一种分析CD303+树突状细胞亚群表型和功能的方法及试剂盒与流程

一种分析cd303

树突状细胞亚群表型和功能的方法及试剂盒
技术领域
1.本技术属于生物技术领域，具体涉及用流式细胞光度术进行免疫检测分析人外周血树突状细胞，尤其涉及一种用于临床免疫检测分析cd303

树突状细胞亚群表型和功能的试剂盒及应用。


背景技术：

2.树突状细胞(dendritic cell，dc)作为体内免疫系统中起主要调控作用的细胞，是免疫学研究热点之一。目前，树突状细胞的检测主要依靠流式细胞分析技术，但测定树突状细胞的分析方案多种多样，没有统一的标准模式。这主要是由于树突状细胞的研究日新月异，多个不同的树突状细胞亚型已被报导发现；而针对树突状细胞的流式细胞分析方案未免粗放，已不能满足目前临床针对不同亚型的树突状细胞的精确分析要求。
3.流式细胞仪(flow cytometry)是对细胞进行自动分析和分选的装置，主要由四部分组成，包括流动室和液流系统、激光源和光学系统、光电管和检测系统以及计算机和分析系统。流式细胞仪可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞仪是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标。
4.流式细胞仪可同时进行多参数测量，信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。其常用的技术指标有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度、可分析测量参数等。
5.未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信号对不经染色活细胞进行分析和分选。在实际使用中，仪器首先要对光散射信号进行测量。当光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞。光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。荧光信号主要包括两部分：
①
自发荧光，即不经荧光染色，细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；
②
特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。
6.在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例如核黄素、细胞色素等)的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：
①
尽量选用较亮的荧光染料；
②
选用适宜的激光和滤片光学系统；
③
采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。
7.cd303

树突状细胞分布于人外周血中，是近年来新发现的一个树突状细胞亚群。临床和基础研究表明，cd303

树突状细胞亚群在多种疾病的发生中起重要作用，例如某些恶性肿瘤如肺癌，黑色素瘤，前列腺癌和肾癌，皮炎，某些病毒感染如hiv-1感染，某些传染
病如疟疾感染以及一些自身免疫病如类风湿关节炎等；在这些疾病中，cd303

树突状细胞都显现出表型和功能的异常。因此，cd303

树突状细胞的表型和功能测定临床数据可成为临床医生判断上述疾病发展状况和临床治疗效果的辅助判断指标之一，具有十分重要的临床诊断意义。
8.通过流式细胞仪鉴定树突状细胞亚群通常需要分离提取外周血单核细胞，该过程复杂繁琐，时间周期长，若通过细胞分子表面抗原检测的方式分析细胞亚群则通常选择大量树突状细胞表面抗原分子进行检测，提高检测的准确性和特异性，但大量表面抗原的检测分析需要较长时间并提高了检测的经济成本，不利于快速高效地进行树突状细胞亚群分析研究。
9.cn105911292a公开了一种用于组合分析cd11c

cd11b

树突状细胞亚群及其分化程度和功能的试剂盒，包含以下8种抗体：cd11c、cd80、cd86、cd11b、hla-dr、il-12、il-23和il-27。该发明还提供了一种用于组合分析cd11c

cd11b

树突状细胞亚群及其分化程度和功能的方法，可一次性地检测cd11c

cd11b

树突状细胞亚群及其分化程度和功能的全套数据。但树突状细胞的形态、免疫功能不尽相同，其表面抗原分子数量众多，针对不同树突状细胞亚群需要选择不同的特异性检测分子。例如，研究表明cd11c

cd11b

dc亚群的功能与cd303

dc亚群的功能完全不同，并且在不同的疾病中起用。因此，上述cd11c

cd11b

dc亚群检测试剂盒不能满足研究cd303

dc亚群的需要。
10.有鉴于此，研发提供一种用于鉴定cd303

树突状细胞亚群表型和功能的免疫检测试剂盒具有重要意义。


技术实现要素：

11.本技术提供了一种用于分析cd303

树突状细胞(cd303

dc)亚群表型和功能的试剂盒及其应用。所述方法中使用的针对cd303

dc亚群的抗体组合配方设计，可高效快速地分析外周血中cd303

dc亚群表型及其功能，保证准确率的同时也可降低因检测大量表面抗原分子导致的成本，简单易行，准确度高。
12.第一方面，本技术提供一种用于分析cd303

树突状细胞亚群表型和功能的抗体组合配方，所述分子组合配方包括：cd303抗体、cd205抗体、cd103抗体、il-12抗体和tgf-β抗体。
13.由于人外周血中树突状细胞亚群种类较多，表型和功能各不相同，为了全方位的了解不同的树突状细胞，研究人员需要将各个亚型分别列出并逐一加以研究，该过程会耗费大量的人力物力。本技术中，通过选择5个分子的特异性抗体，即cd303、cd205、cd103、il-12和tgf-β的特异性抗体，该抗体组合配方针对已被报道的人外周血cd303 树突状细胞亚群，还加入功能相关性细胞因子(il-12和tgf-β)的抗体，可以高特异性和高灵敏度检测cd303

dc亚群，分析细胞功能，为相关科学研究奠定基础。
14.第二方面，本技术提供一种抗体组合配方在分析和/或制备分析cd303

树突状细胞亚群表型和功能的产品中的应用。
15.所述抗体组合配方能够用于分析cd303

树突状细胞亚群表型和功能；所述抗体组合配方能够用于制备分析cd303

树突状细胞亚群表型和功能的产品。
16.优选地，所述产品包括试剂盒和/或检测试剂。
17.本技术所述的抗体组合配方能够用于分析cd303

树突状细胞亚群表型和功能，在鉴定cd303

树突状细胞亚群表型的同时，还能对其进行功能分析，所得产品如试剂盒可以根据少量的样本(包括健康人血液样本)获取树突状细胞的全方位信息，为细胞亚型鉴定、药物研发以及疾病的预防等领域提供了方便快速的检测手段。
18.第三方面，本技术还提供一种分析cd303

树突状细胞亚群表型和功能的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的抗体组合配方；且所述抗体组合配方由五种不同的荧光色素标记。
19.优选地，所述荧光色素标记选自bv421、bv711、percp-cy5.5、pacific blue、pe-cf594、fitc、pe-cy7、amcyan、apc-cy7或q-dot中的任意五种，优选为bv421、bv711、percp-cy5.5、pacific blue和pe-cf594。
20.本技术所述试剂盒包括cd303、cd205、cd103、il-12和tgf-β的抗体，所述抗体由5种不同的荧光色素标记。
21.目前市场上出售的关于树突状细胞测试的试剂盒只能笼统地分析总体树突状细胞的数据，且不包括功能分析。本技术的cd303

dc表型及功能分析试剂盒和方法针对新近已被报道的人外周血cd303

树突状细胞亚群，加入功能相关性细胞因子(il-12和tgf-β)，可以精细地提供人外周血已被报道的最新的cd303

dc亚群及其功能的全套数据。
22.第四方面，本技术提供一种鉴定cd303

树突状细胞亚群表型和功能的方法，所述方法采用如第一方面所述的抗体组合配方或如第三方面所述的试剂盒进行检测，所述方法包括：
23.将待测细胞与不同荧光色素标记的cd205抗体、cd103抗体和cd303抗体混合，进行首次孵育，染色，固定；以及
24.将所得细胞进行透化处理，再与不同荧光色素标记的il-12抗体和tgf-β抗体混合，进行再次孵育。
25.作为本技术优选的技术方案，所述方法包括如下步骤：
26.(1)预处理外周血，分离得到树突状细胞后加入白细胞刺激因子；
27.(2)将步骤(1)得到的细胞染色，加入不同荧光色素标记的cd205抗体、cd103抗体和cd303抗体进行首次孵育，再次染色，而后将得到的细胞用福尔马林溶液固定；
28.(3)将步骤(2)所得的细胞重悬于细胞穿透液，离心后将沉淀的细胞再次重悬于细胞穿透液，加入不同荧光色素标记的il-12抗体和tgf-β抗体，进行再次孵育；
29.(4)将步骤(3)所得的细胞重悬于细胞穿透液中，离心后将沉淀细胞重悬于细胞染色液，用流式细胞仪进行分析检测，得到cd303

树突状细胞亚群表型和功能。
30.本技术所述的方法采用全血一步法测定人外周血树突状细胞亚群及其功能，较之先前用分离外周血单核细胞(pbmc)测定dc的繁琐步骤来说，要简便易行得多，节约大量人力、物力和财力。用传统的pbmc法分离树突状细胞，需要较大的采血量，通常几十毫升不等，消耗时间长，而本技术中，采用全血测定，只需患者一滴血(10～100μl)即可得到我们所需的全套信息，省却了分离pbmc的大量时间，做到简单，快速一步测定到位，适合临床大批量样品的测试。
31.优选地，步骤(1)所述外周血的体积为10～100μl，例如可以是10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl或100μl。
32.优选地，步骤(1)所述白细胞刺激因子的体积浓度为0.08～0.1％，例如可以是0.08％、0.082％、0.084％、0.085％、0.086％、0.088％或0.1％等。
33.优选地，步骤(2)所述首次孵育的时间为20～60min，例如可以是20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min等，优选为25～35min。
34.优选地，步骤(2)所述首次孵育的温度为16～28℃，例如可以是16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃或28℃等。
35.优选地，步骤(2)所述福尔马林溶液的质量分数为2～4％，例如可以是2％、2.2％、2.4％、2.5％、2.6％、2.8％、3％、3.2％、3.5％、3.6％、3.8％或4％等。
36.优选地，步骤(3)所述再次孵育的条件为4℃避光孵育10～15h(例如10h、11h、12h、13h、14h或15h等)或16～28℃(例如16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、25℃或28℃等)避光孵育20～40min(例如20min、22min、25min、28min、30min、35min、38min或40min等)。
37.优选地，通过cd303抗体得到cd303分子的表达情况，分析树突状细胞亚群表型cd303

的比例；
38.通过cd103抗体和cd205抗体得到cd103分子和cd205分子的表达情况，分析cd303

树突状细胞亚群的分化成熟状况；
39.通过il-12抗体和tgf-β抗体得到il-12分子和tgf-β分子的分泌表达情况，分析cd303

树突状细胞亚群的功能。
40.作为本技术的优选技术方案，所述方法具体包括如下步骤：
41.(1)取10～100μl外周血进行抗凝处理，外周血全血混合红细胞裂解液中，旋转震荡后，静置10～15min，离心弃上清，将沉淀细胞重悬于细胞染色液中，按照体积浓度0.08-0.1％加入白细胞刺激因子，并在30～37℃下孵育4～6h；
42.(2)将步骤(1)得到的细胞与不同荧光色素标记的cd103、cd205和cd303抗体混合进行孵育，16～28℃下孵育25～35min，再次染色，将得到的细胞用质量分数为2～4％的福尔马林溶液固定，16～28℃下避光孵育15～20min；
43.(3)将步骤(2)所得的细胞重悬于细胞穿透液中，离心弃上清，将沉淀的细胞重悬于细胞穿透液，加入不同荧光色素标记的il-12和tgf-β抗体，在4℃避光条件下孵育10～15h；
44.(4)将步骤(3)孵育好的细胞重悬于细胞穿透液，离心去上清，将沉淀细胞重悬于细胞染色液，用流式细胞仪进行分析检测；
45.其中，分析检测包括：
46.通过cd303抗体得到cd303分子的表达情况，分析树突状细胞亚群表型cd303

的比例；
47.通过cd103抗体和cd205抗体得到cd103分子和cd205分子的表达情况，分析cd303

树突状细胞亚群的分化成熟状况；和
48.通过il-12抗体和tgf-β抗体得到il-12分子和tgf-β分子的分泌表达情况，分析cd303

树突状细胞亚群的功能。
49.第五申请，本技术还提供一种如第三方面所述的试剂盒或如第四方面所述的方法在鉴定cd303

树突状细胞亚群和/或分析cd303

树突状细胞功能中的应用，所述应用为非疾病的诊断和治疗目的的应用。
50.本技术所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
51.与现有技术相比，本技术的有益效果为：
52.(1)信息全面：市场上出售的关于树突状细胞测试的试剂盒只能笼统地分析总体树突状细胞的数据，且不包括功能分析，本技术设计的cd303

树突状细胞表型及功能分析方案针对新近已被报道的人外周血cd303

树突状细胞亚群，并加入功能相关性细胞因子(il-12和tgf-β)，能够一次性测定cd303

树突状细胞表型及其功能；
53.(2)快速简便易行且准确度高：本技术中，采用人体全血一步法测定人外周血树突状细胞亚群及其功能，相较于使用分离pbmc法测定dc，所述方法简便易行得多，节约大量人力、物力和财力。用传统的pbmc法分离dc，需要较大的采血量，消耗时间长，而采用全血测定，只需10-100μl的血量即可得到所需的全套信息，省却了分离pbmc的时间，做到简单、快速一步测定到位，适合临床大批量样品的测试；同时，本技术所述的分析方案建立在流式细胞仪分析技术的基础之上，所得结果更加准确可靠，且灵敏度高，准确性好。
附图说明
54.图1为健康人与非小细胞肺癌病人外周血cd303

dc亚群中cd205和cd103表达量的检测结果图。
55.图2为健康人与非小细胞肺癌病人外周血cd303

dc亚群中cd205

和cd103

的表达量对比图，其中i图为cd205

表达量，ii图为cd103

表达量。
56.图3为健康人与非小细胞肺癌病人cd303

dc il-12表达量的检测结果图。
57.图4为健康人与非小细胞肺癌病人外周血cd303

dc中il-12

的表达量对比图。
58.图5为健康人与非小细胞肺癌病人cd303

dc tgf-β表达量的检测结果图。
59.图6为健康人与非小细胞肺癌病人外周血cd303

dc中tgf-β

的表达量对比图。
具体实施方式
60.下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本技术的技术方案，但下述的实例仅仅是本技术的简易例子，并不代表或限制本技术的权利保护范围，本技术的保护范围以权利要求书为准。
61.以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
62.实施例1
63.本实施例提供一种鉴定cd303 树突状细胞亚群表型和功能的试剂盒。
64.所述试剂盒包括：cd303抗体、cd205抗体、cd103抗体、il-12抗体和tgf-β抗体；所述试剂盒还包括：红细胞裂解液、细胞染色液、细胞固定液、细胞穿透液。
65.其中，所述cd303抗体采用bv421进行标记，cd205抗体采用bv711、cd103抗体采用percp-cy5.5进行标记，il-12抗体采用pacific blue进行标记，tgf-β抗体采用pe-cf594进行标记。
66.需要注意的是，本技术中所述抗体与荧光标记的组合并不是固定的，其余组合也
适用，只需cd303抗体、cd205抗体、cd103抗体、il-12抗体和tgf-β抗体采取五种不同的荧光色素进行标记即可。
67.实施例2
68.本实施例提供一种鉴定cd303

树突状细胞亚群表型和功能的方法。
69.(1)人外周血的预处理
70.取人静脉外周血各1滴，并进行抗凝处理，再将外周血全血混合于2ml 1
×
红细胞裂解液(biolegend)中，旋转震荡10s后，室温(25℃)避光静置15min；
71.用离心机离心(350g，5min)，倾倒上清液，然后将沉淀细胞悬浮于2ml细胞染色液(含体积分数为2.5％胎牛血清的pbs溶液)中；
72.以体积浓度0.1％的比例加入白细胞刺激因子(bd)，在37℃恒温条件下孵育细胞6小时；
73.(2)首次孵育
74.血细胞离心(350g，5min)，倾倒上清液后，将血细胞悬浮于100μl细胞染色液中；
75.加入2μl抗人cd303抗体、cd103抗体(biolegend)和cd205抗体(bd)，室温孵育30min；
76.加2ml细胞染色液，重复离心(350g，5min)两次，倾倒上清液后，用2ml 2％福尔马林溶液固定细胞，室温(25℃)避光孵育20min；
77.(3)再次孵育
78.将固定好的细胞悬浮于2ml细胞穿透液(biolegend)中，重复离心(350g，10min)两次；
79.将离心后的沉淀细胞重新悬浮于100μl细胞穿透液中，各加2μl il-12抗体(biolegend)和tgf-β抗体(bd)，室温(25℃)避光孵育30min；
80.孵育好的细胞悬浮于2ml细胞穿透液中，重复离心(350g，5min)两次，倾倒上清液，将沉淀细胞重新悬浮于0.5ml细胞染色液中，用流式细胞仪(cytek)分析测试。
81.实施例3
82.本实施例采用实施例2提供的方法对非小细胞肺癌病人和健康成年人外周血中的cd303

树突状细胞进行表型鉴定和功能分析。
83.(1)人外周血cd303

树突状细胞(cd303

dc)亚群的分化程度分析：
84.采用流式细胞仪检测共信号刺激分子cd205和cd103在人外周血cd303

dc亚群上的表达情况(用％比表示)，评估人外周血cd303

dc亚群的分化成熟状况。
85.其中，健康人和非小细胞肺癌病人的cd303

dc中cd205和cd103的表达情况见图1和图2：
86.由图1可知，cd205、cd103在健康人cd303

dc上的表达比例分别为2.23％和4.93％，而cd205和cd103在非小细胞肺癌病人cd303

dc上的表达比例分别为7.96％和5.19％；
87.如图2所示，健康人的树突状细胞表面cd205表达量(均值)明显少于非小细胞肺癌病人(i图)，cd103表达量也少于非小细胞肺癌病人，但是差异并不显著(ii图)；
88.树突状细胞表面cd205和cd103共表达越高，则表明树突状细胞的免疫耐受度越高；上述结果表明，非小细胞肺癌病人体内的cd303

dc的免疫耐受程度显著高于健康人体
内的cd303

dc。
89.(2)人外周血cd303 树突状细胞功能分析
90.采用流式细胞仪检测细胞因子il-12和tgf-β在cd303

dc中的分泌表达情况(用百分比％表示)，分析人外周血cd303

dc的功能。
91.其中，健康人和非小细胞肺癌病人的cd303

dc中il-12和tgf-β的分泌表达情况见图3～图6：
92.由图3可知，il-12在健康人cd303

dc上的表达比例为4.31％，而il-12在非小细胞肺癌病人cd303

dc上的表达比例为26.4％；
93.il-12是一个促进免疫反应的细胞因子，若树突状细胞能分泌较多的il-12，表明树突状细胞能够通过分泌较多的il-12来促进免疫反应；上述结果显示，正常健康人cd303

dc分泌的il-12显著少于肺癌病人cd303 树突状细胞分泌的il-12(如图4)；
94.这表明非小细胞肺癌病人体内的cd303

dc通过分泌il-12来加强免疫反应的能力，这是提示非小细胞肺癌病人体内cd303

dc介导的免疫功能有异于健康人的一个标志。
95.由图5可知，tgf-β在健康人cd303

dc上的表达比例为6.18％，而tgf-β在非小细胞肺癌病人cd303

dc上的表达比例为23.4％，
96.而与此相反，tgf-β是一个能抑制免疫功能的细胞因子，dc如果分泌较多的tgf-β，表明dc具有免疫抑制功效，能够通过分泌较多的tgf-β来抑制免疫反应。上述实验证明，非小细胞肺癌病人体内的cd303

dc与正常健康人的cd303

dc分泌的tgf-β数量相比显著升高(如图6)。
97.这表明非小细胞肺癌病人体内的cd303

dc比健康人的cd303

dc通过分泌更多的tgf-β来抑制免疫功能，非小细胞肺癌病人体内的cd303

dc相较于健康人体内的cd303

dc是一种具有免疫抑制功能的树突状细胞，可能是通过调控tgf-β的分泌量来实现的。
98.综上所述，本技术的分子组合物以及鉴定方法可以有效鉴别外周血中的cd303

dc亚群，并分析其分化成熟情况以及功能，能够高效快速比较非小细胞肺癌病人与健康人外周血cd303

dc的发育分化差异以及功能差异。
99.总之，本方法采用人体全血一步法测定人外周血树突状细胞亚群及其功能，较传统的分离pbmc法简便易行得多，节约了大量人力、物力和财力，只需患者一滴血(10-100μl)即可得到所需的全套信息，省却了分离pbmc的大量时间，做到简单，快速一步测定到位，适合临床大批量样品的测试。
100.申请人声明，以上所述仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本技术的保护范围和公开范围之内。