一种桂龙药膏的质量控制方法与流程

一种桂龙药膏的质量控制方法
【技术领域】
1.本发明涉及药物质量检测技术领域，具体涉及一种桂龙药膏的质量控制方法。


背景技术：

2.桂龙药膏，从人体的疾病本源，从肝、心、脾、肺、肾五脏角度进行调理，气血双补，温肾养肾，清除血液垃圾，通经活络。桂龙药膏收载于部颁标准中药成方制剂第八册 ws3-b-1599-93及国家食品药品监督管理总局标准ybz22432005；具有祛风除湿，舒筋活络，温肾补血之功效。用于风湿骨痛、慢性腰腿痛，肾阳不足及气血亏虚引起的贫血，失眠多梦，气短，心悸，多汗，厌食、腹胀，尿频等症。
3.桂龙药膏，其组方为：肉桂叶300g、土茯苓30g、红药100g、过岗龙100g、红杜仲53g、玉郎伞10g、土生地10g、三爪龙60g、白芷2g、老鸦嘴13g、千斤拔20g、砂仁2g、黄精5g、牛大力80g、高山龙375g、川芎2g、大芦45g、土甘草10000g、青藤45g、五爪龙60g、万筋藤10g、首乌藤150g、当归藤165g、四方藤55g、温姜75g、狮子尾30g、九牛力30g、黑老虎根165g。其中的红药、红杜仲、高山龙、玉郎伞有温肾、养肾、增加心肌血流量、改善心脑供血供氧，増强骨密度等功效。28味药材是经过多道工序提炼浓缩成半流体口服膏剂， 100克浓缩膏体相当于总药材的545克。药膏膏体分子量小，吸收好，可随血液循环到达骨髓，清除骨髓湿毒，清除血管血液垃圾和骨髓湿毒，修复受损的细胞神经元。
4.目前，桂龙药膏的原料处理方法是分取各味中药材，依中国药典2020年版一部炮制加工成普通中药饮片，然后置于提取罐提取后制备。但是，桂龙药膏质量标准中并没有鉴别及含量测定项，这样的原料处理方法，无法保证原料的质量，亟需制定确实可行的质量标准方法以保证产品质量和临床疗效。目前尚无对本品质量检测的相关文献及报道。


技术实现要素：

5.针对目前桂龙药膏的质量标准中并没有鉴别及含量测定项，现有原料处理方法无法保证原料的质量的问题，本发明提供了一种桂龙药膏的质量控制方法，是一种准确、快速、稳定的桂龙药膏的质量控制方法，能更好的控制该中药制剂的质量，保证用药的安全性，指导产品生产过程的质量控制更加合理。
6.本发明的目的通过以下技术方案实现：
7.一种桂龙药膏的质量控制方法，包括如下步骤：
8.1)采用肉桂叶对照药材、香豆素对照品、土甘草对照药材、首乌藤对照药材、大黄素对照品，以薄层色谱法分别对肉桂叶、土甘草、首乌藤，进行鉴别；
9.2)采用高效液相色谱法对桂龙药膏中肉桂酸含量进行测定，具体包括如下步骤：
10.色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％磷酸 (28:72)为流动相；检测波长为274nm；理论板数按肉桂酸峰计算应不低于5000；
11.对照品溶液的制备：取肉桂酸对照品适量，置棕色瓶中，精密称定，加甲醇制成每1ml 含10μg的溶液，即得；
12.供试品溶液的制备：精密称取样品约3g，加水5ml，搅拌使溶解，通过d101大孔树脂柱，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用10％甲醇100ml洗脱，弃去洗脱液，最后用甲醇100ml 洗脱，收集洗脱液，浓缩至约2ml，用50％甲醇转移至10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；
13.测定：分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
14.本发明中：
15.步骤1)所述的以薄层色谱法对肉桂叶进行鉴别，具体包括如下步骤：取本品10g，加水 5ml，摇匀，加乙酸乙酯40ml，超声处理30min，分取乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml 使溶解，作为供试品溶液；取肉桂叶对照药材1g，加水50ml，摇匀，煎煮30分钟，滤过，滤液浓缩至10ml，加乙酸乙酯40ml，超声处理30min，同法制成对照药材溶液；另取香豆素对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典 2020年版四部附录0502)试验，吸取供试品溶液10μl，对照药材溶液5μl和对照品溶液5 μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60-90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(10:1:4) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷10％氢氧化钾甲醇溶液，置紫外灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
16.步骤1)所述的以薄层色谱法对土甘草进行鉴别，具体包括如下步骤：取本品10g，加水饱和的正丁醇30ml，摇匀，超声处理30min，分取正丁醇液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取土甘草对照药材 0.5g，加水饱和的正丁醇30ml，摇匀，超声处理30min，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版四部附录0502)试验，吸取供试品溶液10μl，对照药材溶液3μ l，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(12:10:1.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
17.步骤1)所述的以薄层色谱法对首乌藤进行鉴别，具体包括如下步骤：取本品10g，加 30％乙醇-盐酸(10:1)20ml搅匀使之溶散，加三氯甲烷40ml，加热回流1小时，立即冷却，分取三氯甲烷层，蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；取首乌藤对照药材 2g，加水100ml，煎煮1小时，滤过，滤液浓缩至20ml，加30％乙醇-盐酸(10:1)20ml，同法制成对照药材溶液；另取大黄素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2020年版四部附录0502)试验，吸取供试品溶液10μl，对照药材溶液5μl和对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯
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甲酸(12:3:0.15)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上显橙黄色的荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。
18.步骤2)所述的d101大孔树脂柱，内径为1.5cm，柱高为12cm。
19.和现有技术相比，本发明具有如下优点：
20.1、本发明所述的一种桂龙药膏的质量控制方法，采用薄层色谱法对原料肉桂叶、土甘草、首乌藤进行鉴别，能更好的控制桂龙药膏产品质量，薄层色谱方法具有专属性强、重复性及稳定性好等特点，提高制剂质量的可控性，对其进行全面科学化控制，使标准规范
化，质量标准化。
21.2、本发明所述的一种桂龙药膏的质量控制方法，采用高效液相色谱法对桂龙药膏中肉桂酸含量进行测定，能更好的控制桂龙药膏制剂产品质量，本方法具有专属性强，精确度、灵敏度高，快速、稳定等特点，能够全面的反应和控制桂龙药膏的质量，是一种效果很好的生产质量控制方法。
【附图说明】
22.图1是本发明实施例(3批次样品)的肉桂叶薄层色谱图；
23.图2是本发明实施例(7批次样品)的肉桂叶薄层色谱图；
24.图3是本发明实施例(3批次样品)的土甘草薄层色谱图；
25.图4是本发明实施例(7批次样品)的土甘草薄层色谱图；
26.图5是本发明实施例(3批次样品)的首乌藤薄层色谱图(图5a是365nm荧光检视图；5b是氨熏后日光检视)；
27.图6是本发明实施例(7批次样品)的首乌藤薄层色谱图(图6a是365nm荧光检视图；6b是氨熏后日光检视)；
28.图7是本发明实施例的肉桂酸光谱扫描曲线图；
29.图8是本发明实施例的肉桂酸标准曲线图；
30.图9是本发明实施例的桂龙药膏的溶剂的hplc的图；
31.图10是本发明实施例的桂龙药膏的肉桂酸对照品的hplc的图；
32.图11是本发明实施例的桂龙药膏21060502样品的hplc的图；
33.图12是本发明实施例的桂龙药膏的缺少肉桂叶阴性样的hplc的图；
34.图13是本发明实验例的牛大力薄层色谱图(图13a是365nm荧光检视图；图13b是喷 10％硫酸乙醇溶液后365nm荧光检视图；图13c是显色后105℃加热后日光检视图；图13d是加热后365nm荧光检视图)；
35.图14是本发明实验例的黑老虎根(方法一)薄层色谱图(图14a是365nm荧光检视图；图14b是10％磷钼酸乙醇溶液显色后日光检视图)；
36.图15是本发明实验例的黑老虎根(方法二)薄层色谱图(图15a是365nm荧光检视图；图15b是5％香草醛硫酸溶液显色后日光检视图)；
37.图16本发明实验例的首乌藤薄层色谱图(图16a是日光检视图；图16b是365nm荧光检视图；图16c是氨熏后日光检视)；
38.图17是本发明实验例的四方藤薄层色谱图(图17a是甲醇溶供试品；图17b是乙醚溶供试品)；
39.图18是本发明实验例的土甘草薄层色谱图(图18a是365nm荧光检视图、图18b是5％磷钼酸乙醇溶液显色日光检视图，展开剂：三氯甲烷-甲醇(20:0.5)；图18c是365nm荧光检视图、图18d是10％硫酸乙醇溶液显色日光检视图，展开剂：环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯 (12:10:0.15)；图18e图是365nm荧光检视图、18f是5％香草醛硫酸溶液显色后日光检视图，展开剂：环己烷-乙酸乙酯(2:1)；图18g三氯甲烷提取供试品、图18h水饱和正丁醇提取供试品，展开剂：环己烷-乙酸乙酯(4:1)；图18i是三氯甲烷提取供试品365nm荧光检视图；图18j是水饱和正丁醇提取供试品365nm荧光检视图)；
40.图19是本发明实验例的当归藤薄层色谱图(图19a是365nm荧光检视图；图19b是显色后日光检视图；图19c是显色后365nm荧光检视图)；
41.图20是本发明实验例的当归藤、肉桂叶薄层色谱图；
42.图21是本发明实验例的五爪龙薄层色谱图(图21a是365nm荧光检视图、图21b是10％硫酸乙醇溶液显色日光检视图，提取方法一，展开剂：石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(5:1)；图21c是365nm荧光检视图、图21d是10％硫酸乙醇溶液显色日光检视图，提取方法二，展开剂：正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(20:4:5:0.7)；图21e是10％氢氧化钾乙醇溶液显色后365nm荧光检视图，提取方法三，展开剂：环己烷-甲苯-乙酸乙酯(5:5:1.5))；
43.图22是本发明实验例的三爪龙薄层色谱图；
44.图23是本发明实验例的过岗龙薄层色谱图；
45.图24是本发明实验例的酚类成分检测薄层色谱图(图24a、图24c、图24e、图24g是 365nm荧光检视图；图24b、图24d、图24f、图24h置碘蒸气熏后日光检视图)；
46.图25是本发明实验例的香豆素类预试验薄层色谱图(显色后365nm检视图；图25a是展开剂：正己烷-乙酸乙酯(4:1)；图25b是展开剂：石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(10:1:4)；图25c是展开剂：甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5:4:1)；图25d是展开剂：石油醚 (60～90℃)-乙酸乙酯(5:1))；
47.图26是本发明实验例的桂龙药膏各药材香豆素类薄层色谱图(显色后365nm检视图；图 26a是3味药材色谱图；图26b是8味药材色谱图；图26c是9味药材色谱图)；
48.图27是本发明实验例的肉桂叶香豆素薄层色谱图；
49.图28是本发明实验例的白桦脂酸对照品的hplc的图；
50.图29是本发明实验例的白桦脂酸-土甘草药材的hplc的图；
51.图30是本发明实验例的白桦脂酸-桂龙药膏样品21060502的hplc的图；
52.图31是本发明实验例的落新妇苷对照品的hplc的图；
53.图32是本发明实验例的落新妇苷-桂龙药膏样品21060502的hplc的图；
54.图33是本发明实验例的五味子甲素对照品的hplc的图；
55.图34是本发明实验例的五味子甲素-桂龙药膏样品21060502的hplc的图；
56.图35是本发明实验例的刺桐碱对照品的hplc的图；
57.图36是本发明实验例的刺桐碱-桂龙药膏样品21060502的hplc的图；
58.图37是本发明实验例的芒柄花素对照品的hplc的图；
59.图38是本发明实验例的芒柄花素-桂龙药膏样品21060502的hplc的图；
60.图39是本发明实验例的芒柄花素-桂龙药膏缺牛大力阴性样品的hplc的图；
61.图40是本发明实验例的槲皮素对照品的hplc的图；
62.图41是本发明实验例的槲皮素-桂龙药膏样品21060502的hplc的图；
63.图42是本发明实验例的槲皮苷对照品双波长的hplc的图；
64.图43是本发明实验例的芦丁对照品双波长的hplc的图；
65.图44是本发明实验例的厚朴酚对照品双波长的hplc的图；
66.图45是本发明实验例的芦、槲、厚-桂龙药膏样品21060502(70％乙醇)双波长的hplc 的图；
67.图46是本发明实验例的芦、槲、厚-桂龙药膏样品21060502(95％乙醇)双波长的
hplc 的图；
68.图47是本发明实验例的岩白菜素对照品双波长的hplc的图；
69.图48是本发明实验例的岩白菜素-桂龙药膏样品21060502双波长的hplc的图；
70.图49是本发明实验例的岩白菜素-桂龙药膏缺四方藤阴性样品双波长的hplc的图；
71.图50是本发明实验例的二苯乙烯葡萄糖苷对照品的hplc的图；
72.图51是本发明实验例的二苯乙烯葡萄糖苷-桂龙药膏样品21060502的hplc的图；
73.图52是本发明实验例的二苯乙烯葡萄糖苷-桂龙药膏缺首乌藤阴性样品的hplc的图；
74.图53是本发明实验例的大黄素、大黄酚混合对照品(一)的hplc的图；
75.图54是本发明实验例的大黄素、大黄酚-桂龙药膏样品21060502(一)的hplc的图
76.图55是本发明实验例的大黄素、大黄酚混合对照品(二)的hplc的图；
77.图56是本发明实验例的大黄素、大黄酚-桂龙药膏样品21060502(二)的hplc的图；
78.图57是本发明实验例的大黄素、大黄酚-桂龙药膏缺首乌藤阴性样品(二)的hplc的图；
79.图58是本发明实验例的大黄素、大黄酚混合对照品(三)的hplc的图；
80.图59是本发明实验例的大黄素、大黄酚-桂龙药膏样品21060502(提取方法一)的hplc 的图；
81.图60是本发明实验例的大黄素、大黄酚-桂龙药膏缺首乌藤阴性样品(提取方法一)的 hplc的图；
82.图61是本发明实验例的大黄素、大黄酚-桂龙药膏样品21060502(提取方法二)的hplc 的图；
83.图62是本发明实验例的大黄素、大黄酚-桂龙药膏缺首乌藤阴性样品(提取方法二)的 hplc的图；
84.图63是本发明实验例的大黄素、大黄酚-桂龙药膏样品21060502(74:26)的hplc的图；
85.图64是本发明实验例的大黄素、大黄酚-桂龙药膏样品21060502(72:28)的hplc的图；
86.图65是本发明实验例的大黄素、大黄酚-土甘草药材提取膏的hplc的图；
87.图66是本发明实验例的大黄素、大黄酚-桂龙药膏缺土甘草药材阴性样品的hplc的图；
88.图67是本发明实验例的桂皮醛对照品的hplc的图；
89.图68是本发明实验例的桂皮醛-桂龙药膏样品21060502的hplc的图；
90.图69是本发明实验例的肉桂酸对照品(一)的hplc的图；
91.图70是本发明实验例的肉桂酸-桂龙药膏样品21060502(一)的hplc的图；
92.图71是本发明实验例的肉桂酸-桂龙药膏缺肉桂叶阴性样品(一)的hplc的图；
93.图72是本发明实验例的肉桂酸对照品(二)的hplc的图；
94.图73是本发明实验例的肉桂酸-桂龙药膏样品21060502(10％甲醇洗脱)的hplc的图；
95.图74是本发明实验例的肉桂酸-桂龙药膏样品21060502(20％甲醇洗脱)的hplc的图；
96.图75是本发明实验例的肉桂酸-桂龙药膏样品21060502(30％甲醇洗脱)的hplc的图。
【具体实施方式】
97.以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。
98.实施例1：
99.一种桂龙药膏的质量控制方法，包括如下步骤：
100.1)采用肉桂叶对照药材、香豆素对照品、土甘草对照药材、首乌藤对照药材、大黄素对照品，以薄层色谱法分别对肉桂叶、土甘草、首乌藤，进行鉴别；
101.所述的以薄层色谱法对肉桂叶进行鉴别，具体包括如下步骤：取本品10g，加水5ml，摇匀，加乙酸乙酯40ml，超声处理30min，分取乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；取肉桂叶对照药材1g，加水50ml，摇匀，煎煮30分钟，滤过，滤液浓缩至约10ml，加乙酸乙酯40ml，超声处理30min，同法制成对照药材溶液；另取香豆素对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2020年版四部附录0502)试验，吸取供试品溶液10μl，对照药材溶液5μl和对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60-90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(10:1:4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷10％氢氧化钾甲醇溶液，置紫外灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
102.所述的以薄层色谱法对土甘草进行鉴别，具体包括如下步骤：取本品10g，加水饱和的正丁醇30ml，摇匀，超声处理30min，分取正丁醇液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取土甘草对照药材0.5g，加水饱和的正丁醇30ml，摇匀，超声处理30min，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版四部附录0502)试验，吸取供试品溶液10μl，对照药材溶液3μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(12:10:1.5)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
103.所述的以薄层色谱法对首乌藤进行鉴别，具体包括如下步骤：取本品10g，加30％乙醇
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盐酸(10:1)20ml搅匀使之溶散，加三氯甲烷40ml，加热回流1小时，立即冷却，分取三氯甲烷层，蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液；取首乌藤对照药材2g，加水 100ml，煎煮1小时，滤过，滤液浓缩至20ml，加30％乙醇-盐酸(10:1)20ml，同法制成对照药材溶液；另取大黄素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2020年版四部附录0502)试验，吸取供试品溶液10μl，对照药材溶液5μl和对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸 (12:3:0.15)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上显橙黄色的荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。
104.2)采用高效液相色谱法对桂龙药膏中肉桂酸含量进行测定，具体包括如下步骤：
105.色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％
磷酸 (28:72)为流动相；检测波长为274nm；理论板数按肉桂酸峰计算应不低于5000；
106.对照品溶液的制备：取肉桂酸对照品适量，置棕色瓶中，精密称定，加甲醇制成每1ml 含10μg的溶液，即得；
107.供试品溶液的制备：精密称取样品约3g，加水5ml，搅拌使溶解，通过d101大孔树脂柱 (内径为1.5cm，柱高为12cm)，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用10％甲醇100ml洗脱，弃去洗脱液，最后用甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至约2ml，用50％甲醇转移至10ml 量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；
108.测定：分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
109.结果：
110.1薄层色谱鉴别
111.1.1仪器与试剂
112.1.1.1仪器
113.lc-2030岛津高效液相色谱仪(日本岛津)，紫外分光光度计，gr202电子天平，jj200电子天平，yoko-zs紫外线分析摄影仪，超声波清洗仪。
114.1.1.2试剂
115.首乌藤对照药材(120939-201908)，肉桂叶对照药材(121437-201201)，大黄素对照品 (110756-201913)，以上均由中国食品药品检定研究院提供，土甘草对照药材(广西药品检验所中药室检定)，香豆素对照品(产品编号：x-013，cas号91-64-5，规格20mg，含量＞ 98％，成都瑞芬思生物科技有限公司提供)，乙酸乙酯、磷酸、石油醚(60～90℃)、三氯甲烷、正丁醇、氢氧化钾、甲醇、乙醇、二氯甲烷、环己烷、硫酸、盐酸、甲酸、氨水均为分析纯。
116.1.1.3样品
117.桂龙药膏由广西邦琪药业集团有限公司生产，批号21060402、21060502、21060602、 210608、210609、21061002、210611、210618、210619、210620，规格：每瓶装202g。桂龙药膏缺肉桂叶药材阴性样品，缺首乌藤药材阴性样品，缺土甘草药材阴性样品由广西邦琪药业集团有限公司提供。
118.1.2方法与结果
119.1.2.1 tlc鉴别
120.1.2.1.1肉桂叶：
121.取本品10g，加水5ml，摇匀，加乙酸乙酯40ml，超声处理30min，分取乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取肉桂叶对照药材1g，加水50ml，摇匀，煎煮30分钟，滤过，滤液浓缩至约10ml，加乙酸乙酯40ml，超声处理30min，同法制成对照药材溶液。另取香豆素对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。按样品处方工艺制备缺肉桂叶的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。按《中国药典》2020年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及缺肉桂叶阴性样品溶液各10μl，对照药材溶液5μl和对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60～90℃)
‑ꢀ
三氯甲烷-乙酸乙酯(10:1:4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷10％氢氧化钾甲醇溶液，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，详见图1、图2：
122.(图1中：1.肉桂叶对照药材、2.香豆素对照品、3.桂龙药膏21060402、4.桂龙药膏 21060502、5.桂龙药膏21060602、6.缺肉桂叶阴性样品；
123.图2中：1.肉桂叶对照药材、2.香豆素对照品、3.桂龙药膏210608、4.桂龙药膏210609、 5.桂龙药膏21061002、6.桂龙药膏210611、7.桂龙药膏210618、8.桂龙药膏210619、9.桂龙药膏210620、10.缺肉桂叶阴性样品)。
124.试验研究中，提取方法曾按原标准提取试验，也试过：
①
加甲醇溶解，加乙酸乙酯超声，过中性氧化铝柱提取供试品的方法；
②
加水溶解，加乙酸乙酯超声，过中性氧化铝柱提取供试品的方法。以上2种方法斑点不清晰，大量实验比较后得到实施例的方法。展开剂试过：正己烷-乙酸乙酯(4:1)，结果以石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(10:1:4)更优。显色剂试过5％香草醛硫酸溶液，结果以10％氢氧化钾甲醇溶液为最佳。
125.1.2.1.2土甘草：
126.取本品10g，加水饱和的正丁醇30ml，摇匀，超声处理30min，分取正丁醇液，用正丁醇饱和的水30ml洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取土甘草对照药材0.5g，加水饱和的正丁醇30ml，超声处理30min，同法制成对照药材溶液。按样品处方工艺制备缺土甘草的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。按《中国药典》2020 年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及缺土甘草阴性样品溶液各10μl，对照药材溶液3μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(12:10:1.5) 为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰，详见图3、图4：
127.(图3中：1.缺土甘草阴性样品、2.土甘草对照药材、3.桂龙药膏21060402、4.桂龙药膏21060502、5.桂龙药膏21060602；
128.图4中：1.缺土甘草阴性样品、2.土甘草对照药材、3.桂龙药膏210608、4.桂龙药膏 210609、5.桂龙药膏21061002、6.桂龙药膏210611、7.桂龙药膏210618、8.桂龙药膏210619、 9.桂龙药膏210620)
129.试验研究中，提取方法曾按原标准提取试验，也试过：
①
加水饱和的正丁醇超声提取供试品的方法；
②
加乙醇超声，加水溶解，三氯甲烷萃取供试品的方法。以上2种方法斑点不清晰，大量实验比较后得到实施例的方法。展开剂试过：环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯(4:1:1)，结果以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(1.2:1.0:0.15)更优。显色剂的选择上，曾试验过10％硫酸乙醇溶液、5％磷钼酸乙醇溶液、5％香草醛硫酸溶液的显色效果，结果以不喷显色剂直接紫外灯(365nm)检视效果为最佳。
130.1.2.1.3首乌藤：
131.取本品10g，加30％乙醇-盐酸(10:1)20ml搅匀使之溶散，加三氯甲烷40ml，加热回流 1小时，立即冷却，分取三氯甲烷层，蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。另取首乌藤对照药材2g，加水100ml，煎煮1小时，滤过，滤液浓缩至20ml，加30％乙醇
‑ꢀ
盐酸(10:1)20ml，同法制成对照药材溶液。另取大黄素对照品适量，加甲醇制成每1ml含 0.5mg的溶液，作为对照品溶液。按样品处方工艺制备缺首乌藤的阴性样品，同法制成阴性对照溶液。按《中国药典》2020年版四部通则0502薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及缺首乌藤阴性样品溶液各10μl，对照药材溶液5μl和对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶g 薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12:3:0.15)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检
视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上显橙黄色的荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色。阴性对照无干扰，详见图5、图6：
132.(图5中：1.首乌藤对照药材、2.大黄素对照品、3.桂龙药膏21060402、4.桂龙药膏 21060502、5.桂龙药膏21060602、6.缺首乌藤阴性样品；
133.图6中：1.首乌藤对照药材、2.大黄素对照品、3.桂龙药膏210608、4.桂龙药膏210609 5.桂龙药膏21061002、6.桂龙药膏210611、7.桂龙药膏210618、8.桂龙药膏210619、9.桂龙药膏210620、10.缺首乌藤阴性样品)
134.试验研究中，提取方法曾按原标准提取试验，也试过：加20％硫酸乙醇溶解，三氯甲烷加热回流提取供试品的方法。以上方法斑点不清晰，大量实验比较后得到实施例的方法。展开剂试过：石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液，结果以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(12:3:0.15)更优。检视条件的选择上，结果置紫外光灯(365nm)下检视，主斑点分离度不好，但荧光斑点颜色可明显区分，再置氨蒸气中熏，日光下检视为效果更佳。
135.2含量测定
136.肉桂叶具有温中补阳，通经络，散寒止痛，化湿健脾的功效。方中起到祛湿理肺，提高脾胃运化能力，调肺润肺的作用。所以对其有效成分肉桂酸测定含量对控制本品质量具有一定意义。
137.并对此含量测定方法进行方法验证。验证结果表明，分离效果良好，方法线性、稳定性、重现性、回收率等方法学考察均符合定量测定的要求，因此采用高效液相色谱法测定本品中肉桂酸的含量，作为控制本品质量的指标。试验结果如下：
138.2.1仪器、试药与样品
139.仪器：日本岛津lc-2030高效液相色谱仪；十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(ods-hl c18 柱，4.6
×
250mm，5μm)；分析天平gr-202(北京都丰岛天平有限公司)。
140.试药：肉桂酸化学对照品，由中国食品药品检定研究院提供，批号：110786-201604，规格：50mg，供含量测定用，用前无需处理，按98.8％计。乙腈(天津四友；一级色谱纯)，水(自制双蒸水)，磷酸(分析纯)。
141.样品：桂龙药膏由广西邦琪药业集团有限公司生产，批号21060402、21060502、 21060602、210608、210609、21061002、210611、210618、210619、210620，规格：每瓶装 202g。桂龙药膏缺肉桂叶药材阴性样品由广西邦琪药业集团有限公司提供。
142.2.2方法与结果
143.2.2.1测定波长的选择
144.取肉桂酸对照品溶液适量，200nm～400nm测定吸光度，设定波长为274nm。见图7肉桂酸光谱扫描曲线图。
145.2.2.2方法
146.色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％磷酸 (28:72)为流动相，检测波长为274nm。理论板数按肉桂酸峰计算应不低于5000。
147.对照品溶液的制备取肉桂酸对照品适量，置棕色瓶中，精密称定，加甲醇制成每1ml 含10μg的溶液，即得。
148.供试品溶液的制备精密称取样品约3g，加水5ml，搅拌使溶解，通过d101大孔树脂柱 (内径为1.5cm，柱高为12cm)，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用10％甲醇100ml洗脱，弃
去洗脱液，最后用甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至约2ml，用50％甲醇转移至10ml 量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
149.阴性样品溶液的制备阴性样品溶液是按处方比例称取除肉桂叶(过岗龙、狮子尾、九牛力)外其余药味，按制法制成缺肉桂叶阴性样品，再取此阴性样品按供试品溶液的制备方法制备不含肉桂叶的阴性样品溶液。
150.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
151.本品每1g含肉桂叶以肉桂酸(c9h8o2)计，不得少于15μg。
152.2.2.3色谱条件与系统适用性试验
153.肉桂酸与其它组分达到基线分离，分离度r》1.5，理论板数按肉桂酸峰计算大于5000。阴性样品溶液色谱在相应位置无吸收峰，可见阴性无干扰。
154.表1专属性试验结果表
155.名称主峰保留时间分离度理论塔板数对照品溶液27.39——12375供试品溶液27.562.312264缺肉桂叶阴性溶液——————溶剂(甲醇、50％甲醇)——————
156.2.2.4线性关系考察
157.精密称取肉桂酸对照品约10mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取0.2ml、0.5ml、1.0ml、3.0ml、5.0ml、10ml，置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。按上述色谱条件分别进样10μl，测定，以肉桂酸峰面积积分y对肉桂酸进样量x(μg)进行回归分析，得回归方程：y＝9.509
×
106x-7.919
×
103，r＝1.0，肉桂酸进样量范围：0.0287073μg～1.4353664μg，详见图8及表2。
158.表2肉桂酸线性关系考察数据
[0159][0160]
2.2.5精密度试验
[0161]
取同一供试品溶液(批号：21060502)，连续测定5次，进样量为10μl。结果见表3。
[0162]
表3精密度试验结果表
[0163][0164]
2.2.6稳定性试验
[0165]
取供试品溶液(批号：21060502)，每隔一定时间测定一次，共考察24小时，供试品溶液至少在24小时内稳定。结果见表4。
[0166]
表4稳定性试验结果表
[0167][0168]
2.2.7重复性试验
[0169]
取同一样品(批号：21060502)，制备5份供试品溶液，测定。结果见表5。
[0170]
表5方法重复性试验结果表
[0171][0172]
2.2.8加样回收率试验
[0173]
对照品溶液贮备液的制备：。
[0174]
精密量取已测知含量的样品(批号21060502，肉桂酸含量54.9μg/g)1.5g，置烧杯中，再分别精密加入肉桂酸对照品溶液贮备液(145.28μg/ml)0.6ml，微加热至无醇味，加水5ml，搅拌使溶解，通过d101大孔树脂柱(内径为1.5cm柱高为12cm)，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用10％甲醇100ml洗脱，弃去洗脱液，最后用甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至约2ml，用50％甲醇转移至10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
[0175]
表6加样回收率试验结果表
[0176][0177]
2.2.9测定十批样品中肉桂酸的含量
[0178]
表7十批样品肉桂酸测定结果表
[0179]
样品批号含量(μg/g)平均含量rsd％2106040252.9 53.753.30.792106050255.2 54.354.70.852106060259.1 59.259.10.0621060816.3 16.516.40.6321060917.0 16.917.00.352106100220.5 20.320.40.5221061121.4 21.721.50.5521061832.5 32.832.70.52
21061934.8 34.534.70.3521062040.4 39.840.10.85
[0180]
实验结果表明，不同产地的肉桂叶中肉桂酸含量存在差异。以上十批次样品中含量最低16.4μg/g，最高59.1μg/g，范围相差大，以最低限度暂定本品每1g含肉桂叶以肉桂酸 (c9h8o2)计，不得少于15μg。
[0181]
2.3肉桂叶中肉桂酸含量测定
[0182]
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每1g含肉桂叶以肉桂酸(c9h8o2)计，不得少于30ug。
[0183]
表8：桂龙药膏样品中肉桂酸含量测定结果表
[0184][0185]
实验例1：桂龙药膏鉴别研究试验的筛选过程
[0186]
1、牛大力
[0187]
样品制备：取
①
桂龙药膏20g，
②
桂龙药膏20g加硅藻土10g，
③
桂龙药膏缺牛大力阴性 20g，
④
牛大力药材2g，分别加浓氨试液1ml及三氯甲烷50ml，超声处理1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，即得。
[0188]
硅胶g板，环己烷-乙酸乙酯(20:3)
[0189]
检视：放置2小时后置365nm下检视；再喷10％硫酸乙醇溶液晾干后置365nm下检视，最后105℃加热至斑点显色清晰，分别日光及365nm荧光下检视。结论：供试样与药材相对应的斑点位置上，缺牛大力阴性对照有干扰，详见图13(图13中：1.桂龙药膏样品21060502、 2.桂龙药膏样品210618、3.牛大力对照药材、4.缺牛大力阴性样品)。
[0190]
2、黑老虎根
[0191]
2.1方法一
[0192]
样品制备：取桂龙药膏20g，桂龙药膏缺黑老虎根阴性样品20g，黑老虎根药材2g，分别加入甲醇50ml，超声处理60分钟，滤过，滤液加石油醚(60～90℃)30ml振摇提取，分取下层溶液，浓缩至2ml，即得。
[0193]
硅胶g板，三氯甲烷-乙酸乙酯-乙酸(20:1:0.1)
[0194]
结果：365nm下检视，供试品与对照药材相应位置上有一个亮蓝色荧光斑点，缺黑老虎阴性有干扰；喷以10％磷钼酸乙醇溶液，于105℃加热数分钟后，至日光下检视，药材斑点模糊，且供试品无相对应斑点，详见图14。
[0195]
(图14中：1.桂龙药膏样品21060502、2.桂龙药膏样品210618、3.黑老虎根对照药材、4.缺黑老虎根阴性样品)
[0196]
2.2方法二
[0197]
样品制备：
①
取桂龙药膏20g，
②
桂龙药膏缺黑老虎根阴性样品20g，分别加10ml水，加入乙酸乙酯50ml，
③
黑老虎根药材5g，加水适量湿润，加乙酸乙酯20ml，超声处理60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，即得。
[0198]
硅胶g板，石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1.5)
[0199]
结果：365nm下检视供试品与对照药材有一橙黄色荧光斑点隐约可见，喷5％香草醛硫酸溶液，加热或日光下检视，有一暗紫色斑点相对应，但阴性均有干扰，详见图15(图15中： 1.桂龙药膏样品21060502、2.桂龙药膏样品210618、3.黑老虎根对照药材、4.缺黑老虎根阴性样品)。
[0200]
3、首乌藤
[0201]
样品制备：取
①
桂龙药膏20g，
②
缺首乌藤阴性样20g，分别加20％硫酸乙醇10ml，及三氯甲烷30ml，加热回流30分钟，立即冷却，分取三氯甲烷层蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
[0202]
对照药材溶液制备：取首乌藤对照药材2g，加甲醇30ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加20％硫酸溶液10ml使溶解，再加三氯甲烷30ml，同法制成。
[0203]
硅胶g，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1)上层溶液为展开剂
[0204]
结果：置365nm下检视，供试品、对照药材与大黄素相对应的斑点位置上有一亮蓝色斑点与之重叠，分离度不好，氨熏后有一明显红色斑点相对应，且阴性无干扰。此提取方法易乳化，且供试品液较粘稠不易点板，详见图16(图16中：1.首乌藤对照药材、2.桂龙药膏样品21060502、3.大黄素对照品、4.缺首乌藤阴性样品)。
[0205]
4、四方藤
[0206]
样品制备：取
①
桂龙药膏20g，
②
缺四方藤阴性样20g，分别加硅藻土15g搅散，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液即得。
[0207]
对照药材溶液制备：取四方藤对照药材2g，加甲醇20ml，同法制成。
[0208]
岩白菜素对照品溶液：取岩白菜素对照品适量，加甲醇溶解，制成每1ml含0.6mg的溶液，即得。
[0209]
硅胶g，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(2.5:2:1)为展开剂
[0210]
检视：喷2％三氯化铁-2％铁氰化钾(1:1)混合溶液，热风吹至斑点显色清晰，日光下检视。
[0211]
结果：试样溶液较黏稠，不易点板，供试品及缺四方藤阴性样品与对照药材及对照品相对应的斑点，因背景干扰大，不易判断，且阴性有干扰，详见图17a(图17a中：1.四方藤对照药材、2.桂龙药膏样品21060502、3.岩白菜素对照品、4.缺四方藤阴性样品)；
[0212]
将上述样品溶液蒸干，加乙醚溶解再点板。
[0213]
硅胶g，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(2.5:2:1)为展开剂
[0214]
检视：喷2％三氯化铁-2％铁氰化钾(1:1)混合溶液，热风吹至斑点显色清晰，日光下检视。
[0215]
结果：试样液不黏稠，易点板，显色后背景无干扰，斑点清晰，供试品在与对照品相对应位置无斑点，与药材有一蓝绿色斑点相对应，但阴性有干扰，详见图17b(图17b中：1. 四方藤对照药材、2.桂龙药膏样品21060502、3.岩白菜素对照品、4.缺四方藤阴性样品)。
[0216]
5、土甘草
[0217]
样品制备方法一：取
①
桂龙药膏20g，
②
缺土甘草阴性样20g，
③
土甘草药材2g分别加乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
[0218]
样品制备方法二：取
①
桂龙药膏20g，
②
缺土甘草阴性样20g，
③
土甘草药材2g分别
加乙醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，置分液漏斗中，用二氯甲烷振摇提取2次，每次30ml，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
[0219]
用硅胶g板，曾试验的展开剂有三氯甲烷-甲醇(20:0.5)、环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯 (12:10:0.15)、环己烷-乙酸乙酯(2:1)、环己烷-乙酸乙酯(4:1)，显色剂曾试过5％磷钼酸乙醇溶液、10％硫酸乙醇溶液、5％香草醛硫酸溶液，365nm下检视。
[0220]
结果：以方法二提取样品斑点较好，展开剂以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(12:10:0.15) 展开效果较好，置365nm下检视均有四个以上斑点与对照药材相对应，且阴性无干扰。上述显色剂显色后，加热至斑点显色清晰，均有一两个斑点与对照药材相对应，且斑点成分不一样，综上考虑选用365nm下检视，详见图18a-h(图18a-d中：1.缺土甘草阴性阴性样品方法一、2.桂龙药膏样品21060502方法一、3.土甘草药材方法一、4.土甘草药材方法二、5. 桂龙药膏样品21060502方法二、6.缺土甘草阴性样品方法二；图18e-h中：1.桂龙药膏样品 21060502方法二、2.桂龙药膏样品210618方法二、3.土甘草药材方法二、4.缺土甘草阴性样品方法二)。
[0221]
为提取简化，在确定展开条件及检视条件后，曾试过
①
将样品用水溶解后，加三氯甲烷提取；
②
样品直接加水饱和正丁醇超声提取。因二氯甲烷、三氯甲烷振摇提取易乳化，故最终确定直接用水饱和正丁醇超声提取样品，详见图18i、图18j(图18i-j中：1.桂龙药膏样品21060502方法二、2.桂龙药膏样品210618方法二、3.土甘草药材方法二、4.缺土甘草阴性样品方法二)。
[0222]
6、当归藤
[0223]
样品制备：取
①
桂龙药膏20g，
②
缺当归藤阴性样20g，分别加硅藻土10g搅散，加50％乙醇100ml，
③
当归藤药材2g，加50％乙醇50ml，分别超声处理1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。硅胶g，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(10:5:1)为展开剂。
[0224]
结果：365nm下检视对照药材无斑点；喷10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下检视，供试品与对战药材有一紫褐色斑点相对应，阴性有干扰，详见图19(图19 中：1.桂龙药膏样品21060502、2.桂龙药膏样品210618、3.当归藤对照药材、4.缺当归藤阴性样品)。
[0225]
7、当归藤、肉桂叶
[0226]
样品制备：取
①
桂龙药膏20g，
②
缺当归藤阴性样20g，
③
缺肉桂叶阴性样20g，加10g 硅藻土搅散，加乙醇100ml，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，用石油醚(60～90℃)，振摇提取3次，每次20ml，合并石油醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
[0227]
药材溶液制备：取当归藤药材5g，肉桂叶药材5g，分别加水200ml，煎煮1小时，用棉花滤过，取上清液浓缩至约30ml，用石油醚(60～90℃)，振摇提取3次，每次20ml，合并石油醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
[0228]
硅胶g，以环己烷-乙酸乙酯(1:1)为展开剂。
[0229]
检视：喷5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热，至斑点显色清晰，日光下检视。
[0230]
结果：供试样品及阴性样品均有一紫红色斑点与肉桂叶药材相对应，且清晰可见，当归藤药材无斑点，详见图20(图20中：1.缺当归藤阴性样品、2.当归藤对照药材、3.桂龙药膏样品21060502、4.肉桂叶对照药材药材、5.缺肉桂叶阴性样品)。
[0231]
8、五爪龙
[0232]
样品制备方法一：取
①
桂龙药膏30g，
②
缺五爪龙阴性样品30g，分别加硅藻土20g搅散，加乙醇80ml，
③
五爪龙药材2g，加乙醇30ml，超声处理60min，滤过，滤液蒸干，残渣加水 10ml使溶解，用石油醚(60～90℃)，振摇提取2次，每次10ml，合并石油醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
[0233]
样品制备方法二：取
①
桂龙药膏20g，
②
缺五爪龙阴性样品20g，
③
五爪龙药材2g，加乙醚40ml，超声处理60min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇0.5ml使溶解，即得。
[0234]
样品制备方法三：取
①
桂龙药膏20g，
②
缺五爪龙阴性样品20g，
③
五爪龙药材2g，加 70％乙醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml微热使溶解，用三氯甲烷 20ml振摇提取，三氯甲烷液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
[0235]
补骨脂素对照品溶液：加甲醇制成1ml含1mg的对照品溶液。
[0236]
硅胶g，展开剂曾试验过石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(5:1)、正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(20:4:5:0.7)、环己烷-甲苯-乙酸乙酯(5:5:1.5)，检视条件为365nm一个检视，喷10％硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰，日光下检视。
[0237]
结果：供试品与对照药材及对照品无相对应斑点，详见图21(图21中：1.桂龙药膏样品21060502、2.补骨脂素对照品、3.五爪龙对照药材、4.缺五爪龙阴性样品)。
[0238]
9、三爪龙
[0239]
样品制备：取
①
桂龙药膏25g，
②
缺三爪龙阴性样品25g，
③
三爪龙药材3g，加乙酸乙酯50ml，超声处理25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，即得。硅胶g 板，正己烷-乙酸乙酯(8:2)为展开剂
[0240]
结果：365nm下检视供试样与对照药材无相对应斑点，详见图22(图22中：1.桂龙药膏样品21060502、2.桂龙药膏样品21060502、3.三爪龙对照药材、4.桂龙药膏样品210618)。
[0241]
10、过岗龙
[0242]
样品制备：取
①
桂龙药膏25g，
②
过岗龙药材3g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
[0243]
硅胶g，石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(2:5)展开。
[0244]
结果：365nm下检视供试样与对照药材无相对应斑点，详见图23(图23中：1.桂龙药膏样品21060502、2.桂龙药膏样品21060502、3.过岗龙对照药材、4.桂龙药膏样品21033102)。
[0245]
11、酚类成分
[0246]
样品液制备：取样品10g，及处方组成药材适量，加甲醇40ml，超声30min使溶散，过滤，滤液蒸干，加水20ml使溶解，加稀盐酸2ml摇匀，加乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。硅胶g板，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8:7:0.8) 为展开剂。
[0247]
检视：365nm荧光下检视，置碘蒸气熏后，日光下检视。
[0248]
综上总结，过岗龙、三爪龙、高山龙药材与供试品有相对应的斑点，成分未知。与多个药材相对应，无专属性，方法不可取，详见图24(图24a、图24b中：1.五爪龙药材、2.牛大力药材、3.当归藤药材、4.桂龙药膏样品21060502、5.首乌藤药材、6.四方藤药材、7.黑老虎根
药材、8.桂龙药膏样品210618、9.土甘草药材、10.土茯苓药材、11.缺土甘草阴性样品；
[0249]
图24c、图24d中：1.肉桂叶药材、2.红药药材、3.过岗龙药材、4.桂龙药膏样品21060502、 5.温姜药材、6.三爪龙药材、7.红杜仲药材、8.桂龙药膏样品210618、9.高山龙药材、10. 大芦药材、11.青藤药材；
[0250]
图24e、图24f中：1.九牛力药材、2.狮子尾药材、3.千斤拔药材、4.桂龙药膏样品 21060502、5.老鸦嘴药材、6.万筋藤药材、7.玉郎伞药材；
[0251]
图24g、图24h中：1.桂龙药膏样品21060502、2.高山龙药材、3.缺高山龙阴性样、4. 桂龙药膏样品210618、5.过岗龙药材)。
[0252]
12、香豆素类成分
[0253]
样品制备方法1：取样品10g，加石油醚(60～90℃)30ml，超声处理30min，去除石油醚液，残渣挥至无石油醚味，加水5ml，摇匀，加乙酸乙酯40ml，超声处理30min，分取乙酸乙酯液蒸干，加乙酸乙酯适量溶解残渣，过中性氧化铝柱(100-200目，3g)，用乙酸乙酯70ml洗脱，收集乙酸乙酯液，继续用甲醇50ml洗脱，收集甲醇洗脱液，将洗脱液分别蒸干，洗脱液用乙酸乙酯/甲醇1ml溶解。
[0254]
样品制备方法2：取样品10g，加乙醇40ml，超声处理30min，过滤，滤液蒸干，残渣加水20ml溶解，加乙酸乙酯20ml，振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液蒸干，加乙酸乙酯适量溶解残渣，过中性氧化铝柱(100-200目，3g)，用乙酸乙酯70ml洗脱，收集乙酸乙酯液，继续用甲醇50ml洗脱，收集甲醇洗脱液，将洗脱液分别蒸干，洗脱液用乙酸乙酯/ 甲醇1ml溶解。
[0255]
样品制备方法3：取样品10g，加水5ml，摇匀，加乙酸乙酯40ml，超声处理30min，分取乙酸乙酯液蒸干，加乙酸乙酯适量溶解残渣，过中性氧化铝柱(100-200目，3g)，用乙酸乙酯70ml洗脱，收集乙酸乙酯液，继续用甲醇50ml洗脱，收集甲醇洗脱液，将洗脱液分别蒸干，洗脱液用乙酸乙酯/甲醇1ml溶解。
[0256]
硅胶g板，展开剂曾试验过正己烷-乙酸乙酯(4:1)、石油醚(60～90℃)-三氯甲烷
‑ꢀ
乙酸乙酯(10:1:4)、甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5:4:1)、石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(5:1)，显色剂：10％氢氧化钾甲醇溶液。
[0257]
结果：以乙酸乙酯超声提取试样，石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(10:1:4) 为展开剂，展开效果较佳。喷10％氢氧化钾甲醇溶液显色后，置365nm检视，桂龙药膏有一亮黄绿色荧光斑点，详见图25(图25中：1.桂龙药膏方法1样乙、2.土甘草方法1样乙、3.桂龙药膏方法1样甲、4.土甘草方法1样甲、5.桂龙药膏方法2样乙、6.土甘草方法2样乙、7.桂龙药膏方法2样甲、8.土甘草方法2样甲、9.桂龙药膏方法3样乙、10.土甘草方法 3样乙、11.桂龙药膏方法3样甲、12.土甘草方法3样甲)。
[0258]
分别取处方组成药材适量，按上述确定乙酸乙酯超声处理提取方法，点样，肉桂叶药材与供试品有一相对应亮黄绿色荧光斑点，详见图26(图26a中：1.黑老虎根药材、2.缺土甘草阴性样、3.五爪龙药材、4.桂龙药膏样品21060502、5.牛大力药材；
[0259]
图26b中：0.四方藤药材、1.土茯苓药材、2.桂龙药膏样品21060502、3.当归藤药材、 4.肉桂叶药材、5.首乌藤药材、6.桂龙药膏样品210618、7.高山龙药材、8.红药药材、9.过岗龙药材；
[0260]
图26c中：1.肉桂叶药材、2.香豆素对照品、3.缺肉桂叶药材阴性样、4.桂龙药膏样
品 21060502、5.土甘草药材、6.三爪龙药材、7.狮子尾药材、8.九牛力药材、9.青藤药材、10. 大芦药材、11.温姜药材、12.红杜仲药材、13.桂龙药膏样品210618)；
[0261]
按确定方法进行试验：
[0262]
①
样品溶液的制备：取桂龙药膏样品10g，加水5ml，摇匀，加乙酸乙酯40ml，超声处理30分钟，分取乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，即得；
[0263]
②
对照药材溶液的制备：取肉桂叶对照药材1g，加水50ml，煎煮30分钟，滤过，滤液浓缩至约10ml，加乙酸乙酯40ml，超声处理30分钟，分取乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，即得；
[0264]
③
对照品溶液的制备：取香豆素对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，即得；
[0265]
④
缺肉桂叶阴性样品溶液的制备：取桂龙药膏缺肉桂叶阴性样品10g，加水5ml，摇匀，加乙酸乙酯40ml，超声处理30分钟，分取乙酸乙酯液蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，即得。
[0266]
硅胶g薄层板，以石油醚(60～90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯(10:1:4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷10％氢氧化钾甲醇溶液，置紫外灯(365nm)下检视。
[0267]
结果：供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，详见图27(图27中：1.缺肉桂叶阴性样、2.香豆素对照品、3.肉桂叶对照药材、4.桂龙药膏样品21060502)。
[0268]
实验例2：桂龙药膏的液相筛选试验
[0269]
1、土甘草含量测定方法
[0270]
色谱条件：15号c
18
柱，流动相为乙腈-水-冰醋酸(70：30：0.08)，检测波长207nm，流速1ml/min，柱温40℃，进样量20ul。
[0271]
白桦脂酸对照品(批号：111802-202004，供鉴别用)溶液：精密称取白桦脂酸8.80mg 于25ml量瓶中，用甲醇溶解定容，摇匀备用；精密备用液5ml置25ml量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得70.4ug/ml的对照溶液。
[0272]
精密称取土甘草药材1g、桂龙药膏25g，分别于锥形瓶中，加入95％乙醇80ml，加热回流1小时，放冷，滤过，即得。
[0273]
结论：土甘草药材色谱中与白桦脂酸对照色谱有保留时间相同的色谱峰，桂龙药膏样品中无白桦脂酸对应峰。白桦脂酸为五环三萜化合物，不溶于水，为溶于甲醇、乙醇、丙酮，易溶于四氢呋喃、吡啶，故土甘草水提工艺并不能将白桦脂酸提取出来。此法不适用，详见图28-30。
[0274]
2、土茯苓含量测定的方法
[0275]
色谱条件：k05号c
18
柱，流动相为甲醇-0.1％冰醋酸溶液(39：61)，检测波长291nm，流速1ml/min，柱温40℃，进样量10ul。
[0276]
落新妇苷对照品(批号：111798-201805，含量为93.6％)溶液：精密称取落新妇苷2.39mg 于10ml量瓶中，加60％甲醇溶解定容，摇匀，即得0.2237mg/ml对照品溶液；
[0277]
精密称取桂龙药膏约20g，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇100ml，称定重量，超声 60min，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0278]
结论：桂龙药膏样品中无与落新妇苷保留时间相同色谱峰。落新妇苷为糖苷类，易
溶于热水，需低温储存，暴露空气中含量易降低。此法不适用，详见图31-32。
[0279]
3、黑老虎根药材含量的测定方法
[0280]
色谱条件：k05号c
18
柱，流动相为乙腈-0.5％冰醋酸溶液(梯度洗脱)，274nm检测，流速1ml/min，柱温35℃，进样量：20ul。
[0281][0282][0283]
五味子甲素对照品(批号： 110764-201915，含量99.5％)：精密称取五味子甲素7.80mg于25ml量瓶中，用60％甲醇溶解定容，摇匀备用；精密量取备用液2ml置25ml量瓶中，用60％甲醇定容，摇匀，即得 24.96*99.5％ug/ml对照品溶液。
[0284]
精密称取桂龙药膏约20g，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇100ml，称定重量，超声 60min，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0285]
结论：桂龙药膏中无与五味子甲素保留时间相对应的色谱峰，此法不适用，详见图33-34。
[0286]
4、牛大力含量测定方法
[0287]
4.1刺桐碱
[0288]
色谱条件：15号c
18
柱，流动相为乙腈-水(10：90)，检测波长280nm，流速0.8ml/min，柱温30℃，进样量10ul。
[0289]
刺桐碱对照品(批号：112058-202001)：精密称取刺桐碱对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成0.138mg/ml的对照品溶液。
[0290]
精密称取9g桂龙药膏于锥形瓶中，精密加入95％乙醇25ml，加热回流1小时，放冷，滤过，即得。
[0291]
结论：桂龙药膏样品中无与刺桐碱保留时间相同色谱峰。此法不适用，详见图35-36。
[0292]
4.2芒柄花素
[0293]
色谱条件：15号c
18
柱，流动相为甲醇-水(56：44)，检测波长254nm，流速0.8ml/min，柱温35℃，进样量10ul。
[0294]
芒柄花素对照品(批号：111703-201504)：精密称取芒柄花素对照品适量，用甲醇溶解并稀释，制成0.0104mg/ml的对照品溶液。
[0295]
取桂龙药膏样品20g，缺牛大力阴性样品20g，分别加甲醇40ml，加热回流30min，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，加在d101型大孔吸附树脂(内径2.8cm，柱高12cm)，用水200ml洗脱，弃去水液，继续用50％乙醇200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇 2ml使溶解，过滤，进样。
[0296]
结论：桂龙药膏样品有与芒柄花素对照保留时间相同色谱峰，但峰较小，且基线不平，杂峰较多，峰形不好。此法不适用，详见图37-39。
[0297]
5、高山龙含量测定方法
[0298]
5.1槲皮素
[0299]
色谱条件：15号c
18
柱，流动相为甲醇-0.4％磷酸(50:50)，检测波长360nm，流速1.0ml/min，柱温40℃，进样量10ul。
[0300]
槲皮素对照品(批号：100081-201610)：精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成28.22368ug/ml对照品溶液。
[0301]
精密称取桂龙药膏约10g于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-25％盐酸溶液(4：1)25ml，加热回流30min，放冷，补足重量，滤过，进样。
[0302]
结论：桂龙药膏样品无与槲皮素色谱有一保留时间相近色谱峰，但峰形小，几不可见，此法不适用，详见图40-41。
[0303]
5.2槲皮苷、芦丁、厚朴酚
[0304]
色谱条件：k05号c
18
柱，流动相为乙腈-0.1％甲酸(10：90)，检测波长254、280nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量10ul。
[0305]
取槲皮苷对照品、芦丁对照品、厚朴对照品适量，加甲醇制成槲皮苷对照品溶液 0.19mg/ml、芦丁对照品溶液0.1mg/ml、厚朴酚对照品溶液33ug/ml。
[0306]
精密称取桂龙药膏10g两份于具塞锥形瓶中，分别加入95％乙醇20ml、70％乙醇20ml，超声1小时，放冷，滤过，进样。
[0307]
结论：桂龙药膏样品色谱中与槲皮苷、芦丁、厚朴酚对照相同保留时间色谱峰较小，且杂质峰较多较大，干扰较大。此法不适用，详见图42-46。
[0308]
6、四方藤含量测定
[0309]
色谱条件：k05号c
18
柱，流动相为乙腈-水(梯度洗脱)，检测波长275nm、318nm，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量10ul。
[0310][0311]
岩白菜素对照品(111532-202005)：精密称取岩白菜素对照品适量，加甲醇溶解并稀释，制成0.3mg/ml对照品溶液。
[0312]
精密称取桂龙药膏、四方藤阴性膏各20g，加硅藻土15g搅散，加甲醇15ml，同法制成样品溶液、阴性样溶液。
[0313]
结论：桂龙药膏样品色谱中有与岩白菜素色谱保留时间相同色谱峰，峰形较好，但四方藤阴性膏在对应位置处有干扰。此法不适用，详见图47-49。
[0314]
7、首乌藤含量测定方法
[0315]
7.1 2,3,5,4
’‑
四羟基二苯乙烯-2-o-b-d-葡萄糖苷
[0316]
色谱条件：k05号c18柱，流动相为乙腈-水(20：80)，检测波长320nm，流速0.9ml/min，柱温30℃，进样量10ul。
[0317]
2,3,5,4
’‑
四羟基二苯乙烯-2-o-b-d-葡萄糖苷对照品溶液50.4885ug/ml。
[0318]
精密称取桂龙药膏10g、缺首乌藤阴性膏约10g，分别置于具塞锥形瓶中，分别加硅藻土 6g，搅散，加入稀乙醇25ml，称定重量，回流30min，放冷，补重，过滤，取续滤液，即得。
[0319]
结论：桂龙药膏中有2,3,5,4
’‑
四羟基二苯乙烯-2-o-b-d-葡萄糖苷保留时间相同色谱峰，但缺首乌藤阴性膏样品有干扰。2,3,5,4
’‑
四羟基二苯乙烯-2-o-b-d-葡萄糖苷含量不稳定。此法不适用，详见图50-52。
[0320]
7.2大黄素、大黄酚
[0321]
色谱条件：k05号c
18
柱，流动相为甲醇-0.1％磷酸(77:23)，检测波长254nm，流速 0.9ml/min，柱温40℃，进样量10ul。
[0322]
大黄素、大黄酚混合对照品溶液：大黄素10.4832ug/ml，大黄酚25.8042ug/ml。
[0323]
精密称取桂龙药膏约25g置具塞锥形瓶中，加硅藻土19g，搅散，加入稀乙醇75ml，称定重量，回流1h，放冷，补重，取上清液过滤，即得。
[0324]
结论：桂龙药膏有大黄素、大黄酚保留时间相同色谱峰，杂峰较多，分离度达不到要求。需进一步验证阴性样品是否有干扰，详见图53-54。
[0325]
色谱条件：k05号c18柱，流动相为甲醇-0.1％磷酸(77:23)，检测波长254nm，流速 0.9ml/min，柱温40℃，进样量10ul。
[0326]
大黄素、大黄酚混合对照品溶液：大黄素10.4832ug/ml，大黄酚25.8042ug/ml。
[0327]
精密量取桂龙药膏10g、缺首乌藤阴性膏10g，置具塞锥形瓶中，加30％乙醇：盐酸(10： 1)30ml，振摇，使样品溶散，加入氯仿30ml，加热回流1小时，立即冷却，分出氯仿液，水提液再用氯仿萃取2次，每次30ml，合并氯仿液，蒸干，用甲醇溶解定容至5ml量瓶中。
[0328]
结论：桂龙药膏色谱中有与大黄素、大黄酚对照色谱保留时间相同色谱峰，但缺首乌藤阴性膏有干扰。大黄酚峰干扰较大，可只选用大黄素对照，且进一步对供试品纯化试验，详见图55-57。
[0329]
样品提取方法一：取桂龙药膏10g、缺首乌藤阴性膏10g，分别加入甲醇50ml，称定重量，回流30min，冷却，称定重量，用甲醇补足减失的重量，过滤，精密量取续滤液25ml，上中性氧化铝柱，(100-200目，直径1.7cm，3.5g)先用甲醇20ml洗，再用5％氢氧化钠溶液100ml洗脱，收集洗脱，用盐酸调ph1-2，加乙醚50ml一起加热回流30min，立即冷却，将样品转移到分液漏斗中，分取乙醚液，再用乙醚萃取2次，每次50ml，合并乙醚液，蒸干，加甲醇溶解定容至5ml。
[0330]
样品提取方法二：取桂龙药膏20g、缺首乌藤阴性膏20g，分别加20％硫酸溶液10ml，加氯仿30ml，加热回流30min，冷却，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml。(易乳化)。
[0331]
流动相曾试验甲醇-0.1％磷酸(76：24)、甲醇-0.1％磷酸(72：28)。
[0332]
结果：几种试验方法色谱中有与大黄素、大黄酚对照色谱保留时间相同色谱峰，但阴性有干扰。
[0333]
对其处方组成个药味进行分析，土甘草药材提取膏有与大黄素对照色谱保留时间相同色谱峰，详见图58-66。
[0334]
8、肉桂叶含量测定方法
[0335]
8.1桂皮醛
[0336]
色谱条件：15号c
18
柱，流动相为乙腈-0.1％磷酸(梯度洗脱)，检测波长274nm，流速 1.0ml/min，柱温25℃，进样量10ul。
[0337][0338]
桂皮醛对照品溶液9.462ug/ml。
[0339]
精密称取桂龙药膏10g，分别于具塞锥形瓶中，加入无水乙醇50ml，加热回流1小时，放冷，滤过，取肉桂叶药材续滤液进样；精密量取桂龙药膏续滤液25ml，蒸干，用甲醇定容至10ml，滤过，进样。
[0340]
结论：桂龙药膏样品中无与桂皮醛色谱保留时间相同色谱峰，详见图67-68。
[0341]
8.2肉桂酸
[0342]
色谱条件：15号c
18
柱，流动相为乙腈-0.1％磷酸(梯度洗脱)，检测波长254nm，流速 1.0ml/min，柱温25℃，进样量10ul。
[0343][0344]
肉桂酸对照品溶液26.8736ug/ml。(甲醇溶解并稀释)
[0345]
精密称取缺肉桂叶阴性膏10g、桂龙药膏10g，分别于具塞锥形瓶中，加入95％乙醇20ml，加热回流1小时，放冷，滤过，即得。
[0346]
结论：桂龙药膏样品色谱中有与肉桂酸相对应色谱保留时间相同色谱峰，但阴性有一点干扰。进一步试验，对检测波长，流动相，及样品提取方法进行试验，详见图69-71。
[0347]
样品提取方法一：分别精密称取桂龙药膏样品、缺肉桂叶阴性样品3g，加水5ml，搅拌使溶解，通过d101大孔树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用10％甲醇100ml洗脱，弃去洗脱液，最后用甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至约2ml，用50％甲醇转移至10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
[0348]
样品提取方法二：分别精密称取桂龙药膏样品、缺肉桂叶阴性样品3g，加水5ml，搅拌使溶解，通过d101大孔树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用20％甲醇100ml洗脱，弃去洗脱液，最后用甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至约2ml，用50％甲醇转移至10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
[0349]
样品提取方法三：分别精密称取桂龙药膏样品、缺肉桂叶阴性样品3g，加水5ml，搅
拌使溶解，通过d101大孔树脂柱(内径为1.5cm，柱高为12cm)，用水100ml洗脱，弃去洗脱液，再用30％甲醇100ml洗脱，弃去洗脱液，最后用甲醇100ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至约2ml，用50％甲醇转移至10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
[0350]
以乙腈-0.2％磷酸(28:72)为流动相，检测波长为274nm。
[0351]
结果：阴性样品经过10％甲醇洗脱已无干扰，20％甲醇、30％甲醇洗脱过程中肉桂酸易流失，故选用样品提取方法一进行试验，且阴性无干扰，此法可行，详见图72-75。
[0352]
总结：
[0353]
通过实验例1：桂龙药膏鉴别研究试验的筛选过程和实验例2：桂龙药膏的液相筛选试验，我们可以看到，对于桂龙药膏的质量控制方法，大的方向是从原料和成品的具体技术指标做研究，但是桂龙药膏有28味药材，涉及的原料众多，由于桂龙药膏中药材成分多，且多是属于民族中药材，大多数都没有国家标准，都是地方标准，所含成分不明，且在样品中除土甘草药材外，其余中药材所含量都很少，对试验造成一定影响。本实验通过工作量巨大的研究，采用薄层色谱法对原料肉桂叶、土甘草、首乌藤进行鉴别，能更好的控制桂龙药膏产品质量，薄层色谱方法具有专属性强、重复性及稳定性好等特点，提高制剂质量的可控性，对其进行全面科学化控制，使标准规范化，质量标准化。采用高效液相色谱法对桂龙药膏中肉桂酸含量进行测定，能更好的控制桂龙药膏制剂产品质量，本方法具有专属性强，精确度、灵敏度高，快速、稳定等特点，能够全面的反应和控制桂龙药膏的质量，是一种效果很好的生产质量控制方法。
[0354]
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。