一种用于减盐酱油中耐盐乳酸菌的检测方法与流程

1.本发明涉及一种用于减盐酱油中耐盐乳酸菌的检测方法，属于乳酸菌检测技术领域。


背景技术：

2.酱油是人们日常生活中常用的调味品，健康减盐是食品工业发展的必经之路，减盐酱油的市场也逐渐壮大。目前减盐酱油的盐分含量通常在12％左右，有些减盐酱油的盐含量甚至能够低到10％以下，由此也出现了一批在减盐酱油特定环境中存活繁殖的乳酸菌，例如典型代表菌株lactobacillus halophilus和loigolactobacillus rennini，该类微生物能够引起减盐酱油的酸败、产气，但是不会引起普通酱油(通常盐含量≥15％)的异常，目前针对该类微生物没有特别的检测方法。
3.cn101348826中提到了酱油等调味品中产气菌的检测方法，但是主要分析的微生物是一类芽孢菌，本发明所述的产气菌指能够引起减盐酱油(盐含量≤12％)胀气、渗漏的一类耐盐乳杆菌。cn108841914a中提到了一种用于调味品的检测方法及用于培养产气乳杆菌的培养基，但培养基中没有一定盐环境，且整体培养时间需要120
±
2h，培养时间较长。
4.现有的行业技术一般是以mrs培养基做为乳酸菌的检测方法，本发明研究人员在减盐酱油中发现了能够引起减盐酱油产气酸败的特殊乳酸菌，例如lactobacillus halophilus和loigolactobacillus rennini，该类乳酸菌在普通mrs平板上难以生长，在调味品的其他领域也未见对该类微生物的检测进行研究报道，因此，本发明针对该类微生物进行了检测方法的开发，为减盐酱油产品中该类微生物的检测和防治提供了基础。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术存在的不足，提供一种用于减盐酱油中耐盐乳酸菌的检测方法，所述检测方法可以实现减盐酱油中耐盐乳酸菌lactobacillus halophilus和loigolactobacillus rennini的检测，可以方便的检测减盐酱油中是否存在耐盐乳酸菌，减盐酱油样品是否存在涨瓶渗漏风险，能够控制和保证减盐酱油产品质量。
6.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于减盐酱油中耐盐乳酸菌的检测方法，所述的检测方法包括如下步骤：
7.(1)配制培养基：葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、氯化钠、产气促进因子、醋酸钠、吐温、硫酸镁、硫酸锰和水混合，并加入ph缓冲剂调整ph值在5.0-6.5，然后分装至10ml的试管中，加杜氏小导管，升温灭菌，得到培养基；
8.(2)待测样品采用无菌7.5％氯化钠盐水进行梯度稀释，接种1ml至上述培养基中后，然后制造厌氧环境，完成接种；
9.(3)将接种后的培养基放置在36
±
1℃下培养，观察，根据杜氏小导管中的产气量和试管中产气特征来确定是否含有耐盐乳杆菌。
10.优选的，按照重量份数计，所述葡萄糖10-30份，蛋白胨5-15份，牛肉膏5-15份，酵
母膏1-10份，氯化钠75-120份，产气促进因子2-10份，醋酸钠1-10份，吐温800.1-5份、硫酸镁0.1-5份、硫酸锰0.1-5份、ph缓冲剂2-10份，水800-1200份。
11.优选的，所述的产气促进因子为谷氨酸、精氨酸、亮氨酸和赖氨酸中的一种或几种组合。
12.优选的，所述的ph缓冲剂为磷酸氢二钾和柠檬酸二铵中的一种或两种组合。
13.优选的，步骤(1)中，所述升温灭菌的条件为：在120
±
2℃下灭菌15
±
5min。
14.优选的，步骤(2)中制造厌氧环境的方法为：在10ml的试管中滴加0.5-1ml无菌石蜡油进行封闭得到厌氧环境。
15.优选的，步骤(3)中，接种后的培养基在36
±
1℃下培养48
±
2h。
16.本发明的有益效果是：
17.1、本发明建立的减盐酱油中耐盐乳酸菌的检测方法，具有良好的特异性，所述检测方法与减盐酱油产品是否酸败胀气存在良好的相关性，可以方便的检测减盐酱油中是否存在耐盐乳酸菌，减盐酱油样品是否存在涨瓶渗漏风险，能够控制和保证减盐酱油产品质量；
18.2、本发明建立的减盐酱油中耐盐乳酸菌的检测方法，方法简单成本低，本发明的检测方法中使用的试剂、材料和设备均为微生物检测常规设备，可以在减盐酱油的生产过程中进行检测监控，便于该方法的推广和使用。
附图说明
19.图1为实施例中的试管和杜氏小导管的产气示意图；
20.图中，1石蜡层、2培养基、3杜氏小导管。
具体实施方式
21.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
22.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
23.实施例1：
24.以胀气的减盐酱油和正常成品减盐酱油分别作为阳性样品和阴性样品，进行实施案例的测试。
25.(1)配置培养基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、氯化钠100g、谷氨酸5g、醋酸钠5g、吐温80 1g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.1g、柠檬酸二铵5g、磷酸氢二钾2g，水1000g，调节ph值为6.0，以上培养基分装10ml/试管，加杜氏小导管，121℃，灭菌15min；
26.(2)样品采用无菌7.5％氯化钠盐水进行梯度稀释，接种1ml至上述培养基中后，滴加1ml无菌石蜡进行封闭，石蜡层制造厌氧环境。
27.(3)结果观察：接种后，放置在36℃下培养48h，在24h开始观察，48h完成报告最终
结果。
28.其中，表1按照本实施例检测方法中得到的结果，表2为以相同样品，采用gb4789.35-2016中，乳杆菌计数的检测方法得到的结果。结果表明，gb4789.35无法检测出该类微生物，采用本实施例的检测方法可以快速的检测出引起产气的微生物，避免假阴性。
29.表1采用本实施例方法检测结果
[0030][0031]
表2采用gb4789.35-2016检测结果
[0032]
样品24h48h72h结果判断胀气酱油(cfu/ml)＜1＜1＜1阴性正常酱油(cfu/ml)＜1＜1＜1阴性
[0033]
实施例2：
[0034]
以胀气的减盐酱油为阳性样品，进行实施案例的测试。
[0035]
1、采用本发明方法配置培养基a：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、氯化钠100g、谷氨酸3.5g、精氨酸2g、吐温80 0.1g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.1g、柠檬酸二铵5g、磷酸氢二钾2g，水1000g，调节ph值为6.0，以上培养基分装10ml/试管，加杜氏小导管，121℃，灭菌15min；
[0036]
2、对照培养基b：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、氯化钠100g，吐温80 0.1g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.1g，柠檬酸二铵5g、磷酸氢二钾2g，水1000g，调节ph值为6.0，以上培养基分装10ml/试管，加杜氏小导管，121℃，灭菌15min；
[0037]
3、样品采用无菌7.5％氯化钠盐水进行梯度稀释，接种1ml至上述培养基中后，滴加1ml无菌石蜡进行封闭，制造厌氧环境。
[0038]
4、结果观察：接种后，放置在36℃下培养48h，24h时开始观察，48h完成报告最终结果。
[0039]
表3中为本实施例中两种培养基的检测结果，表3数据表明：增加产气因子可以促进该类微生物生长及产气，提高检测限。
[0040]
表3实施例2中两种培养基的检测结果
[0041][0042]
实施例3：
[0043]
以胀气的减盐酱油为阳性样品，进行实施案例的测试。
[0044]
1、采用本发明方法配置培养基c：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、氯化钠100g、谷氨酸5g、吐温80 0.1g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.1g、柠檬酸二铵5g、磷酸氢二钾2g，水1000g，调节ph值为6.0，以上培养基分装10ml/试管，加杜氏小导管，121℃，灭菌15min；
[0045]
2、对照培养基d：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、氯化钠50g、谷氨酸5g、吐温80 0.1g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.1g，柠檬酸二铵5g、磷酸氢二钾2g，水1000g，调节ph值为6.0，以上培养基分装10ml/试管，加杜氏小导管，121℃，灭菌15min；
[0046]
3、对照培养基e：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、氯化钠150g、谷氨酸5g、、吐温80 0.1g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.1g，柠檬酸二铵5g、磷酸氢二钾2g，水1000g，调节ph值为6.0，以上培养基分装10ml/试管，加杜氏小导管，121℃，灭菌15min；
[0047]
4、样品采用无菌7.5％氯化钠盐水进行梯度稀释，接种1ml至上述培养基中后，滴加1ml无菌石蜡进行封闭，并制造厌氧环境。
[0048]
5、结果观察：接种后，放置在36℃下培养48h，在24h时开始观察，48h完成报告最终结果。
[0049]
表4中为本实施例中的几种培养基的检测结果，表明该类微生物的生长需要一定的盐浓度，太低或者太高均不适合其生长。
[0050]
表4实施例3中不同盐含量培养基检测结果
[0051][0052]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0053]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。