ms法测得的西格列汀在人血浆中的标准曲线图。
具体实施方式
[0033]
为便于本领域技术人员理解本发明技术方案，现结合说明书附图对本发明技术方案做进一步的说明。
[0034]
一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法，也称lc-ms/ms法，以西格列汀-d4为内标，加入沉淀剂进行蛋白沉淀，取上清液加稀释剂，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测。具体包括以下步骤：
[0035]
(1)血浆样品预处理：
[0036]
以k2edta为抗凝剂，以西格列汀-d4为内标；在96孔板的孔中加入50μl样品，加入50μl浓度为100.000ng/ml的内标西格列汀-d4工作溶液，混匀后每一个样品孔中加入300μl甲醇，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液100μl至另一96孔收集板中，加入300μl 50％甲醇(含0.5％甲酸)，封板，混匀；样品在4℃，2623g离心10min，获得测试样品，待进样。
[0037]
(2)试样测定：
[0038]
取1μl测试样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的西格列汀和内标西格列汀-d4的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中的西格列汀浓度。
[0039]
液相色谱条件为：
[0040]
色谱柱：welch ultimate xb-c
18
，柱规格为2.1
×
100mm，5μm；色谱柱温：40℃；流动相a：水/甲酸的体积百分比为100/0.1；流动相b：甲醇；强洗液：水/甲醇/甲酸的体积百分比为20/80/0.1；柱塞清洗液：水/甲醇体积百分比为90/10；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.5ml/min，进样量为1μl，分析时间4min；西格列汀和西格列汀-d4预期保留时间约在1.55min。
[0041]
质谱条件为：
[0042]
离子源为电喷雾离子源，离子传输管温度为325℃，蒸汽温度为350℃，驻留时间为200ms。西格列汀和西格列汀-d4的碰撞电压分别为18v、19v，正离子方式检测；扫描方式为
多重反应监测。用于定量分析的离子反应分别为：西格列汀：m/z 408.1
→
235.1和西格列汀-d4：m/z 412.2
→
239.1。
[0043]
上述梯度洗脱的程序为：
[0044][0045]
上述步骤(2)中，采用内标法，以西格列汀和内标西格列汀-d4的峰面积比值带入标准曲线方程计算所述血浆样品中的西格列汀的浓度。
[0046]
本技术方案中，标准曲线方程的建立包括以下步骤：
[0047]
取190μl空白血浆置于聚丙烯管中，以工作液的形式分别添加10μl浓度分别为40.00、80.000、200.000、1000.000、4000.000、8000.000、16000.000、20000.000ng/ml的西格列汀工作溶液，混匀后分别取50μl标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8、零浓度样本加入50μl的100.000ng/ml的内标西格列汀-d4溶液，向双空白样本中加入50μl的体积分数为50％的甲醇水溶液，混匀后每一个样品孔中加入300μl甲醇，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液100μl至另一96孔收集板中，加入300μl 50％甲醇(含0.5％甲酸)，封板，混匀10min；样品在4℃，2623g离心10min，得标准样品，待进样。
[0048]
分别取1μl标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测样品中的西格列汀和内标西格列汀-d4的色谱峰，并据此得到标准曲线，以用于回算所述血浆样品中的西格列汀的浓度。
[0049]
本技术方案中：质量控制的建立包括以下步骤：
[0050]
配制西格列汀浓度为40.000、120.000、1200.000、6000.000、15000.000μg/ml的质控样品工作液。取380μl空白血浆置于聚丙烯管中，分别添加质控工作液20μl混匀后分别取质控样品50μl加入50μl的100.000ng/ml的内标西格列汀-d4溶液，混匀后每一个样品孔中加入300μl甲醇，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min；取离心后上清液100μl至另一96孔收集板中，加入300μl 50％甲醇(含0.5％甲酸)，封板，混匀10min；样品在4℃，2623g离心10min，获得质控标准样品，待进样。
[0051]
分别取1μl标准样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，检测质控样品中的西格列汀和内标西格列汀-d4的色谱峰，并根据标准曲线回算出质控样品测定浓度。
[0052]
为进一步对本技术方案的一种液质联用测定血浆中西格列汀浓度的方法的理解，下面公开一组具体的实验过程。
[0053]
一、实验材料与分析设备
[0054]
西格列汀钙(分析物)：europeanpharmacopoeia或相同、更高等级的标准品。西格
[0055]
列汀-d4钠盐(内标)：tlc pharmaceutical standards ltd或相同、更高等级的标准品。使用试剂见下表1，使用分析设备见下表2。
[0056]
表2试剂明细
[0057][0058]
表2使用设备明细
[0059][0060]
液质条件：
[0061]
1、液相色谱条件
[0062]
色谱柱：welch ultimate xb-c
18
，柱规格为2.1
×
100mm，5μm。
[0063]
色谱柱温：40℃。
[0064]
流动相a：水/甲酸的体积百分比为100/0.1。流动相b：甲醇。
[0065]
强洗液：水/甲醇/甲酸的体积百分比为20/80/0.1。
[0066]
柱塞清洗液：水/甲醇体积百分比为90/10。自动进样器温度为4℃。
[0067]
梯度洗脱，流速为0.5ml/min，进样量为1μl，分析时间4min。
[0068]
西格列汀和西格列汀-d4预期保留时间约在1.55min。
[0069]
具体的梯度洗脱程序见表3；
[0070]
表3梯度洗脱程序
[0071][0072]
2、质谱条件：
[0073]
离子源为电喷雾离子源，离子传输管温度为325℃，蒸汽温度为350℃，驻留时间为200ms。西格列汀和西格列汀-d4的碰撞电压分别为18v、19v，正离子方式检测；扫描方式为多重反应监测。
[0074]
用于定量分析的离子反应分别为：西格列汀：m/z 408.1
→
235.1和西格列汀-d4：
m/z 412.2
→
239.1。
[0075]
二、实验过程
[0076]
1、西格列汀标准曲线工作溶液的配制
[0077]
西格列汀标准曲线工作溶液的配制：精密称取适量的西格列汀标准品，经质量校正系数校正后，将其溶于80％甲醇中，得到最终浓度为1.000mg/ml的储备液。再以50％甲醇依次稀释配制西格列汀工作溶液，具体稀释浓度见下表4。
[0078]
表4西格列汀工作溶液配制浓度
[0079][0080]
ss表示储备液，ws表示工作液。西格列汀标准曲线工作溶液在棕色玻璃瓶中配制并存储于-20℃条件下，体积可视需要依比例增加或减少。
[0081]
2、西格列汀质量控制工作溶液的配制
[0082]
西格列汀工作溶液的配制：精密称取适量的西格列汀标准品，经质量校正系数校正后，将其溶于80％甲醇中，得到最终浓度为1.000mg/ml的储备液，再以50％甲醇依次稀释配制西格列汀工作溶液，具体稀释浓度见下表5。
[0083]
表5西格列汀质量控制工作溶液配制浓度
[0084][0085]
ss表示储备液，ws表示工作液。西格列汀工作溶液在棕色玻璃瓶中配制并存储于-20℃条件下，体积可视需要依比例增加或减少。
[0086]
3、西格列汀-d4内标工作溶液的配制
[0087]
西格列汀-d4内标工作溶液的配制：取西格列汀-d4标准品一支，经质量校正系数校正后，将其溶于80％甲醇中，得到最终浓度为0.500mg/ml的储备液。再以体积分数为50％的甲醇水溶液溶稀释配制20.000ng/ml内标西格列汀-d4工作溶液，具体稀释浓度见下表6。
[0088]
表6西格列汀-d4工作溶液配制浓度
[0089][0090]
西格列汀-d4内标工作溶液在棕色玻璃瓶中配制并存储于-20℃条件下，体积可视需要依比例增加或减少。
[0091]
4、线性实验
[0092]
将空白血浆于室温环境解冻；转移190μl的空白血浆8份至聚丙烯管中(每一个标准曲线样本)，分别精密加入不同浓度的西格列汀工作溶液10μl制备每一个样本并混匀，配成不同浓度的含药血浆，按“血浆样品预处理”操作。计算西格列汀峰面积as和内标西格列汀-d4峰面积ai的比值y(y＝as/ai)，以峰面积比值y对血药浓度x作回归计算。以平均比值y对血药浓度x做回归计算，按该方法测得的西格列汀的血药浓度的最低定量限为：2.000ng/ml。lc-ms/ms法测得的西格列汀在人血浆中的标准曲线参数如表7。
[0093]
表7 lc-ms/ms法测得的西格列汀在人血浆中的标准曲线(ng/ml)
[0094][0095]
5、准确度和精密度
[0096]
将空白血浆于室温环境解冻；转移适当体积的空白血浆至聚丙烯管中，并添加西格列汀质量控制工作溶液制备5种不同浓度的含药血浆质控样品(lloq、lqc、m1qc、m2qc、hqc)及一条随行标准曲线，按“血浆样品预处理”操作。在至少两天，至少在三个分析批中完成，计算西格列汀峰面积as和内标西格列汀-d4峰面积ai的比值y，代入当天的标准曲线中求得实测浓度，由实测浓度计算批内与批间精密度，实测浓度与加入浓度的比值即为准确度，结果见表8。结果表明，西格列汀血浆样品批内、批间精密度、准确度小于
±
15％符合要求。
[0097]
依每一分析批所需，可以选择分装足够的体积至已标示的聚丙烯管中并储存于-70℃条件下。体积可视需要依比例增加或减少。
[0098]
表8 lc-ms/ms法测定血浆中西格列汀的批内、批间精度和准确度
[0099][0100]
6、基质效应
[0101]
六个不同空白血浆样品分别来源不同健康人体，将六个不同空白血浆样品于同一分析批依样本制备步骤制备及分析，来评价不同空白血浆对西格列汀分析物及内标西格列汀-d4的干扰。其内标归一化的基质因子cv％均小于等于1.8％。详情见表9。
[0102]
表9中，当“无显著峰值可以被积分(或没有峰)”或“峰面积的保留时间不符合样本中分析物或内标物的保留时间”，该区域峰面积认为是零。
[0103]
表9六个不同来源空白健康人体血浆的基质效应
[0104][0105]
从表9可以看出，不同人体的空白血浆对西格列汀的检测结果没有造成干扰。因此，该方法可以用于检测不同人体血浆中的西格列汀浓度。
[0106]
7、稀释可靠性
[0107]
考察样品稀释2倍可靠性的样品制备方法：取浓度为1.000mg/ml的西格列汀储备液，以50％甲醇为稀释剂配制西格列汀浓度为30000.000ng/ml的工作溶液。
[0108]
将空白血浆于室温环境解冻，转移380μl的空白血浆至聚丙烯管中，并添加20μl上述工作溶液制备含药血浆稀释质控样品(浓度为1500.000ng/ml)，涡旋混匀，制成高于定量上限的样品，随后取50μl该样品于新聚丙烯管中，加50μl空白血浆稀释2倍，得到稀释2倍样品(浓度为750.000ng/ml)。然后按“血浆样品预处理”操作，平行处理6次，结果见表10。准确度偏差为-0.6％～5.0％，说明稀释可靠性满足接受标准。
[0109]
表10稀释可靠性考察结果
[0110][0111]
8、回收率
[0112]
提取回收率是指通过比较处理过的加标样品中待测物/内标响应和处理过的空白
基质中加入待测物/内标的响应值来确定。配制lqc、m2qc、hqc 3个浓度水平，每个浓度水平6个重复的样品。接受标准为每个浓度水平的样品的待测物和所有浓度水平的内标：正常提取样品的峰面积、提取基质后样品的峰面积、各浓度水平的样品的回收率的cv％在1.3％～2.8％。西格列汀和西格列汀-d4均满足接受标准，结果见表11和表12。
[0113]
表11待测物提取回收率
[0114][0115]
表12内标回收率
[0116][0117]
9、稳定性
[0118]
(1)冻融稳定性
[0119]
样品制备方法与质控样品的配制相同，配制结束后分别放置于-70℃冰箱或-20℃冰箱进行存储，再取出于室温条件下放置融解，各冻融5次，每组平行6份，然后按“血浆样品预处理”操作，取1μl测试样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，结果见表13和表14。
[0120]
高/低浓度样品在-70℃下冻融5次的条件下测量浓度与标示值的偏差在-8.9～-0.1％范围内，高/低浓度样品在-20℃下冻融5次的条件下测量浓度与标示值的偏差在-13.7％～-3.8％范围内，说明样品在-70℃或-20℃冰箱中冻融处理5次是稳定的。
[0121]
表13
ꢀ‑
70℃与室温间冻融5次的稳定性考察结果
[0122][0123]
表14
ꢀ‑
20℃与室温间冻融5次的稳定性考察结果
[0124][0125]
(2)长期稳定性
[0126]
样品制备方法与质控样品的配制相同，配制结束后分别放置于-70℃冰箱进行存储46天后，再取出于室温条件下放置融解，每组平行6份，然后按“血浆样品预处理”操作，取1μl测试样品注入高效液相色谱串联质谱仪中，结果见表15。
[0127]
高/低浓度样品在-70℃下存储46天后，测量浓度与标示值的平均准确度偏差在-4.8％～3.9％范围内，说明样品在-70℃冰箱中存储46天是稳定的。
[0128]
表15
ꢀ‑
70℃长期存储稳定性考察结果
[0129][0130]
10、人血浆样品检测
[0131]
将室温下解冻的样品或新配制的样品，涡旋混匀。在96孔板的孔中加入50μl样品(标准曲线，质控样品，系统适用性样品或待测生物样品，对于双空白样品或者零点样品，加入50μl的空白基质样品)；对于双空白样品或uloq without is样品，加入50μl 50％甲醇溶液，对于其他样品加入50μl内标工作液(100.000ng/ml)，混匀后每一个样品孔中加入300μl甲醇，封板，混匀10min，样品在4℃，2623g离心10min取离心后上清液100μl至另一96孔收集板中，加入300μl 50％甲醇(含0.5％甲酸)，封板，混匀10min样品在4℃，2623g离心10min，待进样。以上过程中均需于室温黄光条件下操作。
[0132]
四、小结
[0133]
综上所述，本发明提供了一种预处理方法简便的血浆中西格列汀浓度的测定方法，采用简单的蛋白沉淀处理，适用于常规测定；由上述分析可知，在本实验所采用的色谱条件下，西格列汀保留时间为1.55min左右，内标西格列汀-d4保留时间在1.55min左右，西格列汀和内标西格列汀-d4的峰形良好，无明显杂峰干扰测定，基线平稳。本方法的血浆标准曲线线性范围为2.000ng/ml～1000.000ng/ml，批内和批间精密度cv％均小于
±
15％；本方法具有较高的特异性、稳定性好、方便可控能准确测定血浆中的西格列汀的浓度；同时，本发明方法准确、重现性好，为西格列汀的血药浓度测定提供依据。
[0134]
本发明技术方案在上面结合附图对发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性改进，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。