沙棘籽粕蛋白肽在制备预防和治疗焦虑、抑郁产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及沙棘籽粕蛋白肽在制备预防和治疗焦虑、抑郁产品中的应用。


背景技术：

2.沙棘(hippophae rhamnoides l.)别名醋柳、达布尔、拉巴才尔玛等，是一种雌雄异株的落叶性胡颓子科灌木植物，主要生长于我国的华北、西南、西北等地区，在俄罗斯及印度等国家也均有分布。该植物生态适应性强，具有耐旱、耐盐碱等特点，大面积种植可以作为防风固沙及保持水土的优选物种。由于该植物自然资源丰富，因此其开发利用也备受人们的关注。其中，沙棘果是藏族和蒙古族常用药材，蒙古族《认药白晶鉴》中记述“沙棘膏具有祛肺脓肿、活血、祛巴达干之功效”，藏族医典《晶珠本草》提及到“沙棘果挖除肺病、化血并治培根病”，具有健脾消食、止咳祛痰和活血散瘀的功效。《月王药膳》认为沙棘具有“医治培根、增强体阳、开胃舒胸、饮食爽口、容易消化”等功效，在《四部医典》上载有沙棘在临床上可用于“祛痰止咳、利肺、化湿、壮阴及升阳”等，特别是《本草纲目》认为该植物“实、气味酸、温、无毒、主治久痢不瘥及心腹胀满黄瘦、下寸白虫、单捣为末，酒调服之甚效”。至今为止，沙棘果多用于治疗肺病咳嗽、脘腹胀满、痢疾等疾病，而沙棘叶在藏族药中则多用于治疗诸热、胆热、隐热、火烧伤、瘟病和时疫等。1977年，国家卫生部将沙棘纳入《中国药典》。沙棘因富含营养物质和生物活性成分，又为药食同源植物，因此其果实和种子已在食用、药用等方面被广泛利用。近年来的研究证明，沙棘籽提取油脂后的籽粕蛋白含量丰富，是具有较好的营养价值的优质植物蛋白资源，也沙棘活性物质之一，因此对沙棘籽蛋白及籽粕蛋白来源的生物活性肽的研究和应用开发是十分有必要的。
3.生物活性肽是由天然氨基酸按不同的序列和数量组合而成，而氨基酸序列构成决定其生物活性。目前，生物活性肽的制备方法主要包括生物发酵法、控制酶解法、定向合成法和直接从微生物及动植物中提取、分离纯化等多种方法。合成法包括液相法、天然化学连接法、固相多肽合成法，酶合成法、dna重组技术等。但定向合成法技术尚不成熟，成本较高，实现工业化生产难度较大。发酵法主要是利用乳酸菌、曲霉菌等一些微生物发酵过程中产生的蛋白酶水解蛋白质产生活性肽。控制酶解法制备的生物活性肽不仅安全性高、且酶解过程易于控制、水解条件温和，是生产生物活性肽的常用方法。
4.情绪障碍，包括抑郁症、焦虑症或双向情感障碍是常见的精神类疾病，患者通常表现为情绪低落、自我封闭、负面认知多、狂躁等主要特征，同时也伴随着体重增减、食欲增减、睡眠紊乱，疲劳感严重、注意力下降。情绪障碍也是世界范围内疾病总负担排名第三位的疾病，其病因不明确、主要与生物因素、心理因素和社会因素等相关，且其发病机制复杂。临床用于治疗情绪障碍的药物包括5-羟色胺再摄取抑制剂、三环类抗抑郁药、四环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、去甲肾上腺素再摄取抑制剂等，但是这些药物有一定的副作用，如对骨代谢障碍、出汗、嗜睡、腹泻、头昏、焦虑、便秘、口干、恶心呕吐、厌食、震颤等，不适合长期服用，限制其使用范围。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供沙棘籽粕蛋白肽在制备预防和治疗焦虑、抑郁产品中的应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供沙棘籽粕蛋白肽在制备预防和治疗焦虑、抑郁产品中的应用。
7.沙棘籽粕是沙棘籽经过亚临界低温萃取油脂后的固体物，沙棘籽粕中含有丰富的蛋白质、黄体酮和多种微量元素。研究表明，长期食用沙棘籽粕安全可靠，无蓄积性毒害，亦无致癌或促发肿瘤作用，可促进免疫器官生长发育，提高机体抗病能力，并可治疗犊牛腹泻、卡他性肠炎、肠痉挛、皮疹、风湿病。但目前未见其具有预防和治疗前列腺增生的功效的报道。
8.发明人在研究中意外发现沙棘籽粕蛋白肽能用于改善情绪，增加食欲、预防和缓解疲劳、提升精力、避免抑郁、预防焦虑等相关临床症状，且具备安全、可长期服用、无副作用等特点。因此，沙棘籽粕蛋白肽可用于开发预防和治疗焦虑、抑郁产品，具有广阔的应用前景和经济价值。
9.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述沙棘籽粕蛋白肽在所述产品中的质量含量为0.001～100％。
10.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述产品的使用剂量为50～200mg/kg。
11.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述产品为食品、药品或保健品。
12.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述的药品的剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、口服液、泡腾片、浸膏剂、糖浆剂、注射剂、缓释剂、控释剂或靶向制剂；所述的食品包括液体饮料、粉状食品、膏状食品或块状食品。
13.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述的沙棘籽粕蛋白肽的制备方法为：在沙棘籽粕蛋白溶液中加入蛋白酶进行酶解后过滤，得所述沙棘籽粕蛋白肽。
14.作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述蛋白酶为胰蛋白酶；所述过滤用的滤膜分子量为10kda。
15.本技术发明人经大量的实验发现，当选用胰蛋白酶对沙棘籽粕蛋白进行酶解，并选用分子量为10kda的滤膜进行超滤，所得到的沙棘籽粕蛋白肽具有预防和治疗焦虑、抑郁的作用。
16.本发明还提供一种预防和治疗焦虑、抑郁的产品，所述产品包括沙棘籽粕蛋白肽。
17.作为本发明所述的产品的优选实施方式，所述药物组合物的有效剂量为50～200mg/kg。
18.本发明的有益效果：本发明提供的在制备预防和治疗焦虑、抑郁产品中的应用，其主要通过增加人的食欲、预防和缓解疲劳、提升精力来预防和治疗焦虑、抑郁，不仅为制备预防和治疗焦虑、抑郁的产品提供了一种新来源，同时也发掘出了沙棘籽粕蛋白肽新的应用价值。
具体实施方式
19.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。
20.实施例1沙棘籽粕蛋白制备方法
21.本实施例的一种沙棘籽粕蛋白制备方法，包括以下步骤：
22.(1)称取100g脱脂沙棘籽粕粉末，加入9倍重量份的水溶解，调节溶液ph至11，于37℃提取40min，重复提取3次，8000
×
g离心25min，收集上清液；
23.(2)调节步骤(1)的上清液ph为5.0，按照原料重量百分比0.2％的量加入植酸酶，酶解3h，8000
×
g离心并收集沉淀，将沉淀加水复溶,调节ph至7.0后冷冻干燥，得沙棘籽粕蛋白；
24.(3)用步骤(2)的沙棘籽粕蛋白配制溶液，调节溶液ph至11，加入0.2％的胰蛋白酶，于50℃进行酶解，酶解结束后将溶液离心，取上清液，得蛋白酶解液；
25.(4)将步骤(3)的沙棘籽粕蛋白酶解液经分子量为10kd的聚醚砜超滤膜超滤，得所述沙棘籽粕蛋白肽。
26.实施例2
27.本实施例对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白、沙棘籽粕蛋白酶解液和沙棘籽粕蛋白肽的分析鉴定。
28.(1)采用凯氏定氮法对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白的蛋白质含量进行测定，测定结果如表1所示。
29.(2)对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白和沙棘籽粕蛋白酶解液进行氨基酸含量分析，沙棘蛋白酶解液的氨基酸含量测定结果如表2所示。
30.(3)对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白和沙棘籽粕蛋白酶解液的分子量大小进行测定，测定结果如表3所示。
31.(4)采用hplc/ms/ms方法对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白肽的氨基酸序列进行鉴定，结果如表4所示。
32.表1沙棘籽粕蛋白的提取率及蛋白含量
[0033][0034]
表2沙棘籽粕蛋白及蛋白酶解产物中氨基酸含量(g/100g)
[0035][0036]
由表2可知，谷氨酸，精氨酸等为沙棘籽粕蛋白的主要氨基酸，其次为天冬氨酸及亮氨酸，沙棘籽粕提取蛋白的酸性氨基酸含量相对较高，说明沙棘籽粕蛋白在自然条件下呈酸性，与其等电点结果相一致。酶解前和酶解后的氨基酸种类相同，酶解之后的水解氨基酸总量降低，这可能由于酶解过程中，部分肽段因相互作用而聚集形成沉淀。
[0037]
表3沙棘蛋白及酶解液的肽分子量分布
[0038][0039]
由表3可知，本发明中胰蛋白酶酶解沙棘籽粕蛋白的肽分子量分布的结果显示，沙棘籽粕蛋白原料的分子量较大，而经过酶解之后，分子量明显降低。胰蛋白酶酶解之后的肽分子量大多在5kda～10kda之间，且具有较多的大分子量的肽段。
[0040]
表4 hplc-ms/ms分析结果
[0041]
[0042]
[0043][0044]
由表4可知，共52个肽序列，其中二肽有14个(约占26.92％)，三肽有20个(约占38.46％)，四肽有13个(约占25％)，五肽有3个(约占5.76％)，六肽和八肽各有1个，肽中含有精氨酸基团为24个，且90％以上的精氨酸在碳端。
[0045]
实施例3沙棘籽粕蛋白肽对慢性水浸拘束小鼠体重、悬尾和强迫游泳不动时间的影响
[0046]
本实施例以小鼠的慢性水浸拘束小鼠体重、悬尾和强迫游泳不动时间为指标对实施例1制备的沙棘籽粕蛋白肽的预防和治疗焦虑、抑郁作用进行评价。
[0047]
(1)实验方法：
[0048]
a.本实施例的小鼠为雄性7周龄昆明小鼠，洁净级饲养条件：23
±
2℃，湿度55
±
5％，换气次数12～15次/小时，照明时间12小时/天(7:00～19:00)，5只/饲养笼(235
×
325
×
170h mm)，饲育条件：固体饲料(广东省医学实验动物中心)，自由饮食。适应性饲养一周后进行实验。将实验小鼠随机分组，每组10只，其中正常对照组和模型组小鼠则灌胃给予相同体积的生理盐水；阳性药组：小鼠以20mg/kg的盐酸氟西汀灌胃；沙棘籽粕蛋白组：小鼠以200mg/kg的沙棘籽粕蛋白溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽低剂量组：小鼠以50mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽中剂量组：小鼠以100mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽高剂量组：小鼠以200mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃。
[0049]
b.灌胃一小时后除正常对照组小鼠外，其他各组小鼠均进行水浸拘束4小时/天，连续水浸拘束21天后造成小鼠情绪低落模型。水浸拘束完成后，分为监测各组小鼠体重，并记录；将小鼠悬挂在铁架台的试管夹上，使小鼠成倒置悬挂状态，小鼠适应倒挂2分钟后，开始记录4分钟内的累计不动时间，不动的标准记为小鼠倒挂静止不动放弃挣扎。悬尾实验结束后，小鼠休息4小时后，进行强迫游泳实验。小鼠被迫放在局限且不可逃避的游泳环境中，控制水温在25℃。小鼠先适应2分钟，随后记录4分钟内的累计不动时间，不动的标准记为小鼠在水中保持漂浮不挣扎的状态。
[0050]
(2)实验结果如表5和表6所示。
[0051]
表5
[0052][0053]
与正常对照组相比，**p《0.01有统计学差异；与模型组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0054]
表6
[0055][0056]
与正常对照组相比，**p《0.01；与模型组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0057]
由表6可知，与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠的体重显著降低，而给予不同剂量的沙棘籽粕蛋白肽后，能有效改善拘束小鼠的体重下降情况。由表7可知，与正常对照组相比，模型组小鼠的悬尾和强迫游泳后4分钟的不动时间均显著增加，表明慢性水浸拘束应激小鼠行为绝望程度增加。与模型组相比，阳性药组小鼠、沙棘籽粕蛋白肽低中高剂量组小鼠的悬尾和强迫游泳不动时间均显著减少，表明阳性药和沙棘籽粕蛋白肽能有效改善慢性水浸拘束小鼠的负向情绪。
[0058]
实施例4沙棘籽粕蛋白肽对慢性水浸拘束小鼠糖水偏好度的影响
[0059]
本实施例对实施例1制备的沙棘籽粕蛋白肽对对慢性水浸拘束小鼠糖水偏好度进行测定。
[0060]
(1)实验方法：
[0061]
a.本实施例的小鼠为雄性7周龄昆明小鼠，洁净级饲养条件：23
±
2℃，湿度55
±
5％，换气次数12～15次/小时，照明时间12小时/天(7:00～19:00)，5只/饲养笼(235
×
325
×
170h mm)，饲育条件：固体饲料(广东省医学实验动物中心)，自由饮食。适应性饲养一周后进行实验。将实验小鼠随机分组，每组10只，其中正常对照组和模型组小鼠则灌胃给予相同体积的生理盐水；阳性药组：小鼠以20mg/kg的盐酸氟西汀灌胃；沙棘籽粕蛋白组：小鼠以200mg/kg的沙棘籽粕蛋白溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽低剂量组：小鼠以50mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽中剂量组：小鼠以100mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃；棘籽粕蛋白肽高剂量组：小鼠以200mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃。
[0062]
b.除正常对照组小鼠外，其余各组小鼠均水浸拘束应激4小时/天，并持续应激21天。在糖水偏好实验前训练小鼠使其适应对糖水的饮用，随后各组小鼠禁食禁水24小时，并在应激的第1天进行2小时的糖水偏好实验。同样的，在水浸拘束应激的第21天再次进行糖水偏好实验。每个饲养笼中同时放置称好重量的1瓶1％的蔗糖溶液和1瓶蒸馏水，在1小时后互换位置，2小时后取下所有的瓶子称重，并计算蔗糖溶液和蒸馏水消耗量。糖水偏好度计算公式如下，糖水偏好度＝1％蔗糖溶液消耗量/(1％蔗糖溶液消耗量 蒸馏水消耗量)。
[0063]
(2)实验结果如表7所示。
[0064]
表7
[0065][0066]
与正常对照组相比，**p《0.01有统计学差异；与模型组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01。
[0067]
由表7可知，各组小鼠在应激第一天的糖水偏好度没有显著差异，而水浸拘束应激21天后各组小鼠的糖水偏好度出现不同程度的差异。与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠对糖水偏好度显著降低，表明水浸拘束应激小鼠的糖水消耗减少、快感缺失明显。与模型组小鼠相比，阳性药组小鼠、沙棘籽粕蛋白肽低中高剂量组小鼠的糖偏好度显著增加，表明阳性药和沙棘籽粕蛋白肽低中高剂量能显著改善水浸拘束应激小鼠的糖水消耗降低和快感缺失的现象。而沙棘籽粕蛋白对糖水偏好度没有有效的改善作用。
[0068]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。