2-溴棕榈酸在制备治疗生精功能障碍相关疾病的药物中的应用的制作方法

1.本发明属生物医学类技术领域，具体涉及2-溴棕榈酸在制备治疗生精功能障碍相关疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.不育症是现代社会中不容忽视的重要医学问题，在不育夫妇中男性因素占30～50％的比例。生精功能障碍是引起男性不育的主要原因之一。近年来，肥胖率的上升使得脂质代谢紊乱成为导致生精功能障碍的重要病因。饱和脂肪酸的异常增多是脂质代谢紊乱的一大特征，同时也是引发生精功能障碍的一个关键因素。因此，针对脂质代谢紊乱及饱和脂肪酸异常增多所致生精功能障碍的治疗，已成为近年来亟待解决的医学问题。
3.精子发生过程是在睾丸生精小管中进行的，受到睾丸微环境中多种细胞的精密调控。在精子发生微环境中，睾丸支持细胞通过形成血睾屏障为精子发生提供免疫豁免的微环境，并保护生精细胞免受外部有害物质的威胁。此外，睾丸间质细胞、管周肌样细胞和睾丸支持细胞一起通过旁分泌作用对精子发生过程加以调控，以保障精子发生的正常进行。然而，脂质代谢紊乱在精子发生微环境中影响的主要细胞类型及具体作用机制尚不明确，这限制了生精功能障碍相关疾病的医疗范围。
4.既往研究表明，白藜芦醇、苯基丁酸钠盐、姜黄素、积雪草酸等可部分恢复高脂饮食所致肥胖动物模型的生精功能。此外，褪黑素也被证明可通过缓解饱和脂肪酸所引起的精原干细胞的凋亡、内质网应激及氧化应激等，改善生精功能。然而，在脂质代谢紊乱所致的生精功能障碍中，如何通过改善生精微环境中的细胞功能恢复生精功能，仍知之甚少。在精子发生的睾丸微环境中，睾丸支持细胞作为唯一一类与生精细胞直接接触的体细胞，不仅形成血睾屏障保护生精细胞免受伤害，通过营养传输和旁分泌功能为精子发生提供支持。因此，针对睾丸支持细胞的功能保护的研究将为治疗生精功能障碍相关疾病提供新的策略。
5.2-溴棕榈酸是一种已知的蛋白质棕榈酰化抑制剂，通过抑制棕榈酰转移酶降低蛋白质棕榈酰化水平。根据已有研究，饱和脂肪酸可显著提高细胞中蛋白质的棕榈酰化水平。异常的棕榈酰化可改变蛋白质的结构和水溶性，进一步影响细胞的状态及功能，从而引起多种疾病，包括代谢综合征、癌症等。作为棕榈酰化抑制剂，2-溴棕榈酸已被证明可缓解炎症性疼痛、缓解骨癌疼痛、防治骨丢失相关疾病等。但目前未见任何关于2-溴棕榈酸可改善生精功能的相关用途的报道。


技术实现要素：

6.发明目的：提供一种2-溴棕榈酸在制备治疗生精功能障碍相关疾病的药物中的应用，能够为治疗生精障碍疾病开拓新方法，为改善生精功能提供新的靶点和思路。
7.技术方案：本发明提供了一种2-溴棕榈酸在制备治疗生精功能障碍相关疾病的药
物中的应用。
8.作为本发明应用的进一步限定方案，所述的生精功能障碍相关疾病包括但不限于脂代谢紊乱所致生精功能障碍。
9.作为本发明应用的进一步限定方案，所述的治疗生精功能障碍相关疾病的药物中包含有2-溴棕榈酸。
10.作为本发明应用的进一步限定方案，所述的治疗生精功能障碍相关疾病的药物为改善睾丸支持细胞屏障功能的药物、提高细胞屏障形成过程中特征基因的药物或者抑制饱和脂肪酸所致细胞内质网应激的药物。
11.作为本发明应用的进一步限定方案，所述的特征基因包括zo-1、occludin、claudin-11以及claudin-5中的一种或多种。
12.作为本发明应用的进一步限定方案，所述的治疗生精功能障碍相关疾病的药物使用时，2-溴棕榈酸的给药剂量为2-40mg/kg。
13.作为本发明应用的进一步限定方案，所述的治疗生精功能障碍相关疾病的药物的剂型为注射剂、胶囊剂、口服制剂或者微囊制剂。
14.作为本发明应用的进一步限定方案，所述的治疗生精功能障碍相关疾病的药物的给药方式为口服给药、非胃肠道给药、吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、睾丸注射给药或者通过植入的贮药装置给药中的至少一种。
15.作为本发明应用的进一步限定方案，非胃肠道给药包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、损伤部位内或者颅内中的至少一种给药方式。
16.本发明还提供了一种治疗生精功能障碍相关疾病的药物，所述的生精功能障碍相关疾病包括但不限于脂代谢紊乱所致生精功能障碍，所述的药物中包含有2-溴棕榈酸。
17.本发明与现有技术相比，其有益效果是：利用跨膜电阻检测、跨膜荧光渗漏检测、蛋白质免疫印迹等多种实验手段，明确了2-溴棕榈酸可在体外改善睾丸支持细胞在饱和脂肪酸刺激下发生的屏障损伤；通过构建小鼠高饱和脂肪酸生精障碍模型，明确了2-溴棕榈酸在体内也具有恢复血睾屏障完整性的功能，可显著改善脂代谢紊乱所致的生精功能障碍；提供了2-溴棕榈酸治疗脂代谢紊乱所致生精功能障碍的体内实验数据基础，明确了2-溴棕榈酸对血睾屏障的保护作用，为生精功能障碍相关疾病提供了新的治疗策略。
附图说明
18.图1显示跨膜电阻实验检测2-溴棕榈酸(2-bp)对饱和脂肪酸棕榈酸(pa)引起睾丸支持细胞屏障损伤的改善作用；
19.图2显示跨膜大分子荧光渗漏实验检测2-bp对饱和脂肪酸pa引起睾丸支持细胞屏障损伤的改善作用；
20.图3显示蛋白质免疫印记检测2-bp对饱和脂肪酸pa引起紧密连接蛋白表达下降的恢复作用；
21.图4显示蛋白质免疫印记检测2-bp对饱和脂肪酸pa引起内质网应激标记蛋白表达上升的恢复作用；
22.图5显示小鼠灌胃2-bp后，饱和脂肪酸pa引起的睾丸总蛋白质过度棕榈酰化被显著抑制；
23.图6显示2-bp恢复了饱和脂肪酸pa诱导的小鼠附睾尾精子数量下降；
24.图7显示2-bp恢复了饱和脂肪酸pa诱导的小鼠附睾尾精子活动率下降；
25.图8显示体内fitc-i荧光渗漏实验检测2-bp恢复了饱和脂肪酸pa诱导的小鼠血睾屏障损伤；
26.图9显示电镜观察2-bp恢复了饱和脂肪酸pa诱导的小鼠血睾屏障损伤。
具体实施方式
27.下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明范围。
28.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。
29.实施例1：
30.2-溴棕榈酸在体外改善睾丸支持细胞在饱和脂肪酸刺激下发生的屏障损伤实例如下。
31.(1)小鼠原代睾丸支持细胞的分离及培养：
32.取20日龄icr雄性小鼠，断颈处死后用75％消毒酒精浸泡2-5分钟，于超净台内切开下腹部皮肤，取出睾丸，从附睾尾部剪断精囊取两侧睾丸，放入37℃的pbs的培养皿中，用眼科镊子撕去脂肪组织、睾丸白膜和血管，暴露出曲细精管，放入另一个呈有pbs的培养皿中。将组织切成小于1mm3的小块状，置于5ml d0.25％(m/v)的胰蛋白酶中，37℃震荡消化4-6分钟，使生精小管分散。pbs 25-30ml洗涤一遍，去上清。37℃条件下用5ml 0.1％(m/v)的1型胶原酶震荡消化6-8分钟，用10％fbs的dmem/f12(v/v，1:1)作为终止液。细胞悬液用100目滤网过滤。pbs 5-10ml洗一遍，4度离心机，1200转/分钟，离心6分钟，去上清，pbs 30ml洗一遍，去上清。将细胞种入培养皿，34℃温箱(含5％co2)培养，4小时后洗三遍去除生精细胞。第二天换液以再次去除未贴壁的生精细胞。继续培养直至细胞长至80％密度以上。
33.(2)tm4小鼠睾丸支持细胞系的培养：
34.tm4小鼠睾丸支持细胞系购于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司(icell bioscience inc)，使用含有5％马血清和2.5％胎牛血清的dmem/f12作为培养基在37℃、5％co2条件下进行培养。
35.(3)细胞的消化及计数：
36.弃去培养基，pbs清洗细胞两遍后，胰酶消化1分钟，显微镜下观察细胞变圆后，加入含有血清的完全培养基终止消化并重悬细胞，室温下1500rpm水平离心5分钟，弃上清，加入适量完全培养基重悬细胞，吹打混匀后取20μl滴入血球计数板，显微镜下观察，数出计数板左上、左下、右上、右下及中间共5个中格中的细胞数，每ml细胞数按照“5中格细胞数
×5×
104×
稀释倍数”进行计算。
37.(4)跨膜电阻实验检测细胞屏障完整性：
38.小鼠原代睾丸支持细胞按照0.5
×
106/cm2的密度接种于millicell悬挂细胞小室(pet材质，0.4μm孔径，merck millipore公司)，接种当天记为day1，之后培养3天以形成细胞屏障。屏障形成后，细胞分三组进行处理：pa组加入0.4mm pa，2-bp pa组加入10μm 2-bp
和0.4mm pa，对照组(control)加入与2-bp pa组等量的二甲基亚砜溶剂。加药处理后继续培养3天。实验持续期间每天使用millicell电阻检测系统(merck millipore公司)检测跨膜电阻。电阻降低表示细胞屏障完整性受损。
39.(5)大分子荧光渗漏实验检测细胞屏障完整性：
40.小鼠原代睾丸支持细胞按照0.5
×
106/cm2的密度接种于millicell悬挂细胞小室(pet材质，0.4μm孔径，merck millipore公司)。待细胞屏障形成后，细胞分三组加药处理24小时：pa组加入0.4mm pa，2-bp pa组加入10μm 2-bp和0.4mm pa，对照组(control)加入与2-bp pa组等量的二甲基亚砜溶剂。荧光渗漏检测时，在上室加入200μl溶于无酚红dmem/f12的1mg/ml fitc-dextran，下室加入1.2ml无酚红dmem/f12。培养箱继续培养4小时，下室取200μl溶液放入96孔板，使用酶标仪进行荧光量测定(激发光490nm，发射光520nm)。荧光量增多表示细胞屏障完整性受损。
41.(6)蛋白样本处理及提取：
42.将tm4细胞接种于6孔板中(30
×
104/孔)，分为对照组、pa组和2-bp pa组，pa组加入0.4mm pa，2-bp pa组加入10μm 2-bp和0.4mm pa，对照组(control)加入与2-bp pa组等量的二甲基亚砜溶剂。加药处理24小时后，收集细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的ripa细胞裂解液，冰上裂解30分钟，转移细胞裂解物至1.5ml离心管，4℃条件下13000rpm离心15分钟，收集上清至新的1.5ml离心管，bca法测定蛋白浓度，加入1/4体积5
×
蛋白上样缓冲液，98℃煮5分钟后，-80℃冰箱保存。
43.(7)蛋白质免疫印迹检测蛋白表达量：
44.制备好的蛋白样本，以20μg每样品上样至page凝胶，电泳后转膜至pvdf膜。4℃孵育一抗过夜，tbst缓冲液按照10分钟每次摇床洗三次。室温孵育二抗1小时，tbst缓冲液按照10分钟每次摇床洗三次。使用辣根过氧化物酶显色试剂盒进行条带显色，并使用化学发光成像系统拍照。用imagej软件进行条带的灰度检测以实现蛋白表达量的量化。
45.结果发现：跨膜电阻检测实验(如图1所示)和大分子荧光渗漏实验(如图2所示)均显示，2-溴棕榈酸(2-bp)可显著改善pa引起的睾丸支持细胞屏障损伤。蛋白质免疫荧光检测显示，2-bp不仅可提高紧密连接蛋白zo-1、occludin(ocln)、claudin-11(cldn11)和claudin-5(cldn5)的表达量(如图3所示)，亦可降低内质网应激标志性蛋白chop、grp78、atf4和atf6的表达量(如图4所示)。
46.实施例2：
47.2-溴棕榈酸在体内可显著改善脂代谢紊乱所致的生精功能障碍和血睾屏障损伤实例如下。
48.(1)实验材料选用：
49.动物选用4周龄icr雄鼠；2-bp和pa选用美国sigma公司的。2-bp使用乙醇配制成100mg/ml的储存液，实验时用生理盐水配置成5mg/ml工作液进行注射。pa使用bsa进行螯合，以生理盐水为溶剂，配制成20mm(约5.13mg/ml)的储存液(即工作液)。
50.(2)小鼠饲养条件：
51.小鼠在室温23-27℃、相对湿度40％-70％的环境中饲养，自由饮水和觅食；光照周期为12小时光照-12小时黑暗。小鼠适应性饲养1周后开始实验。
52.(3)小鼠分组与模型设置：
53.小鼠随机分为三组：2-bp pa组每日腹腔注射200mg/kg pa，隔日灌胃40mg/kg 2-bp；pa组每日腹腔注射200mg/kg pa，隔日灌胃与2-bp pa组等量的含乙醇生理盐水；对照组(control)每日腹腔注射等体积的bsa溶液(溶于生理盐水)，隔日灌胃与2-bp pa组等量的含乙醇生理盐水。实验时间持续30天。
54.(4)动物取材：
55.小鼠经水合氯醛麻醉后，摘除眼球取血，断颈处死后取睾丸和附睾。
56.(5)睾丸总蛋白质棕榈酰化水平检测：
57.小鼠睾丸取出后，经液氮速冻，切下1/4用于总蛋白质棕榈酰化检测。该检测使用酰基-生物素置换法。具体操作方法为：使用含有50mm n-乙基马来酰亚胺的ripa裂解液浸没组织，将组织剪碎后，进一步超声破碎。4℃条件下13000rpm离心15分钟，收集上清至新的1.5ml离心管，4℃旋转混匀过夜。冰丙酮沉淀蛋白，重悬于4％sds溶液(含4％sds、50mm tris和5mm edta，ph＝7.4)，每个样品平均分为2份：一份加等体积1.5m羟胺(ha)溶液，另一份加等体积0.1m tris-hcl溶液(ph＝7.4)。室温旋转混匀2小时后，冰丙酮沉淀蛋白，用4％sds溶液(含4％sds、50mm tris和5mm edta，ph＝6.2)重悬，加入4倍体积的bmcc-biotin溶液(含6.25μm bmcc-biotin、150mm nacl、50mm tris、5mm edta和0.2％triton x-100)，室温旋转混匀2小时。冰丙酮再次沉淀蛋白，2％sds溶液(含2％sds、50mm tris和5mm edta，ph＝7.4，使用前加入蛋白酶抑制剂)重悬溶解蛋白，bca法测定蛋白浓度，加入1/4体积5
×
蛋白上样缓冲液，98℃煮5分钟后，-80℃冰箱保存。电泳时，每样品等体积上样至page凝胶，电泳后转膜至pvdf膜，3％bsa室温封闭2小时，用辣根过氧化物酶结合的链霉亲和素(hrp-strep)室温孵育1小时，tbst清洗半小时后，使用辣根过氧化物酶显色试剂盒进行条带显色，并使用化学发光成像系统拍照。用imagej软件进行条带的灰度检测以实现蛋白表达量的量化。
58.(6)精子悬浮液制备及精子浓度计算：
59.从小鼠中取出的附睾，取附睾尾置于400μl htf溶液中，用注射器针头轻轻划拨，使精子从附睾尾游出。收集精子，37℃水浴孵育10分钟，吹打混匀后，casa检测精子浓度。
60.(7)精子活动率分析：
61.吸取步骤(6)中制备的精子悬浮液，滴于载玻片上，盖上盖玻片，casa检测精子活动率。
62.(8)体内fitc-i荧光渗漏实验检测血睾屏障完整性：
63.在处死小鼠前2小时，新鲜配置5mg/ml的fitc-i溶液(溶于pbs)，每只小鼠尾静脉注射200μl。解剖小鼠时，取单侧睾丸制备冷冻切片。荧光显微镜观察睾丸中fitc-i荧光渗漏入生精小管的情况。生精小管中出现荧光表示血睾屏障完整性受损。
64.(9)电镜观察紧密连接：
65.取小鼠睾丸组织，切出1mm3大小的组织块，浸于含有2.5％戊二醛的0.1m磷酸盐缓冲液进行固定，依次使用1％四氧化锇、2％乙酸双氧铀和柠檬酸铅进行染色。切片后使用透射电子显微镜进行观察。正常的紧密连接结构紧实且连续，紧密连接受损后该结构会变得松散、断裂。
66.结果发现：2-溴棕榈酸(2-bp)可有效降低pa注射引起的小鼠睾丸内蛋白质棕榈酰化水平异常升高(如图5所示)。对于pa引起的生精障碍，2-bp有显著的治疗效果，不仅提高
了精子浓度(如图6所示)，而且增加了精子活动率(如图7所示)。体内fitc-i荧光渗漏实验(如图8所示)和电镜观察(如图9所示)结果也显示，2-bp具有恢复血睾屏障完整性的功能。
67.如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。