一种恩他卡朋原料或其制剂中N-亚硝基二甲胺与N-亚硝基二乙胺的检测方法与流程

一种恩他卡朋原料或其制剂中n-亚硝基二甲胺与n-亚硝基二乙胺的检测方法
技术领域
1.本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种恩他卡朋原料或其制剂中n
‑ꢀ
亚硝基二甲胺与n-亚硝基二乙胺的检测方法。


背景技术：

2.恩他卡朋，英文名称为entacapone，化学名为(e)-2-氰基-3-(3，4-二羟基
‑ꢀ
5-硝苯基)-n，n-二乙基-2-丙烯酰胺，结构式如下。恩他卡朋是一种高选择性和强效的儿茶酚胺氧位-甲基转移酶(comt)抑制剂，临床上主要作为左旋多巴辅助药用于治疗帕金森病。
[0003][0004]
现有合成恩他卡朋原料的工艺可能会在恩他卡朋原料中残留两种痕量的亚硝胺类基因毒性杂质：n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺 (ndea)。按照ich m7指导原则，恩他卡朋原料中ndma的可接受限度＝ttc(ng/天)/mdd(mg/天)＝96.0(ng/天)/2000(mg/天)＝0.048ppm(ng/mg)； ndea的可接受限度＝ttc(ng/天)/mdd(mg/天)＝26.5(ng/天)/2000(mg/天) ＝0.01325ppm(ng/mg)；其中ttc表示毒理学关注阈值，mdd表示最大每日剂量，恩他卡朋最大每日剂量以2000mg计算。
[0005]
常规高效液相色谱检测方法的灵敏度不能满足恩他卡朋原料或其制剂中 ndma和ndea的检测要求。为了更好地监控恩他卡朋原料或其制剂产品的质量，保证恩他卡朋产品的临床用药安全，有必要研发一种准确可靠检测恩他卡朋原料或其制剂中ndma和ndea的方法。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术中不能对恩他卡朋原料或制剂中ndma和ndea进行有效检测的问题，本发明提供一种恩他卡朋原料或其制剂中n-亚硝基二甲胺与n
‑ꢀ
亚硝基二乙胺的检测方法。
[0007]
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
[0008]
一种恩他卡朋原料或其制剂中n-亚硝基二甲胺与n-亚硝基二乙胺的检测方法，采用高效液相色谱与质谱联用法进行检测，包括如下步骤：
[0009]
(1)供试品溶液和混合对照品溶液的配制：
[0010]
取恩他卡朋原料或其制剂，用水配制成供试品溶液；
[0011]
取n-亚硝基二甲胺和n-亚硝基二乙胺对照品，用水配制成混合对照品溶液；
[0012]
(2)对所述混合对照品溶液和供试品溶液进行检测，其中，所述高效液相色谱的条件为：
[0013]
采用c18色谱柱，以体积浓度为0.05％-0.15％甲酸水溶液为流动相a，以体积浓度为0.05％-0.15％甲酸的甲醇溶液为流动相b，梯度洗脱；
[0014]
所述质谱采用apci离子源，正离子检测模式，其中，所述n-亚硝基二甲胺的定量离子为：母离子为75.0m/z，子离子为43.2m/z，碰撞电压为23v，所述n-亚硝基二甲胺的定性离子为：母离子为75.0m/z，子离子为58.1m/z，碰撞电压为17v；所述n-亚硝基二乙胺的定量离子为：母离子为103.0m/z，子离子为75.1m/z，碰撞电压为16.5v，所述n-亚硝基二甲胺的定性离子为：母离子为103.0m/z，子离子为47.1m/z，碰撞电压为25v。
[0015]
相对于现有技术，本发明提供的恩他卡朋原料或其制剂中n-亚硝基二甲胺与n-亚硝基二乙胺的检测方法，采用c18色谱柱，通过特定的流动相，以梯度洗脱方式，配合特定的质谱条件，实现了恩他卡朋原料或其制剂中痕量的 ndma和ndea的准确检出，ndma的检测限为0.005ng/mg，ndea的检测限为0.0025ng/mg，符合ich m7的指导原则的检测要求。且本发明提供的方法经专属性、精密度、灵敏度等方法学研究及验证，发现本发明的方法灵敏、准确、重现性较好，能够用更为简便的方法实现对恩他卡朋中ndma和 ndea的定性和定量检测，从而为提高和更好地控制恩他卡朋药品的质量提供有效保障，有利于保证恩他卡朋产品质量的一致性和稳定性，从而有利于提高恩他卡朋产品用药的临床安全性和有效性。
[0016]
优选的，流动相a为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为体积浓度为0.1％甲酸的甲醇溶液。
[0017]
优选的流动相在不产生基线干扰的前提下，能够更好地分离恩他卡朋、 ndma和ndea，并且有效改善峰形，使检测结果的准确度及精密度更高。
[0018]
优选的，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
[0019]
0min，96％-94％流动相a，4％-6％流动相b；
[0020]
3min，96％-94％流动相a，4％-6％流动相b；
[0021]
5min，80％流动相a，20％流动相b；
[0022]
9min，100％流动相b；
[0023]
11min，100％流动相b；
[0024]
11.1min，96％-94％流动相a，4％-6％流动相b。
[0025]
进一步优选的，所述梯度洗脱的洗脱程序如下：
[0026]
0min，95％流动相a，5％流动相b；
[0027]
3min，95％流动相a，5％流动相b；
[0028]
5min，80％流动相a，20％流动相b；
[0029]
9min，100％流动相b；
[0030]
11min，100％流动相b；
[0031]
11.1min，95％流动相a，5％流动相b；
[0032]
16min，95％流动相a，5％流动相b。
[0033]
优选的梯度洗脱顺序，可以提高主成分与ndma、ndea杂质峰之间的分离度和检测的灵敏度，使检测结果定量准确，且精密度高。
[0034]
优选的，所述质谱的扫描模式为多反应监测，气帘气体压力为30psi，碰撞气体为medium，去簇电压为50v，射入电压为10v，碰撞室射出电压为 10v，雾化气体电流为3μa，离子源气体1压力为35psi，离子化温度为 350℃。
[0035]
优选的质谱分析条件下，能够最大限度地提高恩他卡朋中ndma和 ndea测定的准确性。
[0036]
优选的，所述色谱柱的规格为4.6mm*100mm，填料直径为3μm。
[0037]
进一步优选的，所述色谱柱为ymc-triart c18，4.6mm*100mm，3μm。
[0038]
优选的色谱柱规格可以使各组分峰形、分离度及检测的灵敏度俱佳，且基线干扰较小，从而有利于恩他卡朋中ndma和ndea的检出，且结果准确可靠，重复性好。
[0039]
优选的，柱温为27℃-33℃，流速为0.55ml/min-0.65ml/min。
[0040]
进一步优选的，柱温为30℃，流速为0.6ml/min。
[0041]
优选的，进样体积为50μl。
[0042]
优选的检测条件有利于恩他卡朋中ndma和ndea的有效检出，提高检测的灵敏度，从而达到有效准确检测恩他卡朋中痕量ndma和ndea含量的目的。
[0043]
优选的，供试品溶液的浓度为100mg/ml。
[0044]
优选的供试品浓度有利于使主成分及杂质的峰形更好，柱效高，积分更准确，从而有利于对供试品中ndma和ndea的含量进行更准确的计算。
[0045]
优选的，所述混合对照品溶液中n-亚硝基二甲胺的浓度为4.8ng/ml，n
‑ꢀ
亚硝基二乙胺的浓度为1.3ng/ml。
[0046]
本发明提供的检测方法，能够实现对恩他卡朋原料或制剂中痕量的 ndma和ndea杂质的准确定性及定量检测，有利于对恩他卡朋原料及其制剂的质量进行有效控制，从而保证恩他卡朋产品的临床用药安全性，整个操作过程可靠、可控，适于实际应用和推广，具有较高的实用价值。
附图说明
[0047]
图1为实施例2中2.1项下空白溶液的色谱图；
[0048]
图2为实施例2中2.1项下对照品溶液的色谱图；
[0049]
图3为实施例2中2.1项下供试品溶液的色谱图；
[0050]
图4为实施例2中2.1项下供试品加对照品溶液的色谱图；
[0051]
图5为对比例1中对照品溶液的色谱图；
[0052]
图6为对比例2中对照品溶液的色谱图。
具体实施方式
[0053]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0054]
实施例1
[0055]
1.1溶液的配制
[0056]
(1)空白溶液：纯水。
[0057]
(2)对照品储备液：取ndma和ndea适量，精密称定，加水配制成每1ml约含100.98ng ndma和26.23ng ndea的混合溶液，作为对照品贮备液。
[0058]
(3)对照品溶液：取对照品贮备液适量，加水稀释成每1ml中约含 4.8ng的ndma和
1.3ng的ndea溶液，作为对照品溶液。
[0059]
(4)供试品溶液：取恩他卡朋供试品约500mg，精密称定，置于10ml 离心管中，加入5.0ml水，充分摇匀后过滤，作为供试品溶液。
[0060]
(5)供试品加对照品溶液：取对照品贮备液0.25ml加入10ml离心管中，加入恩他卡朋供试品约500mg，精密称定，最后加入4.75ml，充分摇匀后过滤，作为供试品加对照品溶液。
[0061]
1.2恩他卡朋原料或制剂中ndma和ndea的检测方法：
[0062]
色谱柱：ymc-triart c18，4.6mm*100mm，3μm；
[0063]
流动相a：0.1％甲酸的水溶液；
[0064]
流动相b：0.1％甲酸的甲醇溶液；
[0065]
流速：0.6ml/min；
[0066]
进样体积：50μl；
[0067]
柱温：30℃；
[0068]
梯度洗脱，洗脱程序如下：
[0069]
mina相％b相％09553.009555.0080209.00010011010011.195516.00955
[0070]
质谱条件：采用apci离子源，使用正离子检测模式，扫描模式为多反应监测(mrm)，气帘气体(cur)压力为30psi，碰撞气体(cad)为 medium，去簇电压(dp)为50v，射入电压(ep)为10v，碰撞室射出电压 (cxp)为10v，雾化气体(nc)电流为3μa，离子源气体1(gs1)压力为35psi，离子化温度(tem)为350℃，检测离子对以及碰撞电压(ce)见下表。
[0071][0072]
实施例2
[0073]
方法学验证：
[0074]
2.1专属性
[0075]
取实施例1配制的空白溶液(纯水)、对照品溶液、供试品溶液和供试品加对照品溶
液各50μl，分别按照上述条件进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，各色谱图如图1-图4所示。
[0076]
试验结果表明，基线平稳，空白溶液及恩他卡朋供试品对ndma和ndea的检测无干扰，表明本方法专属性良好，适合ndma和ndea的检查。
[0077]
2.2检测限和定量限
[0078]
检测限：取实施例1配制的对照品溶液，用水逐级定量稀释，进行 hplc-ms/ms检测，记录色谱图，按信噪比不低于3:1，得到检测限，结果见表1。
[0079]
定量限：取实施例1配制的对照品溶液，用水逐级定量稀释，进行 hplc-ms/ms检测，记录色谱图，按信噪比不低于10:1，得到定量限，结果见表1。平行制备定量限溶液6份，进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，观察定量限精密度，结果见表2。
[0080]
表1检测限、定量限检测结果
[0081][0082]
表2定量限重复性检测结果
[0083]
峰面积123456平均rsdndma190351991219487206631952718953195963.21％ndea335583448136536338213506836723350313.84％
[0084]
结果显示，ndma检测限浓度为0.50ng/ml，相当于供试品0.005ng/mg 可被检出；ndea检测限浓度为0.25ng/ml，相当于供试品0.0025ng/mg可被检出。
[0085]
ndma定量限浓度为1.01ng/ml，相当于供试品0.010ng/mg可被定量检出；ndea定量限浓度为0.40ng/ml，相当于供试品0.0040ng/mg可定量被检出。6针定量限重复性良好，证明本方法灵敏度高，符合恩他卡朋成品中 ndma和ndea杂质的检测要求。
[0086]
2.3线性范围
[0087]
对照品贮备液：取ndma和ndea对照品适量，精密称定，用水制成每 1ml中约含100.98ng ndma和26.23ng ndea的混合溶液，作为对照品贮备液。
[0088]
线性溶液：精密量取对照品贮备液适量，分别用水制成每1ml中约含 ndma 1.01ng、2.02ng、3.03ng、5.05ng、7.07ng、10.10ng以及每1ml中约含 ndea 0.40ng、0.53ng、0.80ng、1.33ng、1.60ng、2.66ng溶液，作为线性溶液。
[0089]
取各线性溶液，进行hplc-ms/ms检测，记录谱图。以ndma和ndea 浓度(ng/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表3。
[0090]
表3 ndma和ndea线性试验结果
[0091][0092]
检测结果显示，ndma在1.01～10.10ng/ml的浓度范围内线性关系良好，线性方程：y＝20607x-2609.3，线性相关系数r＝0.9991；ndea在 0.40～2.66ng/ml的浓度范围内线性关系良好，线性方程：y＝47070x 12284，线性相关系数r＝0.9952。
[0093]
2.4重复性
[0094]
供试品溶液：取供试品溶液约500mg，精密称定，置于10ml离心管中，加入5.0ml水，充分摇匀后过滤，作为供试品溶液，平行制备6份。
[0095]
取上述制备的供试品溶液进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，检测结果如表4所示。
[0096]
表4 ndma和ndea重复性试验结果
[0097][0098]
试验结果表明，同批样品配制6份溶液，供试品中ndma和ndea均未检出，重现性良好。
[0099]
2.5准确度
[0100]
ndma贮备液：取ndma对照品适量，精密称定，用水制成每1ml中约含100.98ng的ndma溶液。
[0101]
60％ndma限度回收率溶液：加nmda贮备液0.15ml于离心管中，加入恩他卡朋供试品约500mg，精密称定，加水4.85ml，充分摇匀后过滤，平行制备三份。
[0102]
100％ndma限度回收率溶液：加ndma贮备液0.25ml于离心管中，加入恩他卡朋供试品约500mg，精密称定，加水4.75ml，充分摇匀后过滤，平行制备三份。
[0103]
140％ndma限度回收率溶液：加ndma贮备液0.35ml于离心管中，加入恩他卡朋供试品约500mg，精密称定，加水4.65ml，充分摇匀后过滤，平行制备三份。
[0104]
ndea贮备液：取ndea对照品适量，精密称定，用水制成每1ml中约含26.63ng的ndma溶液。
[0105]
80％ndea限度回收率溶液：加ndea贮备液0.2ml于离心管中，加入恩他卡朋供试品约500mg，精密称定，加水4.80ml，充分摇匀后过滤，平行制备三份。
[0106]
100％ndea限度回收率溶液：加ndea贮备液0.25ml于离心管中，加入恩他卡朋供试品约500mg，精密称定，加水4.75ml，充分摇匀后过滤，平行制备三份。
[0107]
120％ndea限度回收率溶液：加ndea贮备液0.30ml于离心管中，加入恩他卡朋供试品约500mg，精密称定，加水4.7ml，充分摇匀后过滤，平行制备三份。
[0108]
取对照品溶液和各组回收率溶液，分别进行hplc-ms/ms检测，记录谱图，回收率结果见表5。
[0109]
回收率(％)＝(测得量-原有量)/加入量
×
100％。
[0110]
表5 ndma和ndea回收率检测结果
[0111][0112]
结果显示，ndma在60％-140％限度浓度范围内，回收率在97.64％
‑ꢀ
103.91％之间；ndea在80％-120％限度浓度范围内，回收率在89.26％
‑ꢀ
108.80％之间，方法准确度良好。
[0113]
2.6精密度
[0114]
对照品贮备液：取ndma和ndea对照品适量，精密称定，用水制成每 1ml中约含100.98ng的ndma和26.23ng的ndea溶液，作为对照品贮备液。
[0115]
对照品溶液：取对照品贮备液适量，用水制成每1ml中约含4.8ng的 ndma和1.3ng的ndea溶液，作为对照品溶液。
[0116]
取对照品溶液进行hplc-ms/ms检测，连续进样检测6次，记录谱图，检测结果见表6。
[0117]
表6精密度实验结果
[0118][0119]
结果显示，连续检测6次，ndma和ndea对照品溶液的峰面积rsd值均小于10％，说明本方法精密度良好。
[0120]
2.7耐用性
[0121]
对照品贮备液：取ndma和ndea对照品适量，精密称定，用水制成每 1ml中约含100.98ng的ndma和26.23ng的ndea溶液，作为对照品贮备液。
[0122]
对照品溶液：取对照品贮备液适量，用水制成每1ml中约含4.8ng的 ndma和1.3ng的ndea溶液，作为对照品溶液。
[0123]
将对照品溶液进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图。通过微调色谱条件：流速0.65ml/min和0.55ml/min，柱温33℃和27℃，梯度中流动相b初始值4％和6％，考察ndma和ndea的耐用性，结果如表7所示。
[0124]
表7 ndma和ndea耐用性试验结果
[0125]
方法条件ndma峰面积ndea峰面积原方法9760970045流速0.65ml/min9483466716流速0.55ml/min10011677060柱温33℃9578876019柱温27℃9597172131b相4％9121571978b相6％11093068029平均值9806671711rsd6.41％5.36％
[0126]
结果显示，微调色谱条件对ndma和ndea检测无影响，该方法耐用性良好。
[0127]
2.8中间精密度
[0128]
供试品溶液：取供试品溶液约500mg，精密称定，置于10ml离心管中，加入5.0ml水，充分摇匀后过滤，作为供试品溶液，平行制备6份。
[0129]
取上述制备的供试品溶液进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图。该部分的检测与重
复性检测的日期和操作者不同，检测结果如表8所示。
[0130]
表8中间精密度试验结果
[0131][0132]
结果显示，6份供试品溶液，均未检出ndma和ndea，与重复性结果一致，本方法中间精密度性良好。
[0133]
2.9稳定性
[0134]
对照品贮备液：取ndma和ndea对照品适量，精密称定，用水制成每 1ml中约含100.98ng的ndma和26.23ng的ndea溶液，作为对照品贮备液。
[0135]
对照品溶液：取对照品贮备液适量，用水制成每1ml中约含4.8ng的 ndma和1.3ng的ndea溶液，作为对照品溶液。
[0136]
供试品溶液：取供试品溶液约500mg，精密称定，置于10ml离心管中，加入5.0ml水，充分摇匀后过滤，作为供试品溶液。
[0137]
将对照品溶液和供试品溶液在室温下放置，每隔0h、2h、4h、6h、8h进行hplc-ms/ms检测，记录色谱图，检测结果如表9和表10所示。
[0138]
表9对照品溶液稳定性试验结果
[0139][0140]
表10供试品溶液稳定性试验结果
[0141][0142]
结果显示，供试品溶液在室温条件下，放置8小时，ndma和ndea均未检出；对照品溶液在室温条件下，放置8小时，峰面积的rsd为3.84％ (≤10％)，上述溶液的稳定性均良好。
[0143]
实施例3样品检测
[0144]
按照实施例1的恩他卡朋原料中ndma和ndea的检测方法，检测6批恩他卡朋原料样品中的ndma和ndea的含量，结果如表11所示。
[0145]
表11样品检测结果
[0146]
批次ndma含量(ng/mg)ndea含量(ng/mg)1未检出未检出
2未检出未检出3未检出未检出4未检出未检出5未检出未检出6未检出未检出
[0147]
结果显示，6批恩他卡朋原料样品中ndma和ndea含量均未检出，符合限度规定(ndma≤0.048ppm，ndea≤0.01325ppm)。
[0148]
对比例1
[0149]
本对比例提供的恩他卡朋原料中ndma和ndea的检测方法与实施例1 中完全相同，不同的仅是将流动相b替换为0.1％甲酸的乙腈溶液。取实施例 1制备的对照品溶液进样检测，结果如图5所示。
[0150]
从图中可以看出，基线不平稳，无法实现对ndma和ndea的准确定量计算。
[0151]
对比例2
[0152]
本对比例提供的恩他卡朋原料中ndma和ndea的检测方法与实施例1 中完全相同，不同的仅是将混合对照品溶液的配制溶剂替换为甲醇，取甲醇配制的混合对照品溶液进样检测，结果如图6所示。
[0153]
从图中可以看出，以甲醇作为溶剂配制对照品溶液或供试品溶液时，无法实现ndma和ndea的准确定量计算。
[0154]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。