一种快速检测小鼠血清中鼠肝炎病毒抗体的试剂盒的制作方法

1.本发明属于免疫胶体金层析分析技术领域，具体涉及一种快速检测小鼠血清中鼠肝炎病毒抗体的试剂盒。


背景技术：

2.小鼠肝炎病毒mhv可引起小鼠的肝炎、脑炎和肠炎。由于mhv可改变各种免疫应答参数，并影响酶的活性，所以会对实验结果产生严重影响。
3.mhv的主要毒株有mhv1、mhv2[mhv(pr)]、mhv3、mhv4(jhm)、a59、mhvs、mhvz和mhvu等，这些毒株在抗原性上相似，但也存在一些差异。传统诊断方法主要是病毒的细胞分离培养、pcr、elisa和荧光抗体试验。病毒分离培养费时费力且对实验条件和人员要求较高。pcr、elisa和荧光抗体实验也都需要在实验室通过专业人员操作完成，且用时都在几个小时以上。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于提供一种快速检测小鼠血清中鼠肝炎病毒抗体的试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0005]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种快速检测小鼠血清中鼠肝炎病毒抗体的试剂盒，包括胶体金试纸卡和样品稀释液，所述胶体金试纸卡包括封闭的盒体以及平铺在所述盒体内部的反应试纸条，所述盒体上分别开设有连通至所述反应试纸条的观察窗和加样孔，所述样品稀释液为包括0.01m ph7.2的pbs和1％tween-20的混合溶液；所述反应试纸条包括底板、沿所述底板长度方向依次设置在其上且相接触的样品垫、胶体金复合物垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；所述硝酸纤维素膜包括有检测带一、检测带二和一条对照带，所述检测带一包被有兔抗小鼠igm二抗，所述检测带二包被有mhv-n20抗原；所述对照带包被有抗trx单克隆抗体，所述胶体金复合物垫上还固定有胶体金标记的鼠肝炎病毒抗原mhv-n39。
[0006]
优选的，所述盒体包括有配合设置的上盒体和下盒体，所述观察窗和加样孔设置于盒体的上盒体上，且所述加样孔对应设置在所述样品垫上方，所述观察窗对应设置在所述硝酸纤维素膜上方。
[0007]
优选的，所述胶体金标记的抗原mhv-n39是将mhv病毒n基因上一段约20kd的蛋白基因插入pet-32a质粒，后用大肠杆菌原核表达的含有trx标签的约39kd的融合蛋白。
[0008]
优选的，所述样品稀释液存放在5ml滴瓶内。
[0009]
优选的，所述检测带二包被的mhv-n20抗原是将mhv病毒n基因上一段约20kd的蛋白基因插入pet-28a质粒，后用大肠杆菌原核表达的蛋白。
[0010]
优选的，所述检测带一可以特异性的捕获小鼠血清中的抗鼠肝炎病毒igm抗体，所述检测带二可以特异性的捕获剩余其它亚型的鼠肝炎病毒抗体。
[0011]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用mhv所有已知毒株都相同的保
守抗原片段，作为检测抗原，可检出所有已知mhv毒株所产生的抗体；同时在一个胶体金层析装置上，利用两条检测带，采用捕获法与双抗原夹心法，区分igm抗体与igg抗体，可有效区分隐性感染和急性期感染；该快速检测小鼠血清中鼠肝炎病毒染抗体的试剂盒，能在不需要其他仪器设备的情况下，15分钟内检测出小鼠血清中的mhv抗体，并且有效区分igm抗体和igg抗体；解决了目前没有一个快速、简单且有效检测小鼠肝炎病毒感染的方法的问题，为各实验动物单位提供了简便、有效的工具，其意义深远，同时又市场价值巨大。
附图说明
[0012]
图1为本发明实施例中胶体金免疫层析试纸卡的俯视结构示意图；
[0013]
图2为本发明实施例中胶体金免疫层析试纸卡的主视结构示意图；
[0014]
图3为本发明实施例中胶体金免疫层析试纸卡的仰视结构示意图；
[0015]
图4为本发明实施例的结果判断示意图；
[0016]
图中：1-反应试纸条，11-底板，12-样品垫，13-胶体金复合物垫，14-硝酸纤维素膜，141-检测带一，142-检测带二，143-对照带，15-吸水垫，2-盒体，3-观察窗，4-加样孔。
具体实施方式
[0017]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0018]
实施例1
[0019]
请参阅图1-3，本发明实施例中，一种快速检测小鼠血清中鼠肝炎病毒染抗体的试剂盒，包括胶体金试纸卡和样品稀释液，胶体金试纸卡包括封闭的盒体2以及平铺在所述盒体2内部的反应试纸条1，盒体2上分别开设有连通至反应试纸条1的观察窗3和加样孔4；样品稀释液为包括0.01m ph7.2的pbs和1％tween-20的混合溶液。
[0020]
进一步的，盒体2包括有配合设置的上盒体和下盒体，观察窗3和加样孔4设置于盒体2的上盒体上。
[0021]
进一步的，样品稀释液存放在5毫升滴瓶内。
[0022]
进一步的，反应试纸条1包括底板11、沿所述底板11长度方向依次设置在其上且相接触的样品垫12、胶体金复合物垫13、硝酸纤维素膜14以及吸水垫15；硝酸纤维素膜14包括有一条检测带一141，检测带二142和一条对照带143。
[0023]
进一步的，加样孔4对应设置在所述样品垫12上方；观察窗3对应设置在硝酸纤维素膜14上方。
[0024]
进一步的，胶体金复合物垫13上还固定有胶体金标记鼠肝炎病毒抗原mhv-n39；检测带一141包被有兔抗小鼠igm二抗；检测带二142包被有mhv-n20抗原；对照带143包被有抗trx单克隆抗体；检测带一141包被的兔抗小鼠igm二抗是用纯化的小鼠igm抗体免疫新西兰大白兔后经过亲和纯化得到的，能特异性的结合小鼠igm,并与小鼠igg无交叉反应。
[0025]
检测带二142包被的mhv-n20抗原是基因工程表达的mhv病毒n基因上一段约20kd的蛋白；此抗原的氨基酸序列，与已知的mhv1、mhv2[mhv(pr)]、mhv3、mhv4(jhm)、a59、mhvs、
mhvz和mhvu各种毒株比较，都高度同源(＞99％)。
[0026]
胶体金复合物垫13是采用mhv-n39抗原，与胶体金颗粒标记后干燥于玻璃纤维而制成；mhv-n39抗原是同上的mhv-n20抗原序列在pet-32a中表达后增加一个trx标签蛋白后的抗原蛋白；trx的加入使其有更好的可溶性，便于胶体金标记。
[0027]
反应试纸条1或试剂盒在使用时，把待检样本加入到加样孔4后，沿着反应试纸条1侧向流动，并在流经胶体金复合物垫13时同样溶解胶体金复合物垫13中的胶体金标记的mhv-n39抗原，再一起沿着硝酸纤维素膜14流动；当样品含有小鼠肝炎抗体时样品中的抗体与胶体金标记的mhv-n39抗原结合形成鼠肝炎抗体
‑‑
mhv-n39抗原-胶体金的复合物，当此复合物流经检测带一141时，igm亚型的抗体被固定在硝酸纤维素膜14上检测带一141(t1线)处的兔抗小鼠igm二抗捕获，形成“兔抗小鼠igm二抗-鼠肝炎igm抗体-胶体金标记的mhv-n39抗原”的复合物结构，因为胶体金颗粒的富集而显示红色线条；当此复合物流经检测带二142时，其它亚型的抗体被固定在硝酸纤维素膜14上检测带二142(t2线)处的mhv-n20抗原捕获，形成“mhv-n20抗原-小鼠肝炎抗体-胶体金标记的mhv-n39抗原”的复合物结构，因为胶体金颗粒的富集而显示红色线条；当样品中不含有小鼠肝炎抗体时，则无法形成以上的的复合物结构，因而在检测带(t线)处就不会有胶体金颗粒的富集，无红色条带形成。
[0028]
实施例2
[0029]
请参阅图4，本发明实施例中，所述的快速检测小鼠血清中鼠肝炎病毒染抗体的试剂盒的应用方法如下：
[0030]
基因合成与基因工程菌构建
[0031]
选用小鼠肝炎病毒n蛋白(ncbi reference sequence:np_045302.1)氨基酸序列中231-413之间一段182个氨基酸残基序列作为表达序列，送生工生物进行基因合成并分别亚克隆插入表达质粒pet-28a和pet-32a中。
[0032]
231pdmaeeiaal vlaklgkdag qpkqvtkqsa kevrqkilnk prqkrtpnkq cpvqqcfgkr gpnqnfggse mlklgtsdpq fpilaelapt vgafffgskl elvkknsgga deptkdvyel qysgavrfds tlpgfetimk vlnenlnayq kdggadvvsp kpqrkgrrqa qekkdevdnv sva*
[0033]
吸取20μl bl21(de3)感受态细胞加入预冷管中，将1μl的质粒dna直接加入细胞中，轻微摇动混和随后将管重置于冰中，确保除了管盖其他部分都置于冰中，冰浴5分钟，42℃水浴30秒，不摇动，冰上放置2分钟。每管加入80μl室温soc培养基。从冰上取出；分别在含amp抗性和kam抗性的lb平板上挑选pet-32a转化子和pet-28a转化子，扩大培养后加入甘油作为种子批菌株pet-32a-mhv和pet-28a-mhv，-80保存。
[0034]
二、mhv-n39抗原和mhv-n20抗原的表达与纯化
[0035]
分别取50ul pet-32a-mhv和pet-28a-mhv种子甘油菌，接种于5ml不同抗性的lb液体培养基中，37℃过夜扩大培养；分别将扩大后的菌种1ml加入200ml对应抗性的lb培养基中，37℃摇床培养至od600到0.6-0.8之间，加入100mm iptg储液至终浓度0.4mm，继续培养2－3小时；将摇瓶置于冰上5分钟，5000g 4℃离心5分钟收集菌体；重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mm tris-hcl(ph8.0)中，离心，除去上清，菌体分别加入20ml pbs(0.01m ph 7.4)缓冲液；超声破碎菌体，离心去沉淀；上清上镍柱亲和层析纯化，250mm咪唑洗脱表达的目的蛋白，用0.01m ph7.4的pbs透析后，得到纯化的mhv-n39抗原和mhv-n20抗原。
[0036]
三、胶体金制备
[0037]
1)将制备专用烧瓶用重铬酸钾洗液浸泡过夜，用自来水冲洗干净，去离子水润洗后再用0.22μm过滤去离子水润洗三次，备用；其它玻璃器皿也都需清洁干净后再用0.22μm过滤去离子水润洗；
[0038]
2)取一定量去离子水加入1％体积的1％氯金酸(用前0.22μm过滤)溶液到专用烧瓶中；装上搅拌器和冷凝管；
[0039]
3)打开冷凝水和油域加热套，同时缓慢搅拌，加热至90℃；
[0040]
4)5min后按照1％柠檬酸钠：氯金酸＝1.8：100的比例，一次性迅速加入相应量的1％柠檬酸钠溶液，同时加快搅拌速度至300rpm，30秒后降低搅拌速度至100rpm，再保持20min后关闭加热装置，水浴冷却；
[0041]
5)分别在520nm、525nm、530nm测定其od值，最大吸收峰应为525nm，且od应在1.00-0.95之间；否则，弃用。
[0042]
四、抗原标记
[0043]
1)用0.1m k2co调节胶体金溶液的ph至7.2；
[0044]
2)按照10μg/ml浓度，计算标记所需mhv-n39抗原量，然后将mhv-n39抗原用去离子水稀释至0.5mg/ml，搅拌下缓慢滴加入空白胶体金，室温保持搅拌20min；
[0045]
3)搅拌下同样缓慢滴加入10％的bsa，使其bsa终浓度为1％，保持搅拌20min后再室温静置1小时；
[0046]
4)4℃下，12000rpm离心45min，去上清液；沉淀用0.01m ph7.2pb复溶至原1/40体积；
[0047]
5)4℃下，1500rpm离心10min，去沉淀后，完成标记。
[0048]
五、胶体金垫制备
[0049]
1)用0.01m ph7.2pb将胶体金复合物稀释到批量生产指定浓度；加入50％海藻糖(用前0.22μm过滤)，使其终浓度达到25％；
[0050]
2)将玻纤用5mm ph7.2pb(含0.2％酪蛋白和0.3％tween-20)浸泡2小时，后自然凉干备用；
[0051]
3)将金标液加入biodit相应样品瓶；打开biodot仪和氮气瓶阀门，将玻璃纤维平铺于膜板上，开始喷涂；
[0052]
4)喷涂完毕，玻纤在相对湿度40％以下，室温凉干(8小时以上)；用专用裁刀裁去胶体金垫边缘至指定规格后，完成制备。
[0053]
六、喷膜
[0054]
用0.01m ph7.2pbs分别将兔抗小鼠igm二抗稀释至1毫克每毫升，将mhv-n20抗原稀释至0.7mg/ml,将抗trx单抗稀释至1.5mg/ml,10000rpm离心5min，去沉淀，同时加入叠氮钠；将合格硝酸纤维素膜14裁切成300mm长，正面朝上平铺于膜板上，用磁条压定，开始画膜；在硝酸纤维素膜14的相应位置进行标注，正面朝上，相对湿度35％以下，室温干燥2小时后，于干燥器中密封保存。
[0055]
八、纸条组装
[0056]
首先，揭去pvc板上硝酸纤维素膜14粘贴位置的封胶纸，使其胶面暴露出来，将硝
酸纤维素膜14正面向上，端正、平整的贴于pvc板的标定位置；揭去pvc板上胶体金复合物垫粘贴位置的封胶纸，将裁切好的胶体金复合物垫一端对齐pvc板，贴于标定位置，用手轻压，使其粘和完全；将裁切好的样品垫贴于pvc板的标定位置，用手轻压，使其粘和完全；揭去pvc板上吸水垫粘贴位置的封胶纸，将吸水垫裁切为2cm宽，贴于pvc板的标定位置，用手轻压，使其粘和完全，完成装裱。然后，将pvc板正面朝上送入切条机裁切成4mm宽纸条后装入塑料卡盒内密封干燥保存。
[0057]
使用方法如下：
[0058]
1)采血0.5-1ml，3000转/分，离心3-5分钟分离血清；也可4℃静置过夜，使血清自然析出；或采用全血直接检测；
[0059]
2)取出检测卡(若冷藏保存，需恢复至室温再打开包装)，开封后平放于桌面上；
[0060]
3)取10μl(毛细管黑色刻度处)血清或全血加入加样孔，然后立刻用装有缓冲稀释液的滴瓶滴加两滴缓冲稀释液；
[0061]
4)这时会看见有酒红色的液体流过观察窗；等待10-15分钟判断结果，15分钟后的结果无效。
[0062]
结果判定如下：
[0063]
1)阴性：如图4-a所示，只有对照线143(c线)显示酒红色的反应；
[0064]
2)igm阳性：如图4-b所示，检测带一141(t1线)与对照线143(c线)同时显示酒红色的反应；
[0065]
3)igg阳性：如图4-c所示，检测带二142(t2线)与对照线143(c线)同时显示酒红色的反应；
[0066]
4)igm、igg同时阳性：如图4-d所示，检测带一141(t1线)、检测带二142(t2线)与对照线143(c线)同时显示酒红色的反应；
[0067]
3)失效：在观察孔内，如图4-e所示，对照线区(c)和检测线区(t)都不出现色线；如图4-e所示，或仅检测线区(t)出现色线。
[0068]
本发明要解决的技术问题是快速的检测血液样品中是否含有小鼠血清中鼠肝炎病毒染抗体，从而提供一种简便、快速、科学诊断鼠肝炎病毒感染的方法。本发明采用表达mhv病毒n基因上一段约20kd的蛋白作为检测抗原；此抗原的氨基酸序列，与已知的mhv1、mhv2[mhv(pr)]、mhv3、mhv4(jhm)、a59、mhvs、mhvz和mhvu各种毒株比较，都高度同源(＞99％)，保证了检测试剂广泛的适用性；同时igm与igg的分型联检设计，可有效识别急性感染。
[0069]
该快速检测小鼠血清中鼠肝炎病毒染抗体的试剂盒，能在不需要其他仪器设备的情况下，15分钟内检测出小鼠血清中的mhv抗体，并且有效区分igm抗体和igg抗体；解决了目前没有一个快速、简单且有效检测小鼠肝炎病毒感染的方法，为各实验动物单位提供了简便、有效的工具，其意义深远，同时又市场价值巨大。
[0070]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。