一种增强牛胚胎干细胞的多能性和代谢活力的培养体系和培养方法

1.本发明涉及细胞生物学和分子生物学技术领域，更具体的说是涉及一种增强牛胚胎干细胞的多能性和代谢活力的培养体系和培养方法。


背景技术：

2.采用含bfgf和经典的wnt信号通路抑制剂iwr-1的培养体系，可从牛体外受精胚胎中获得牛胚胎干细胞，得到的牛胚胎干细胞在培养体系(ctfr)下可以保持其形态、转录组、核型、群体倍增时间、多能标记基因表达和表观遗传学特征。
3.sodium pyruvate在培养体系中以sodium pyruvate根离子(ch3cocoo-，简称pyr)和钠离子形式存在，sodium pyruvate是参与生物体基础代谢的重要中间产物之一，可通过乙酰辅酶a和三羧酸循环实现细胞三大营养物质-碳水化合物、脂肪酸和氨基酸之间的互相转化。脂肪酸通过β-氧化产生accoa，然而在缺乏外源脂肪酸的培养体系中(如ctfr)，sodium pyruvate作为糖酵解途径中重要的中间代谢物，成为accoa的主要来源。在基础培养体系中加入可渗透细胞的sodium pyruvate，不仅可消除细胞内h2o2，减轻干细胞氧化应激损伤，而且sodium pyruvate可参与细胞的能量和物质代谢。多细胞后生动物通过细胞之间的合作共享一个相对稳定的营养环境，生长因子使它们能够吸收环境中的营养并激活合成代谢相关的生长程序。fgf相关信号通路的激活对于维持人类胚胎干细胞(hescs)、小鼠外胚层干细胞(episcs)和牛胚胎干细胞(bescs)的激发状态至关重要。
4.目前牛胚胎干细胞建系和维持的方法存在一定的问题，异源的饲养层细胞对牛胚胎干细胞的病原体和支原体污染风险难以避免，影响基因工程中基因编辑的牛胚胎干细胞的建系和应用。而且现有的牛胚胎干细胞的长期稳定培养对饲养层依赖度较强。
5.因此，从改良培养体系和优化营养微环境角度，建立真正的无饲养层培养体系，提高牛胚胎干细胞表型均一性，使其具有更广泛的可应用能力是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种增强牛胚胎干细胞的多能性和代谢活力的培养体系和培养方法。通过低密度mef结合0.25mm sodium pyruvate(简称pyr)、40ng/ml的重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor，rhbfgf)进行牛胚胎干细胞维持培养，通过多能性和分化能力检测，最终确定，pyr和rhbfgf可增强并维持低密度饲养层上牛胚胎干细胞多能因子表达和整体代谢活力，并具有三胚层分化能力。获得的降低饲养层密度结合pyr和rhbfgf添加培养牛胚胎干细胞的方法，为减少异源污染无饲养层牛胚胎干细胞培养体系的建立提供宝贵借鉴，并利于转基因克隆牛的研究与生产。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种增强牛胚胎干细胞的多能性和代谢活力的培养体系，包括：mef、tesr
tm-e5/e6基础培养基、tesr
tm-e5/e620x supplement、重组人碱性成纤维细胞生长因子、low fatty acid bsa、iwr-1、sodium pyruvate。
9.进一步的：
10.tesr
tm-e5/e6 basal medium(基础培养基)购自stemcell technolo gies，cat#05947；
11.tesr
tm-e620x supplement:购自stemcelltechnologies，cat#05948；
12.重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbfgf)：购自peprotech；
13.low fatty acid bsa：购自mp biomedicals nz；
14.iwr-1：购自sigma-aldrich；
15.sodium pyruvate(丙酮酸钠)：购自wako,jpn。
16.优选的：培养体系每10ml各原料用量为：9.5ml tesr
tm-e5/e6基础培养基、0.5ml tesr
tm-e5/e6 20x supplement、40ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、13.28mg/ml low fatty acid bsa、2.5μμiwr-1、0.25mm sodium pyruvate。
17.有益效果在于：添加sodium pyruvate浓度为0.25mm和40ng/ml的rhbfgf，可达到增强低密度饲养层(mef)共培养的牛胚胎干细胞的多能性和代谢活力的培养效果。
18.优选的：mef的处理方法：体外培养的c57小鼠胎儿成纤维细胞用12μg/ml丝裂霉素处理3h。
19.优选的：mef的种植密度：0.5
×
104/cm2。
20.本发明还提供了一种应用上述培养体系增强牛胚胎干细胞的多能性和代谢活力的方法：将牛胚胎干细胞与所述培养体系共培养。
21.优选的：培养条件为：37℃，5％co2。
22.优选的：传代条件为tryple select消化5min，用dmem/f12基础培养液终止消化。
23.优选的：冻存方法：triple select消化5min，200g离心5min后去上清液，加mfresr干细胞冻存液500μl混匀后，-80℃放24h后转移至液氮中保存。
24.进一步的，mfresr干细胞冻存液购自stemcell technologies；
25.本发明每天更换培养液一次。传代同时对低密度饲养层共培养条件下添加额外的sodium pyruvate和rhbfgf获得的牛胚胎干细胞进行细胞多能性鉴定。
26.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种增强牛胚胎干细胞的多能性和代谢活力的培养体系和培养方法，取得的技术效果为：
27.本发明是体外培养获得牛胚胎干细胞后，在低密度饲养层共培养条件下，添加0.25mm的sodium pyruvate和40ng/ml的rhbfgf，可增强牛胚胎干细胞的多能性和代谢活力。
28.在低密度饲养层共培养条件下添加额外的sodium pyruvate和rhbfgf培养的牛胚胎干细胞可进行胚胎干细胞传代、冻存和解冻等常规操作。
29.外源性sodium pyruvate或rhbfgf对低密度饲养层培养的牛胚胎干细胞的形态和增殖速度等表型有不同程度的影响：
30.单独添加rhbfgf不足以修复饲养层缺失带来的损失，其主要通过调控上游基因的表达，如生长因子，信号通路及代谢酶的表达调控来发挥作用；
31.单独添加的sodium pyruvate可补充代谢中间产物，起到功能修复作用。
32.低密度饲养层共培养条件下添加额外sodium pyruvate或sodium pyruvate和rhbfgf培养的牛胚胎干细胞，细胞增殖速度提升且稳定，并保持在胚胎干细胞正常的增殖速度范围内，与不添加相比，生长速率显著提高，成形的克隆增加，多能性标记基因oct4、sox2、nanog的表达均明显上调，oct4、sox2、nanog多能标记蛋白的免疫荧光信号强度显著增强，牛胚胎干细胞的初始态多能性标记基因(例如prdm14、tfe3、cd9等)和始发态多能性标记基因(例如tet1、dnmt3b、otx2、zic2、zic3)的表达都显著上调，而pax6、otx1(外胚层)、isl1(中胚层)、pdgfra(原始内胚层)、gata2、gata3(滋养外胚层)等分化基因的表达受到显著的抑制，说明sodium pyruvate，或sodium pyruvate和rhbfgf使得低密度饲养层共培养的牛胚胎干细胞多能性得到增强并且分化得到显著抑制。
33.然而，sodium pyruvate和rhbfgf组合的效果最佳。与单独添加sodium pyruvate相比效果更佳，多能性标记基因oct4、sox2、nanog的表达更高，牛胚胎干细胞的初始态多能性标记基因(例如prdm14、tfe3、cd9等)和始发态多能性标记基因(例如zic2、zic3和cd47)的表达显著上调，说明sodium pyruvate和rhbfgf使得低密度饲养层共培养的牛胚胎干细胞多能性得到进一步增强。
34.所有培养条件下的牛胚胎干细胞均可形成拟胚体，具有分化潜能。但是添加sodium pyruvate和rhfgf可长期稳定培养。而低密度饲养层(无额外丙酮酸和fgf添加的)或只添sodium pyruvate的干细胞难以长期维持稳定。
35.低密度饲养层共培养条件下添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养的牛胚胎干细胞，与不添加或只添加sodium pyruvate相比，sodium pyruvate生成乳酸(lac/pyr)的比例上升，而tca中间代谢物，如琥珀酸，富马酸，苹果酸，柠檬酸的(m 2)与sodium pyruvate(m 3)比率和富马酸，苹果酸的(m 3)与sodium pyruvate(m 3)比率均下降，说明低密度饲养层共培养条件下添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养可提高牛胚胎干细胞的糖酵解信号通路，同时抑制tca信号通路，展示了sodium pyruvate和rhbfgf组合添加对牛胚胎干细胞多能性的维持和分化的抑制的最佳效果。
36.低密度饲养层共培养条件下添加额外sodium pyruvate培养的牛胚胎干细胞，与不添加相比，糖酵解途径、戊糖磷酸途径和三羧酸循环等重要代谢限速酶，除ldha显著降低之外，表达差异不显著；同时，sodium pyruvate代谢酶，除了mpc1，ldha和pdk4显著降低之外，表达差异不显著。然而谷氨酰胺裂解途径的gls2和glud1，脂肪酸从头合成的acaca、acly、fasn、scd和乙酰辅酶a生物合成酶acly和acss2表达不同程度上调，说明添加额外sodium pyruvate可补充代谢中间产物，起到功能修复作用。
37.低密度饲养层共培养条件下添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养的牛胚胎干细胞，与不添加相比，糖酵解途径的slc2a3、hk1、hk2、pkm、ldhb,戊糖磷酸途径的g6pd、pgd和三羧酸循环的cs等重要代谢限速酶表达均显著上调，同时，谷氨酰胺裂解途径的gls和glud1，脂肪酸从头合成的acaca、acly、fasn、scd，sodium pyruvate生成酶pck2、me1、sodium pyruvate消耗酶pc、pdhb和乙酰辅酶a生物合成酶acly、acss2和pdhb的表达均不同程度上调，说明添加额外sodium pyruvate和rhbfgf可提高低密度饲养层共培养条件下的牛胚胎干细胞的中心碳代谢活性，从而增强牛胚胎干细胞的代谢活力。
38.低密度饲养层共培养条件下添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养的牛胚胎干
细胞，与只添加sodium pyruvate相比，糖酵解，戊糖磷酸途径限速酶不同程度升高，乙酰辅酶a合成酶acly,acss2表达显著提高，lac/pyr比例上升而pyr/mal，pyr/ala比例下降，tca循环中间代谢物(m 2)和(m 3)比例下降，sodium pyruvate代谢酶表达水平不同程度上升，脂肪酸从头合成酶表达呈上升趋势。表明在干细胞代谢特征改善方面，sodium pyruvate和rhbfgf的组合添加比只添加sodium pyruvate或不添加具有更好的效果。
39.低密度饲养层共培养条件下添加额外sodium pyruvate培养的牛胚胎干细胞，与不添加相比，经典的mapk信号通路上的功能蛋白的编码基因fgfr1和erk表达有上调趋势，但是整个通路上调不显著，说明额外的sodium pyruvate对牛胚胎干细胞上游的mapk信号通路激活作用不显著。
40.低密度饲养层共培养条件下添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养的牛胚胎干细胞，与不添加相比，经典的mapk信号通路上的功能蛋白的编码基因fgfr1、fgfr3、hras、kras、nras、raf1、mapk1、mapk2和erk表达上调，说明牛胚胎干细胞上游信号通路被显著激活。
41.低密度饲养层共培养条件下添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养的牛胚胎干细胞，与仅sodium pyruvate添加相比，经典的mapk信号通路上的功能蛋白的编码基因fgfr1、fgfr3、hras、kras、nras、raf1、mapk1、mapk2和erk表达不同程度上调，说明牛胚胎干细胞上游信号通路被显著激活。
附图说明
42.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
43.图1附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系培养获得的牛胚胎干细胞在显微镜下观察的结果图，其中，左图为低密度饲养层培养的牛胚胎干细胞对照(不添加，100
×
)，中图为添加sodium pyruvate的结果(100
×
)，右图为添加sodium pyruvate和rhbfgf培养的结果(100
×
)。
44.图2附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系培养获得的牛胚胎干细胞碱性磷酸酶染色的结果图，其中，左图为低密度饲养层培养的牛胚胎干细胞对照(不添加)，中图为添加sodium pyruvate的结果(100
×
)，右图为添加sodium pyruvate和rhbfgf培养的结果(100
×
)。
45.图3附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系培养获得的牛胚胎干细胞生长速率检测结果图，其中，第一行左图为添加sodium pyruvate，1/7m pyr-f7组，与不添加1/7m-f7组的对比；第一行右图为添加sodium pyruvate和rhbfgf，1/7m pyr rhfgf-f7组，与不添加的对比；第二行图为添加sodium pyruvate与添加sodium pyruvate和rhbfgf对比。
46.图4附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系培养获得的牛胚胎干细胞多能性基因相对表达量变化的qpcr检测结果图，其中，第一行左图为添加sodium pyruvate与不添加的对比；第一行右图为添加sodium pyruvate和rhbfgf与不添加的对比；第二行图为添加sodium pyruvate，与添加sodium pyruvate和rhbfgf对比。
47.图5附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系培养获得的牛胚胎干细胞多能标记蛋白的免疫荧光检测结果图(100
×
)，其中，第一行图片1/7m-f7为低密度饲养层共培养的f7；第二行图片为低密度饲养层条件下培养基添加sodium pyruvate培养的f7；第三行图片为低密度饲养层条件下培养基添加sodium pyruvate和rhbfgf培养的f7；第四行图片1m-f7为正常密度饲养层培养的f7。
48.图6附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系培养获得的牛胚胎干细胞初始态多能性基因相对表达量变化的转录组检测结果图，其中，第一行左图为添加sodium pyruvate与不添加的对比；第一行右图为添加sodium pyruvate和rhbfgf与不添加的对比；第二行图为添加sodium pyruvate，与添加sodium pyruvate和rhbfgf对比。
49.图7附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系培养获得的牛胚胎干细胞始发态多能性基因相对表达量变化的转录组检测结果图，其中，第一行左图为添加sodium pyruvate与不添加的对比；第一行右图为添加sodium pyruvate和rhbfgf与不添加的对比；第二行图为添加sodium pyruvate，与添加sodium pyruvate和rhbfgf对比。
50.图8附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate培养获得的牛胚胎干细胞胚层分化相关基因与不添加相比较的相对表达量变化的转录组检测结果图。
51.图9附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞胚层分化相关基因与不添加相比较的相对表达量变化的转录组检测结果图。
52.图10附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate，与添加sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞胚层分化相关基因相对表达量比较的转录组检测结果图。
53.图11附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate培养获得的牛胚胎干细胞与不添加相比较的代谢组检测结果图。
54.图12附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞与不添加相比较的代谢组检测结果图。
55.图13附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate，与添加sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞的代谢组检测结果对比图。
56.图14附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate培养获得的牛胚胎干细胞与不添加相比较的代谢流检测结果图。
57.图15附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞与不添加相比较的代谢流检测结果图。
58.图16附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate，与sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞的代谢流检测结果对比图。
59.图17附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate培养获得的牛胚胎干细胞的中心碳代谢相关通路的限速酶编码基因与不添加相比较的转录组检测结果图。
60.图18附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞的中心碳代谢相关通路的限速酶编码基因与不添加相比
较的转录组检测结果图。
61.图19附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate与添加sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞的中心碳代谢相关通路的限速酶编码基因的转录组检测结果对比图。
62.图20附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系培养获得的牛胚胎干细胞的经典mapk信号通路相关基因的转录组检测结果图，其中，第一行左图为添加sodium pyruvate与不添加的对比；第一行右图为添加sodium pyruvate和rhbfgf与不添加的对比；第二行图为添加sodium pyruvate与添加sodium pyruvate和rhbfgf对比。
63.图21附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞体外分化形成的拟胚体与添加sodium pyruvate或不添加在显微镜下观察的对比结果(100
×
)图。
64.图22附图为本发明提供的低密度饲养层培养体系中添加sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞与添加sodium pyruvate或不添加的体外分化能力的免疫荧光染色检测对比结果(100
×
)图。
具体实施方式
65.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
66.本发明实施例公开了一种增强牛胚胎干细胞的多能性和代谢活力的培养体系和培养方法。
67.实施例所用干细胞系为bescs-f7，简称f7。
68.实施例1
69.用c57小鼠的胎儿成纤维细胞制备饲养层
70.解冻原代的c57小鼠的胎儿成纤维细胞，于37℃，5％co2条件下连续扩增培养三代，待汇合度达到80％～90％后，用含有12μg/ml丝裂霉素c的c57小鼠的胎儿成纤维细胞的培养液(dmem 10％fbs 1％ps)处理细胞3h。液氮中冷冻保存备用。
71.使用时用小鼠的胎儿成纤维细胞培养液快速解冻，且饲养层种植密度为3.5
×
104/cm2(密度)，37℃，5％co2培养过夜，pbs清洗两遍细胞，制备得到体外培养牛胚胎干细胞的培养体系。
72.体外培养牛胚胎干细胞的培养体系为(10ml)：
73.饲养层
[0074][0075]
[0076]
其中，iwr-1为一种wnt信号通路抑制剂，分子式为c
25h19
n3o3。
[0077]
实施例2
[0078]
牛胚胎干细胞的建系和培养
[0079]
将体外受精获得的牛囊胚去掉透明带，接种到实施例1制备好的体外培养牛胚胎干细胞的培养体系中的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，37℃，5％co2条件下培养。
[0080]
连续10天观察细胞的生长状态，有细胞爬出的胚胎传4～5代后即可获得牛胚胎干细胞。
[0081]
其中，传代条件为triple select于37℃消化3min，用dmem/f12基础培养液终止消化；
[0082]
培养体系中加入rho激酶抑制剂y-27632，每次传代后24h内的培养体系为(10ml)：
[0083][0084]
y-27632为rho激酶抑制剂，分子式为c
14h21
n3o
·
2hcl。
[0085]
24h后换为体外培养牛胚胎干细胞的培养体系。
[0086]
牛胚胎干细胞的体外培养需要与丝裂霉素c处理过的c57小鼠的胎儿成纤维细胞共培养。
[0087]
冻存时，使用triple select于37℃消化3min，200g离心5min后去上清液，加500μl mfresr干细胞冻存液混匀细胞，移至冻存管中，置于程序冷冻盒，-80℃放24h后转移至液氮中保存。
[0088]
解冻时，在37℃水浴中匀速晃动冻存管，待冻存液即将全部融化时，迅速向冻存管中加入37℃预热的dmem/f12基础培养液1ml，轻吹3下，吸出液体转移至盛有5ml dmem/f12基础培养液的离心管中，200g离心5min，吸净上清液，用牛胚胎干细胞的传代培养体系重悬细胞沉淀，按比例均匀铺到准备好的12孔板中(含有准备好的上述的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层)，37℃，5％co2培养。24h后更换为体外培养牛胚胎干细胞的培养体系。
[0089]
实施例3
[0090]
低密度饲养层条件添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养牛胚胎干细胞的方法
[0091]
将实施例2获得的牛胚胎干细胞的培养体系更换为低密度饲养层条件添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养牛胚胎干细胞的培养体系，37℃，5％co2培养，传5代后细胞状态转变并趋于稳定。
[0092]
低密度饲养层条件添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养牛胚胎干细胞的培养体系(10ml)：
[0093][0094]
其中，sodium pyruvate为生物体基本代谢的中间产物之一，分子式为ch3cocoona；
[0095]
传代条件为triple select于37℃消化5min，用dmem/f12基础培养液终止消化；
[0096]
冻存时，triple select消化5min，200g离心5min后去上清液，加mfresr干细胞冻存液500μl混匀后，移至冻存管中，置于程序冷冻盒，-80℃放24h后转移至液氮中保存。
[0097]
解冻时，在37℃水浴中匀速晃动冻存管，待冻存液即将全部融化，迅速向冻存管中加入1ml的37℃预热的dmem/f12基础培养液，轻吹3下，吸出液体至盛有5ml dmem/f12基础培养液的离心管中，200g离心5min，吸去上清液，用低密度饲养层条件添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养牛胚胎干细胞的培养体系重悬细胞沉淀，按比例均匀铺到准备好的12孔板中(含小鼠的胎儿成纤维细胞饲养层)，于37℃，5％co2培养。
[0098]
对比实验
[0099]
将实施例2获得的牛胚胎干细胞的培养体系更换为低密度饲养层条件，及添加额外sodium pyruvate，或sodium pyruvate和rhbfgf培养牛胚胎干细胞的培养体系，37℃，5％co2培养，传5代后细胞状态转变并趋于稳定，见图1。
[0100]
结果表明：sodium pyruvate，或sodium pyruvate和rhbfgf的添加利于维持牛胚胎干细胞克隆状态，而sodium pyruvate和rhbfgf的添加更利于克隆的成型。
[0101]
牛胚胎干细胞转化获得的牛胚胎干细胞的鉴定
[0102]
碱性磷酸酶染色
[0103]
采用bcip/nbt碱性磷酸酶显色试剂盒(beyotime,c3206)，按照说明书的染色步骤进行，牛胚胎干细胞染色呈现紫红色，表明碱性磷酸酶有表达，见图2。
[0104]
结果表明：sodium pyruvate，或sodium pyruvate和rhbfgf的添加均利于维持牛胚胎干细胞碱性磷酸酶表达。
[0105]
干细胞生长速率的cck8鉴定。
[0106]
采用cck-8细胞计数试剂盒(ca1210,solarbio,中国)计算各组干细胞生长速度。牛胚胎干细胞汇合速度加快，经典克隆大量出现，见图3。
[0107]
结果表明：sodium pyruvate，或sodium pyruvate和rhbfgf的添加均利于维持牛胚胎干细胞的生长速率，sodium pyruvate和rhbfgf的添加更利于干细胞快速生长。
[0108]
干细胞核心转录因子的qpcr鉴定
[0109]
分别提取降低饲养层密度培养的牛胚胎干细胞，低饲养层密度条件添加额外sodium pyruvate培养获得的牛胚胎干细胞，低饲养层密度条件添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞的rna，反转录为cdna后进行qpcr鉴定。
[0110]
其中，反转录：primescripttm rt reagent kit with gdna eraser(takara)
[0111]
qpcr：kapafast universal qpcr master mix(kapa biosystems pty)。
[0112]
结果显示，低密度饲养层培养体系中添加额外sodium pyruvate或sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞，与不添加相比，多能性标记基因oct4、sox2、nanog的表达明显上调。进一步比较组合添加sodium pyruvate和rhbfgf比单加sodium pyruvate更能促进oct4、sox2、nanog不同程度提高，见图4。
[0113]
所用引物序列如下：
[0114]
oct4上游引物：5
’‑
ggttctctttggaaaggtgttc-3’[0115]
下游引物：5
’‑
acactcggaccacgtctttc-3’[0116]
sox2上游引物：5
’‑
catccacagcaaatgacagc-3’[0117]
下游引物：5
’‑
tttctgcaaagctcctaccg-3’[0118]
nanog上游引物：5
’‑
ttccctcctccatggatctg-3’[0119]
下游引物：5
’‑
atttgctggagactgaggta-3’[0120]
干细胞核心转录因子的免疫荧光鉴定
[0121]
对获得的牛胚胎干细胞多能因子的表达情况进行了鉴定。
[0122]
结果显示：获得的牛胚胎干细胞表达sox2(cell signaling,l1d6a2)、nanog(peprotech,500-p236)、oct4(santa cruz biotechnology,sc-9081)和cdx1(sigma,av31476)，见图5。
[0123]
表明单从阳性结果看，本发明荧光强度更强，多能性基因编码蛋白有足够表达。
[0124]
干细胞多能性标记基因的转录组鉴定
[0125]
对获得的牛胚胎干细胞多能标记基因的表达情况进行了鉴定。
[0126]
结果显示：低密度饲养层培养体系中添加额外sodium pyruvate或sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞，与不添加相比，所获得的牛胚胎干细胞的初始态多能性标记基因(例如prdm14、tfe3、cd9等)和始发态多能性标记基因(例如tet1、dnmt3b、otx2、zic2、zic3、cd47)的表达都显著上调，进一步比较组合添加sodium pyruvate和rhbfgf比单加sodium pyruvate更能促进初始态多能性标记基因(例如prdm14、cd9等)和始发态多能性标记基因(例如otx2、zic2、zic3、cd47)的表达不同程度的提高，见图6～图7。
[0127]
干细胞分化和发育相关基因的转录组鉴定
[0128]
对获得的牛胚胎干细胞分化和发育相关基因的表达情况进行了鉴定。结果显示：低密度饲养层培养体系中添加额外sodium pyruvate或sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞，与不添加相比，pax6、otx1(外胚层)、isl1(中胚层)、pdgfra(原始内胚层)、gata2、gata3(滋养外胚层)等分化基因的表达显著下降；进一步比较组合添加sodium pyruvate和rhbfgf比单加sodium pyruvate不能明显的抑制多胚层分化marker的表达，反而升高了meis2,otx1,bmp4,gata6,gata3的表达，见图8～图10。
[0129]
干细胞多能性维持的代谢组鉴定
[0130]
对获得的牛胚胎干细胞多能性维持的代谢组特征情况进行了鉴定。
[0131]
结果显示：低密度饲养层培养体系中添加额外sodium pyruvate或sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞，与不添加相比，sodium pyruvate生成乳酸(lac/pyr)的比例上升，而丙氨酸生成sodium pyruvate(pyr/ala)，和苹果酸生成sodium pyruvate(pyr/mal)的比例显著下降；进一步比较组合添加sodium pyruvate和rhbfgf比单
加sodium pyruvate进一步提高lac/pyr的比例，同时进一步降低pyr/ala和pyr/mal比例，见图11～图13。
[0132]
干细胞多能性维持的代谢流鉴定
[0133]
对获得的牛胚胎干细胞多能性维持的代谢流特征情况进行了鉴定。
[0134]
结果显示：低密度饲养层培养体系中添加额外sodium pyruvate或sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞，与不添加相比，tca中间代谢物，如琥珀酸，富马酸，苹果酸，柠檬酸的(m 2)与sodium pyruvate(m 3)比率和富马酸，苹果酸的(m 3)与sodium pyruvate(m 3)比率均下降。进一步比较组合添加sodium pyruvate和rhbfgf与单加sodium pyruvate，tca中间代谢物，如琥珀酸，富马酸，苹果酸，柠檬酸的(m 2)与sodium pyruvate(m 3)比率和富马酸，苹果酸的(m 3)与sodium pyruvate(m 3)比率进一步下降，见图14～图16。
[0135]
干细胞中心碳代谢活性的转录组鉴定
[0136]
对获得的牛胚胎干细胞中心碳代谢相关通路的限速酶编码基因的表达情况进行了鉴定。
[0137]
结果显示：低密度饲养层培养体系中添加额外sodium pyruvate培养获得的牛胚胎干细胞，与不添加相比，糖酵解途径、戊糖磷酸途径和三羧酸循环等重要代谢限速酶，除ldha显著降低之外，表达差异不显著；同时，sodium pyruvate代谢酶，除了mpc1，ldha和pdk4显著降低之外，表达差异不显著。然而谷氨酰胺裂解途径的gls2和glud1，脂肪酸从头合成的acaca、acly、fasn、scd和乙酰辅酶a生物合成酶acly和acss2表达不同程度上调，见图17；
[0138]
低密度饲养层培养体系中添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞，与不添加相比，糖酵解途径的slc2a3、hk1、hk2、pkm、ldhb,戊糖磷酸途径的g6pd、pgd和三羧酸循环的cs等重要代谢限速酶表达均显著上调，谷氨酰胺裂解途径的gls和glud1，脂肪酸从头合成的acaca、acly、fasn、scd，sodium pyruvate生成酶pck2、me1、sodium pyruvate消耗酶pc、pdhb和乙酰辅酶a生物合成酶acly、acss2和pdhb的表达均不同程度上调，见图18；
[0139]
低密度饲养层培养体系中添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞，与添加额外sodium pyruvate相比，糖酵解途径的slc2a3、hk1、hk2、pkm、ldha、ldhb,戊糖磷酸途径的g6pd、pgd和三羧酸循环的cs等重要代谢限速酶表达均显著上调，谷氨酰胺裂解途径的gls和glud1及脂肪酸从头合成的acly、fasn、scd，sodium pyruvate生成酶pck2、me1、sodium pyruvate消耗酶pc、pdhb和乙酰辅酶a生物合成酶acly、acss2和pdhb的表达均不同程度上调，见图19。
[0140]
干细胞的经典mapk信号通路的转录组鉴定
[0141]
对获得的牛胚胎干细胞fgf相关的信号通路经典mapk信号通路相关基因的转录水平进行了转录组鉴定。
[0142]
结果显示：低密度饲养层培养体系中添加额外sodium pyruvate培养获得的牛胚胎干细胞，与不添加相比，经典的mapk信号通路上的功能蛋白的编码基因fgfr1和erk表达有上调趋势，但是整个通路上调不显著，见图20；低密度饲养层培养体系中添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞，与不添加相比，mapk信号通路上的功能蛋白
的编码基因fgfr1、fgfr3、hras、kras、nras、raf1、mapk1、mapk2和erk表达上调，见图20。
[0143]
低密度饲养层培养体系中添加额外sodium pyruvate和rhbfgf培养获得的牛胚胎干细胞，与添加额外sodium pyruvate相比，mapk信号通路上的功能蛋白的编码基因fgfr3、hras、kras、nras、raf1、mapk1、mapk2和erk表达上调，见图20。
[0144]
实施例5
[0145]
牛胚胎干细胞转化获得的牛胚胎干细胞的体外分化能力的鉴定
[0146]
1、干细胞的体外分化能力的拟胚体形成能力鉴定
[0147]
对获得的牛胚胎干细胞的体外分化能力情况进行了鉴定。结果显示各条件均可形成球形的拟胚体，见图21。
[0148]
2、干细胞的体外分化能力的多胚层分化标记的免疫荧光鉴定
[0149]
对获得的牛胚胎干细胞的体外分化能力情况进行了鉴定。
[0150]
结果显示牛胚胎干细胞表达gfap(dako,z0334),sma(abcam,ab5694),afp(abcam,ab284396)，本发明的第4、8、12列优势在于细胞密集度更大，见图22。
[0151]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0152]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。