基于超分子人工受体细胞的组合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及基于超分子人工受体细胞的组合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.炎症与人体各种疾病息息相关，其中也包括实体肿瘤、神经系统疾病等重大疾病。传统的药物对这些重大疾病的治疗效果有所限制，且副作用广泛，滥用药物还会造成细胞以及细菌的耐药性。其中，细菌感染因其对多种抗生素具有耐药性而受到越来越多的关注，严重威胁着公众健康。为了避免抗生素耐药性，越来越多的研究转向在抵御细菌病原体的免疫保护中发挥着关键作用的自然免疫系统，利用先天免疫来对抗细菌感染。例如，巨噬细胞通过吞噬过程识别、吞噬和消化细菌。虽然巨噬细胞的内吞过程是对致病性细菌感染的自然反应，但普通的巨噬细胞往往难以有效地识别、锁定和捕获病原体，导致巨噬细胞对细菌的敏感性和消除效率低下，从而不可避免地导致高感染率。
3.另外，炎症组织常常富集大量的凋亡细胞从而加重炎症程度，而免疫系统对凋亡细胞的自然清除往往较慢。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供基于超分子人工受体细胞的组合物及其制备方法和应用。
6.本发明是这样实现的：
7.第一方面，本发明实施例提供了一种基于超分子人工受体细胞的组合物，其包括：超分子人工受体细胞和客体分子衍生物；所述超分子人工受体细胞的细胞膜上嵌有主体分子；所述客体分子衍生物由客体分子上修饰靶标物的受体获得；所述主体分子与所述客体分子能够相互识别。
8.第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的基于超分子人工受体细胞的组合物的制备方法，其包括：在受体细胞的细胞膜上嵌入主体分子，以获得超分子人工受体细胞；在客体分子上修饰靶标物的受体，以获得客体分子衍生物。
9.第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的基于超分子人工受体细胞的组合物或如前述实施例所述的制备方法制备获得的基于超分子人工受体细胞的组合物在制备用于治疗疾病的产品中的应用。
10.本发明具有以下有益效果：
11.本发明提供了一种基于超分子人工受体细胞的组合物，其包括细胞膜上嵌入有主体分子的超分子人工受体细胞以及可靶向靶标物的客体衍生物，应用时，第一步注射客体分子衍生物来靶向修饰靶标物。第二步注射所述的人工受体细胞，通过主客体相互作用特异性识别靶标物。超分子人工受体细胞通过主客体相互作用，在不影响受体细胞生理功能的情况下，能够特异性识别并清除靶标物，以达到对应的治疗效果。本发明提供的基于超分
子人工受体细胞的组合物的制备简单、快速，条件温和，具有普适性，为实现靶向治疗提供了新思路。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
13.图1为实施例1的超分子人工受体细胞对客体修饰的细菌的识别和摄取的荧光成像对比图；
14.图2为实施例1的超分子人工受体细胞对客体修饰的细菌的识别和摄取的扫描电镜对比图；
15.图3为实施例1的超分子人工受体细胞对耐药细菌的抗菌对比图；
16.图4为实施例1的体内细菌感染模型中超分子人工受体细胞的伤口恢复对比图。
具体实施方式
17.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
18.人体免疫细胞通过吞噬过程识别、吞噬和消化病原体、凋亡细胞以及其他异物，在抵御外来细菌病原体的免疫保护中发挥着关键作用。虽然免疫细胞的内吞过程是对病原菌感染以及凋亡细胞的自然反应，但这些免疫细胞往往难以有效地识别、锁定和捕捉病原体，导致它们对病原体、凋亡细胞等有害生命体的敏感性和清除效率低下，从而不可避免地导致高感染率以及加重炎症。目前的方法都依赖于对细胞表面受体的上调但可能会使先天免疫失衡从而不可避免地导致诸多副作用。还有一种目前很热门的方法是通过基因修饰使细胞表达特殊的抗体，与靶细胞表面抗原的特异性结合，其中基因修饰的方式涉及到在细胞膜上进行复杂的多步化学反应，可能会影响细胞活性；而通过特定配体-受体相互作用的结合方式仅限于表达相关受体的特定细胞，其应用范围局限性较大。
19.本发明实施例提供了一种基于超分子人工受体细胞的组合物，其包括：超分子人工受体细胞和客体分子衍生物；所述超分子人工受体细胞的细胞膜上嵌有主体分子；所述客体分子衍生物由客体分子上修饰靶标物的受体获得；所述主体分子与所述客体分子能够相互识别，并通过非共价键超分子作用形成复合物。
20.本文中的“主体分子”和“客体分子”符合现有主客体化学的定义，能够相互结合，实现体内和体外的生物正交、特异性识别、靶向和附着等。
21.在应用时，可以通过先将向受试者体内注射客体分子衍生物，以靶向修饰或结合靶标物，再注射超分子人工受体细胞。本发明无需对受体细胞进行基因编辑或者细胞表面进行修饰，客体分子衍生物靶向修饰靶标物，受体细胞和客体分子通过主客体相互作用，在不影响受体细胞的生理功能的情况下，提高了超分子人工受体细胞对靶标物的特异性识
别、摄取和清除。此外，本发明提供的超分子人工受体细胞可以根据治疗需求进行适应性的调整，应用范围广，为靶向治疗的有效实现提供了新思路。
22.优选地，所述靶标物为病原体和靶标细胞中的至少一种。
23.优选地，所述病原体选自细菌，真菌，病毒，寄生虫等中的至少一种。
24.优选地，所述靶标细胞选自凋亡细胞、肿瘤细胞、肝细胞、干细胞、淋巴细胞、树突细胞、血小板、脂肪细胞和红细胞中的至少一种。
25.优选地，所述病原体为细菌，所述靶标细胞为凋亡细胞。
26.优选地，所述主体分子选自环糊精(cd)、葫芦脲(cb)、杯芳烃、柱芳烃和冠醚中的至少一种；优选地，所述主体分子为葫芦脲。
27.优选地，所述客体分子选自：金刚烷、金刚烷的衍生物、二茂铁以及二茂铁的衍生物中的至少一种，优选地，所述客体分子为金刚烷或二茂铁。
28.优选地，所述主体分子和所述客体分子的摩尔比为(1～10)：(1～10)，具体可以为1：10、2：10；3：10、4：10、5：10、6：10、7：10、8：10、9：10、1：1、10：1、10：2、10：3、10：4、10：5、10：6、10：7、10：8、10：9中的任意一项或任意两项之间的范围。在该限定范围下，能够简单实现超分子人工受体细胞的制备。
29.优选地，所述主体分子和所述客体分子的摩尔比为1：1。
30.优选地，所述受体细胞选自：免疫细胞、免疫细胞的前体细胞、祖细胞、干细胞、红细胞、血小板和脂肪细胞中的任意一种。
31.优选地，所述免疫细胞选自t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞和肥大细胞中的至少一种；
32.优选地，所述免疫细胞的前体细胞包括胸腺细胞。
33.优选地，所述主体分子通过嵌膜材料嵌于所述受体细胞的细胞膜上。具体地，主体分子位于受体细胞的外表面层，主体分子与嵌膜材料偶联，利用嵌膜材料的疏水作用嵌入受体细胞的细胞膜中，避免了繁琐复杂的合成以及基因修饰的步骤，在能够有效维持受体细胞自身功能的情况下，简化了制备流程。
34.优选地，所述嵌膜材料选自：dmpe-peg、dppe-peg、dspe-peg和chol-peg中的任意一种。
35.优选地，所述超分子人工受体细胞和所述客体分子衍生物为结合状态或独立状态。需要说明的是，结合状态是指超分子人工受体细胞和客体分子衍生物相互识别并结合形成复合物的状态。
36.本发明实施例提供了如前述任意实施例所述的基于超分子人工受体细胞的组合物的制备方法，其包括：在受体细胞的细胞膜上嵌入主体分子，以获得超分子人工受体细胞；在客体分子上修饰靶标物的受体，以获得客体分子衍生物。
37.优选地，在受体细胞的细胞膜中嵌入主体分子的步骤包括：将所述主体分子与嵌膜材料偶联，然后将偶联后的产物嵌入所述细胞膜中。
38.优选地，所述偶联的步骤为：将所述主体分子与所述嵌膜材料于30～42℃，共孵育60～120min。优选为37℃，90min。
39.优选地，偶联时，所述主体分子的作用浓度为1μm～1mm，优选为10μm。
40.优选地，在客体分子上修饰靶标物的受体的步骤包括：将客体分子与靶标物的受
体通过化学共价键的方式偶联在一起。应用时，通过注射客体分子衍生物来靶向修饰靶标物。
41.此外，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的基于超分子人工受体细胞的组合物或如前述任意实施例所述的制备方法制备获得的基于超分子人工受体细胞的组合物在制备用于治疗疾病的产品中的应用。
42.应用时，第一步注射客体分子衍生物来靶向修饰靶标物。第二步注射所述的人工受体细胞，通过主客体相互作用特异性识别靶标物。
43.优选地，所述疾病包括：由细菌、真菌、病毒和原虫中的至少一种导致的疾病。
44.优选地，所述疾病选自：慢性炎症、急性炎症、糖尿病、脓毒症和癌症中的至少一种。
45.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
46.实施例1
47.本实施例提供了一种基于超分子人工受体细胞的组合物的制备方法，组合物包括客体分子衍生物以及超分子人工受体细胞，其包括以下步骤。
48.(1)客体分子衍生物的制备
49.客体分子上修饰有用于识别或结合靶标物的受体，在本实施例中，靶标物为大肠杆菌，由于d-甘露糖可以被大肠杆菌表面fimh受体识别，因此，利用-d-甘露糖共价键偶联客体分子金刚烷(mannose-ada)，获得的客体分子衍生物mannose-ada，可以靶向大肠杆菌表面。mannose-ada为实验室自制。
50.将客体分子衍生物与靶标物混合，获得修饰客体分子衍生物的靶标物：将大肠杆菌在含有100μg/ml的mannose-ada的生理盐水中于37℃孵育20分钟。孵育后洗去多余的mannose-ada。
51.(2)受体细胞的制备
52.超分子人工受体细胞为巨噬细胞；主体分子和嵌膜材料的偶联物为dspe-peg-cb，为实验室自制，dmem培养基购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，其中，dspe-peg为嵌膜材料，cb为葫芦脲。
53.将巨噬细胞在含有10μm的dspe-peg-cb的空白dmem培养基中于37℃孵育2小时。
54.孵育后，洗去多余的dspe-peg-cb，制得超分子人工受体巨噬细胞。
55.(3)验证
56.为了利于成像验证，所实施的大肠杆菌稳转有绿色荧光，将制得的超分子人工受体巨噬细胞对客体分子衍生物修饰的大肠杆菌的识别进行荧光成像，扫描电镜成像以及测试其抗菌能力。超分子人工受体细胞对客体修饰的大肠杆菌的识别和抓取内化的荧光成像对比图参照图1所示，对比没有修饰主体分子的受体细胞或没有修饰客体的大肠杆菌，超分子人工受体巨噬细胞能够增强识别客体修饰的大肠杆菌并增加其摄取。
57.超分子人工受体巨噬细胞对客体修饰的大肠杆菌的识别和抓取内化的扫描电镜图参照图2所示，再一次验证了超分子人工受体细胞对修饰有大肠杆菌的客体分子具有高效的抓取能力。
58.超分子人工受体细胞对耐药大肠杆菌的抗菌对比图参照图3所示，氨苄青霉素和氧氟沙星等一线抗生素对耐药大肠杆菌的抗菌活性很小，相反，超分子人工受体巨噬细胞
作用下的客体修饰的耐药大肠杆菌的存活率显着下降，表明超分子人工受体细胞体系有效的抗菌能力。
59.体内细菌感染模型中超分子人工受体细胞体系的伤口恢复对比图参照图4所示，超分子人工受体细胞作用下的客体修饰的细菌感染伤口表现出快速的伤口愈合过程。
60.实施例2
61.本实施例提供了一种基于超分子人工受体细胞的组合物的制备方法，组合物包括客体分子衍生物以及超分子人工受体细胞，其包括以下步骤。
62.(1)客体分子衍生物的制备
63.同实施例1。
64.(2)受体细胞的制备
65.超分子人工受体细胞为巨噬细胞；主体分子和嵌膜材料的偶联物为dspe-peg-β-cd。dspe-peg为嵌膜材料，β-cd为β-环糊精。
66.将巨噬细胞在含有10μm的dspe-peg-β-cd的空白dmem培养基中于37℃孵育2小时。
67.孵育后，洗去多余的dspe-peg-β-cd，制得超分子人工受体巨噬细胞。
68.实施例3
69.本实施例提供了一种基于超分子人工受体细胞的组合物的制备方法，组合物包括客体分子衍生物以及超分子人工受体细胞，其包括以下步骤。
70.(1)客体分子衍生物的制备
71.客体分子上修饰用于识别或结合靶标物的受体，靶标物为大肠杆菌，由于d-甘露糖可以被大肠杆菌表面fimh受体识别，因此，利用d-甘露糖共价键偶联客体分子二茂铁(fc)，获得的客体分子衍生物mannose-fc可以靶向大肠杆菌表面。
72.将客体分子衍生物与靶标物混合，获得修饰客体分子衍生物的靶标物：将大肠杆菌在含有100μg/ml的mannose-fc的生理盐水中于37℃孵育20分钟。孵育后洗去多余的mannose-fc。
73.(2)受体细胞的制备
74.同实施例1。
75.实施例4
76.本实施例提供了一种基于超分子人工受体细胞的组合物的制备方法，组合物包括客体分子衍生物以及超分子人工受体细胞，其包括以下步骤。
77.(1)客体分子衍生物的制备
78.同实施例3。
79.(2)受体细胞的制备
80.同实施例2。
81.实施例5
82.本实施例提供了一种基于超分子人工受体细胞的组合物的制备方法，组合物包括客体分子衍生物以及超分子人工受体细胞，其包括以下步骤。
83.(1)客体分子衍生物的制备
84.客体分子上修饰用于识别或结合靶标物的受体，在本实施例中，靶标物为凋亡细胞，因此，利用可靶向修饰凋亡细胞的annexin v偶联客体分子金刚烷(annexin v-ada)，获
得的客体分子衍生物annexin v-ada用于靶向修饰凋亡细胞。
85.将客体分子衍生物与靶标物混合，获得修饰客体分子衍生物的靶标物：将凋亡细胞在含有10μm的annexin v-ada的空白dmem培养基中于37℃孵育2小时。孵育后，洗去多余的annexin v-ada。
86.(2)受体细胞的制备
87.同实施例1。
88.实施例6
89.本实施例提供了一种基于超分子人工受体细胞的组合物的制备方法，组合物包括客体分子衍生物以及超分子人工受体细胞，其包括以下步骤。
90.(1)客体分子衍生物的制备
91.同实施例5
92.(2)受体细胞的制备
93.同实施例2。
94.对比例1
95.本实施例提供了一种基于超分子人工受体细胞的组合物的制备方法，大致同实施例1，区别在于，客体分子和受体细胞均不进行修饰。
96.将普通未经修饰的巨噬细胞对普通未经修饰的大肠杆菌进行荧光成像，发现普通未经修饰的巨噬细胞对大肠杆菌的识别和内化能力十分有限，其抗菌能力和体内细菌感染模型下的伤口恢复能力也不及超分子人工受体细胞体系。
97.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。