一种可视化杂合细胞膜纳米递送体系及其制备方法和应用

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种可视化杂合细胞膜纳米递送体系及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肿瘤免疫治疗是一种革新性的癌症治疗方法，旨在激活或增强人体免疫系统，以识别和杀死癌细胞。尽管手术方法和其他治疗方式不断改进，但残留的微小肿瘤和循环中的肿瘤细胞(ctcs)仍然是癌症治疗的主要绊脚石。因此，亟需一种治疗策略能增强对术后残留肿瘤和ctcs的靶向能力，重塑术后的肿瘤微环境，并预防肿瘤的复发和转移。
3.r848是一种基于咪唑喹啉的小分子化合物，可被t细胞样受体(tlr)7/8识别，能够诱导抗肿瘤反应。据报道，r848在内小体中的识别导致抗原提呈细胞(apc)的激活和成熟，并诱导促炎性细胞因子、i型干扰素(ifn)和趋化因子的分泌。除了具有免疫刺激功能外，r848还可以调节免疫抑制细胞，例如髓样来源的抑制细胞(mdsc)和m2巨噬细胞。r848可以将mdscs转变为apc，如树突状细胞(dc)和巨噬细胞，并使肿瘤相关巨噬细胞(tam)从m2表型极化为m1表型。r848通过将免疫抑制性tam和mdsc极化为杀肿瘤性apc，而不是耗尽它们，从而使免疫抑制性肿瘤微环境调节到免疫原性微环境。由于tlr7/8存在于细胞内隔室，r848进入细胞对于免疫细胞的激活是必不可少的。但r848水溶性差，全身给药的生物利用度低。同时，它可能会引起白细胞快速减少和短期局部免疫缺陷等副作用。研究人员一般将r848制成纳米粒，以提高细胞对其的摄入。然而，r848是一类剂量依赖性药物，但静脉给药时纳米粒的被动靶向效果稍显不足。因此，如何通过精确的传递系统将免疫调节剂集中在病灶上，克服局部免疫耐受，实现有效治疗是一个重要问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种可视化杂合细胞膜纳米递送体系及其制备方法和应用，该可视化杂合细胞膜纳米递送体系利用两种细胞膜的特性实现对肿瘤的双重靶向作用，能够精准靶向术后残留肿瘤部位；此外，该可视化杂合细胞膜纳米递送体系能够降低药物的毒副作用，并通过荧光影像引导有效递送免疫药物r848重塑肿瘤微环境，诱导抗肿瘤免疫，并能配合近红外激光进行光热治疗，产生“肿瘤原位疫苗”，预防肿瘤的复发与转移。
5.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
6.本发明第一方面提供一种可视化杂合细胞膜纳米递送体系，所述可视化杂合细胞膜纳米递送体系包括纳米颗粒药物、吸附在所述纳米颗粒药物上的杂合细胞膜以及n-羟基琥珀酰亚胺修饰的近红外荧光试剂；
7.所述杂合细胞膜由血小板细胞膜和中性粒细胞膜融合而成；
8.所述n-羟基琥珀酰亚胺修饰的近红外荧光试剂与所述杂合细胞膜表面的氨基进行接和。
9.本发明中血小板和中性粒具有向伤口和炎症部位迁移的特性，主动靶向术后残留
肿瘤；细胞膜含有源细胞的脂质和蛋白质，并从源细胞继承了多种独特的能力。本发明可视化杂合细胞膜纳米递送体系利用血小板和中性粒的两种细胞膜特性实现对肿瘤的双重靶向作用，能够精准靶向术后残留肿瘤部位，通过荧光影像引导有效递送免疫药物r848重塑肿瘤微环境，诱导抗肿瘤免疫，并能配合近红外激光进行光热治疗，产生“肿瘤原位疫苗”，预防肿瘤的复发与转移；此外，该可视化杂合细胞膜纳米递送体系能够降低药物的毒副作用，提高给药安全性。
10.优选地，所述纳米颗粒药物为以牛血清白蛋白为载体形成的r848纳米颗粒。
11.本发明第二方面提供一种上述可视化杂合细胞膜纳米递送体系的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
12.(a)将血小板和中性粒分别依次进行低渗裂解、反复冻融和梯度离心，得到血小板细胞膜和中性粒细胞膜；
13.(b)将血小板细胞膜和中性粒细胞膜混合并采用超声破碎，得到纳米级杂合细胞膜；
14.(c)将纳米级杂合细胞膜通过静电吸附方式吸附到纳米颗粒药物上，即得所述可视化杂合细胞膜纳米递送体系。
15.优选地，所述步骤(c)中还包括：
16.将吸附杂合细胞膜的纳米颗粒药物与n-羟基琥珀酰亚胺修饰的近红外荧光试剂进行混合孵育和透析。
17.优选地，所述近红外荧光试剂为吲哚菁绿或新吲哚菁绿。
18.优选地，所述步骤(a)中，超声破碎次数为1～3次，每次超声破碎时间为4～6min，超声功率为750w，频率为20khz。
19.优选地，所述孵育温度为35～39℃，时间为1～3h。
20.优选地，所述纳米颗粒药物为以牛血清白蛋白为载体形成的r848纳米颗粒，所述r848纳米颗粒通过如下方法制得：
21.(1)将二硫苏糖醇添加到牛血清白蛋白溶液中并搅拌处理，得到混合溶液；
22.(2)向混合溶液中添加r848进行反应，待反应结束，向反应液中添加聚乙烯亚胺和2,2'-[丙烷-2,2-二基双-(硫代)]二乙酸并搅拌一段时间，再进行透析，得到r848纳米颗粒。
[0023]
优选地，所述步骤(1)中，二硫苏糖醇与牛血清白蛋白的摩尔比为(15～19)：1；
[0024]
优选地，所述步骤(1)中，牛血清白蛋白溶液的浓度为12～18mg/ml。
[0025]
优选地，所述步骤(1)中，搅拌处理时间为20～40min。
[0026]
优选地，所述步骤(2)中，所述聚乙烯亚胺为聚乙烯亚胺600；
[0027]
优选地，所述步骤(2)中，反应温度为室温，反应时间为40～120min；
[0028]
优选地，所述步骤(2)中，向混合溶液中添加r848进行反应具体包括：
[0029]
向混合溶液中添加含有r848的乙醇溶液进行反应，其中，含有r848的乙醇溶液的添加体积为混合溶液体积的1～1.2倍，含有r848的乙醇溶液浓度为1.2～1.8mg/ml；
[0030]
向反应液中添加聚乙烯亚胺和2,2'-[丙烷-2,2-二基双-(硫代)]二乙酸并搅拌一段时间具体包括：
[0031]
向反应液中添加聚乙烯亚胺溶液和2,2'-[丙烷-2,2-二基双-(硫代)]二乙酸并搅
拌1.5～3h，其中，聚乙烯亚胺溶液的质量体积浓度为1.2％～1.8％，反应液、聚乙烯亚胺溶液和2,2'-[丙烷-2,2-二基双-(硫代)]二乙酸的体积比为5∶(0.6～1.2)∶(0.6～1.2)。
[0032]
本发明r848纳米颗粒制备过程中，使用二硫苏糖醇(dtt)还原牛血清白蛋白(bsa)的二硫键，改变bsa的构象，r848通过亲疏水相互作用进入bsa空腔形成r848纳米颗粒，再通过聚乙烯亚胺和2-2`-[丙烷-2-2-二基
·
双(硫基)]二乙酸的交联作用使得r848纳米颗粒带正电；再通过带正电的r848纳米颗粒吸附杂合细胞膜碎片，杂合细胞膜与nhs修饰的近红外荧光试剂在孵育条件下使得nhs修饰之后带活性基团的近红外荧光试剂能与细胞膜上的氨基接合，最后形成可视化杂合细胞膜纳米递送体系。本发明上述制备方法实现简单，效率高，效果好，达到了应用的要求。
[0033]
本发明第三方面提供一种上述可视化杂合细胞膜纳米递送体系在制备免疫联合光热治疗肿瘤药物中的应用。
[0034]
本发明第四方面提供一种免疫联合光热治疗肿瘤药物，所述免疫联合光热治疗肿瘤药物包括上述可视化杂合细胞膜纳米递送体系。
[0035]
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
[0036]
本发明可视化杂合细胞膜纳米递送体系利用血小板和中性粒的两种细胞膜特性实现对肿瘤的双重靶向作用，能够精准靶向术后残留肿瘤部位，有效递送免疫药物r848重塑肿瘤微环境，诱导抗肿瘤免疫，并能配合近红外激光进行光热治疗，产生“肿瘤原位疫苗”，预防肿瘤的复发与转移；此外，该可视化杂合细胞膜纳米递送体系能够降低药物的毒副作用，提高给药安全性。
[0037]
本发明上述制备方法实现简单，效率高，效果好，达到了应用的要求。
附图说明
[0038]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
[0039]
图1为实验例第1部分中rnp、pnm和rnp@pnm的粒径分布；
[0040]
图2为实验例第1部分中rnp、pnm和rnp@pnm的表面zeta电位；
[0041]
图3为实验例第2部分中rnp@pnm的共聚焦成像图；
[0042]
图4为实验例第3部分中rnp和rnp@pnm的体外生物相容性；
[0043]
图5为实验例第4部分中rnp和rnp@pnm在术后小鼠不同器官以及肿瘤的靶向荧光成像；
[0044]
图6为实验例第4部分中rnp和rnp@pnm在术后小鼠不同器官以及肿瘤的相对荧光强度；
[0045]
图7为实验例第5部分中rnp和rnp@pnm在光热刺激下小鼠不同器官以及肿瘤的靶向荧光成像；；
[0046]
图8为实验例第5部分中rnp和rnp@pnm在光热刺激下小鼠不同器官以及肿瘤的相对荧光强度；
[0047]
图9为实验例第6部分中热成像图；
[0048]
图10为实验例第6部分中光热升温曲线；
[0049]
图11为实验例第7部分中不同治疗组的离体肿瘤照片；图12为实验例第7部分中不同治疗组的肿瘤生长曲线；
[0050]
图13为实验例第8部分中不同治疗组远端离体肿瘤照片；
[0051]
图14为实验例第8部分中不同治疗组的远端肿瘤生长曲线；
[0052]
图15为实验例第9部分中不同处理组肿瘤复发与转移的生物发光图；
[0053]
图16为实验例第9部分中不同处理组的肺染色图；
[0054]
图17为实验例第9部分中不同处理组小鼠的不同时间下的存活率。
具体实施方式
[0055]
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
[0056]
需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
[0057]
实施例1
[0058]
本实施例为一种可视化杂合细胞膜纳米递送体系的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[0059]
(a)r848纳米颗粒(记为rnp)的制备：
[0060]
将二硫苏糖醇添加到15mg/ml的牛血清白蛋白溶液中并搅拌处理30min，得到混合溶液，其中，二硫苏糖醇与牛血清白蛋白的摩尔比为17∶1；
[0061]
向混合溶液中添加含有r848的乙醇溶液于室温下反应40～120min，待反应结束，向反应液中添加聚乙烯亚胺600溶液和2,2'-[丙烷-2,2-二基双-(硫代)]二乙酸并搅拌2h，再进行透析，得到rnp，其中，含有r848的乙醇溶液的添加体积为混合溶液体积的1.1倍，含有r848的乙醇溶液浓度为1.5mg/ml，聚乙烯亚胺600溶液的质量体积浓度为1.5％，反应液、聚乙烯亚胺溶液和2,2'-[丙烷-2,2-二基双-(硫代)]二乙酸的体积比为5∶1∶1；
[0062]
(b)血小板细胞膜(记为pm)和中性粒细胞膜(记为nm)的制备：
[0063]
将血小板和中性粒分别依次进行低渗裂解、反复冻融和梯度离心，得到血小板细胞膜和中性粒细胞膜，具体地，
[0064]
pm的制备：血小板加入低渗溶液(含10ug/ml蛋白酶抑制剂的纯水溶液)，4℃裂解24h，细胞悬液用液氮和37℃水浴反复冻融两次(5分钟速冻，震荡快速溶解)，4℃，800xg离心15min,收集上清液，4℃，10000xg离心30min，收集沉淀即为pm；
[0065]
nm的制备：中性粒在含100ng/ml lps的1640培养基中培养3小时激活，离心去掉培养基，加入低渗溶液(含10ug/ml蛋白酶抑制剂的纯水溶液)，4℃裂解24h，细胞悬液用液氮和37℃水浴反复冻融两次(5分钟速冻，震荡快速溶解)，4℃，800xg离心10min,收集上清液，4℃，7000xg离心30min,收集上清液，4℃，20000xg离心1h，收集沉淀即为nm；
[0066]
(c)将血小板细胞膜和中性粒细胞膜混合并采用超声破碎仪不间断以750w,20khz，在4℃超声处理5min，超声破碎两次，得到纳米级杂合细胞膜(记为pnm)，其中，pm和nm的质量比为1：3；
[0067]
(d)将纳米级杂合细胞膜通过静电吸附方式吸附到纳米颗粒药物上(得到的材料
记为rnp@pnm)，其中rnp和pnm的质量比为5：2，然后，再与n-羟基琥珀酰亚胺修饰的新吲哚菁绿(记为ir-820-nhs)进行混合在37℃下孵育2h，再经透析，即得上述可视化杂合细胞膜纳米递送体系(记为rnp@pnm-ir)。
[0068]
对比例1
[0069]
本对比例为一种负载n-羟基琥珀酰亚胺修饰的新吲哚菁绿的r848纳米颗粒(记为rnp-ir)的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[0070]
将rnp与ir-820-nhs在室温下搅拌混合6h，再经透析，即得rnp-ir。
[0071]
对比例2
[0072]
本对比例为一种负载n-羟基琥珀酰亚胺修饰的新吲哚菁绿的杂合细胞膜(记为pnm-ir)的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
[0073]
将pnm与ir-820-nhs进行混合在37℃下孵育2h，20000xg离心1h收集沉淀,即得pnm-ir。
[0074]
实验例
[0075]
1、粒径和zata点位的测定通过原子力显微镜和动态光散射粒度分析仪检测实施例1中rnp、pnm、rnp@pnm的粒度和zeta电位，其粒径分布如图1所示；zata电位分析结果如图2所示；
[0076]
由图1、图2可知：r848纳米颗粒(rnp)的平均粒径在150nm左右，杂合细胞膜(pnm)的平均粒径在200nm左右，吸附杂合细胞膜的r848纳米颗粒(rnp@pnm)的平均粒径在180nm左右。rnp表面电荷为正，pnm表面电荷为负，rnp@pnm表面电荷为正。
[0077]
2、实施例1中rnp@pnm的共聚焦成像
[0078]
共聚焦荧光成像用来确定两种细胞膜和r848纳米颗粒是否融合。膜融合前，血小板膜和中性粒膜分别用dio和did标记，r848用尼罗红代替。杂合细胞膜纳米粒制成后，将其固定在甘油中，在激光共聚焦扫描显微镜下观察；观察结果如图3所示，图中，红色代表血小板细胞膜(pm)，绿色代表r848纳米颗粒(rnp)，蓝色代表中性粒细胞膜(nm)。
[0079]
由图3可知：三种荧光信号的共定位确定了血小板细胞膜、中性粒细胞膜和r848纳米颗粒的融合。
[0080]
3、细胞毒性测定
[0081]
对实施例1中rnp和rnp@pnm的细胞毒性进行检测，检测方法如下：
[0082]
将raw264.7细胞以每孔1
×
104细胞密度接种于96孔板中，培养12小时后，加不同浓度(1、2.5、5、10μg/ml)的rnp或rnp@pnm在37℃、5％co2条件下孵育24h，用mts检测细胞活力，检测结果如图4所示；
[0083]
由图4可知：本发明rnp@pnm对细胞几乎无毒，体外生物相容性良好。
[0084]
4、术后肿瘤靶向荧光成像的研究
[0085]
为了确定rnp和rnp@pnm对术后肿瘤的靶向作用，balb/c小鼠右侧皮下接种1
×
10
6 4t1细胞。当肿瘤体积增长到约200mm3时，手术切除一部分肿瘤建立术后肿瘤模型。通过尾静脉注射rnp或rnp@pnm，r848用尼罗红(15ug)代替。使用小动物成像系统在指定时间对小鼠进行活体荧光成像。然后解剖小鼠，获得主要器官和肿瘤的荧光分布图。不同器官荧光成像结果如图5所示，不同器官相对荧光强度如图6所示；
[0086]
由图5和图6可知：与rnp相比，rnp@pnm对术后肿瘤靶向效果更好，药物在肿瘤部位
有更多的蓄积，并减少了在肝脏部位的分布。
[0087]
5、光热刺激下肿瘤靶向荧光成像研究
[0088]
为了确定rnp和rnp@pnm对光热刺激后肿瘤的靶向作用，balb/c小鼠右侧皮下接种1
×
10
6 4t1细胞。当肿瘤体积增长到约200mm3时，尾静脉注射pnm-ir，24小时后进行激光照射，将肿瘤部位暴露于808nm激光(1w/cm2)5分钟。然后通过尾静脉注射rnp或rnp@pnm，r848用尼罗红(15ug)代替。使用小动物成像系统在指定时间对小鼠进行活体荧光成像。然后解剖小鼠，获得主要器官和肿瘤的荧光分布图。不同器官荧光成像结果如图7所示，不同器官相对荧光强度如图8所示；
[0089]
由图7、图8可知：与rnp相比，rnp@pnm对光热刺激后肿瘤靶向效果更好，药物在肿瘤部位有更多的蓄积。
[0090]
6、体外光热效率研究
[0091]
为了确定ir820-nhs在体外的光热效应强度，分别用ep管装100μl pbs、ir820-nhs(记为ir)、rnp-ir和rnp@pnm-ir(ir820-nhs含量为15μg)。用808激光器(1w/cm2)照射覆盖ep管，用热成像仪观测5分钟内肿瘤的升温情况并绘制曲线，热成像如图9所示，温度变化曲线如图10所示；
[0092]
由图9、图10可知：rnp-ir和rnp@pnm-ir都保留了ir820-nhs的光热效率，能在体外5分钟内升到并维持在45℃左右。
[0093]
7、体内抑瘤效果研究
[0094]
对于原发性肿瘤的治疗，balb/c小鼠在背部右侧皮下接种1
×
10
6 4t1细胞，在4t1荷瘤小鼠肿瘤体积约150mm3时手术切除90％肿瘤，建立术后肿瘤模型。用不同的治疗方式进行治疗，包括pbs、rnp-ir、rnp@pnm-ir、pnm-ir laser、rnp-ir laser、rnp@pnm-ir laser、rnp@pnm-ir laser acd47(r848：每只小鼠40μg)；注射后48小时进行激光照射，将肿瘤部位暴露于808nm激光(1w/cm2)5分钟，照射后再注射一次药物；这些注射和照射治疗重复一次，间隔一周；用数显卡尺测量肿瘤体积，计算为l
×w×
w/2(l，最长尺寸；w，最短尺寸)；监测肿瘤生长并绘制曲线；用数显卡尺测量不同组肿瘤。离体肿瘤如图11所示；肿瘤生长曲线如图12所示；
[0095]
由图11、图12可知：rnp@pnm-ir制剂与光热联合能有效抑制肿瘤生长，并揭示了与抗cd47抗体协同治疗的潜力。
[0096]
8、远端肿瘤抑制效果研究
[0097]
在原发性肿瘤第一次治疗后(即在原发性肿瘤手术切除90％当天)，于小鼠背部左侧皮下接种5
×
10
5 4t1细胞，建立远端肿瘤模型。分组包括pbs、rnp@pnm-ir、pnm-ir laser、rnp@pnm-ir laser、rnp@pnm-ir laser acd47；原侧肿瘤注射48小时后进行激光照射，将肿瘤部位暴露于808nm激光(1w/cm2)5分钟，照射后再注射一次药物；这些注射和照射治疗重复一次，间隔一周；远端肿瘤不治疗处理。用数显卡尺测量肿瘤体积，计算为l
×w×
w/2(l，最长尺寸；w，最短尺寸)；监测肿瘤生长并绘制曲线；用数显卡尺测量不同组肿瘤，离体远端肿瘤如图13所示；肿瘤生长曲线如图14所示；
[0098]
由图13、图14可知：rnp@pnm-ir制剂与光热联合能有效激发全身免疫效应，抑制远端肿瘤的生长。
[0099]
9、肿瘤复发与转移抑制效果研究
[0100]
原发性肿瘤改用荧光素酶标记的4t1(4t1-luc)皮下接种，经过两轮药物注射和激光治疗后，手术移除全部肿瘤，建立肿瘤再复发和转移模型。分组包括pbs、rnp@pnm-ir laser、rnp@pnm-ir laser acd47。通过肿瘤细胞的生物发光监测肿瘤复发和转移负荷，使用ivis系统在指定时间点进行活体生物发光成像。用布安溶液固定染色肺组织，进一步观察肺转移情况。每日记录各组小鼠存活情况，各组小鼠数量n＝8，绘制生存率曲线。第33天、42天各组肿瘤复发与转移情况如图15所示；肺转移染色如图16所示；存活率曲线如图17所示；
[0101]
由图15～17可知：在经过rnp@pnm-ir制剂与光热联合治疗后，能有效控制肿瘤的复发与转移，并显著延长小鼠的存活时间。
[0102]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。