用于除皱的生物细胞肽组合物及其制备方法与流程

1.本发明涉及多肽的制备技术领域，尤其涉及一种用于除皱的生物细胞肽组合物及其制备方法。


背景技术：

2.胶原蛋白是构成结缔组织细胞外基质的主要结构蛋白，由于其高度的生物相容性和生物可降解性，使其具有良好的细胞适应能力，广泛应用于组织再生、制药、食品和化妆品等生物行业。胶原蛋白与其他类型的生物材料相比，其免疫原性相对较低；因此，为了进一步在生物技术中利用胶原蛋白，它常经蛋白质酶解工序加工成胶原蛋白肽。胶原蛋白肽分子量低，对水的溶解度好，具有愈合伤口、骨再生、抗皮肤老化等多种功能。胶原蛋白酶解后成为小分子量的多肽，与高分子量的天然胶原蛋白相比，更容易渗透到皮肤深层。它们在成纤维细胞生长、胶原蛋白表达和表皮强胶原纤维形成中可以发挥重要作用。此外，它们是通过增加角质层的含水量来改善皮肤功能的关键分子成分。因此，胶原蛋白肽被广泛应用于化妆品中，以维持皮肤稳态和修复受损皮肤层，达到去皱的效果。通过酶解从深海鱼类胶原蛋白中提取的胶原蛋白肽，其分子量比从陆生动物中提取的胶原蛋白肽要低，更有利于皮肤的吸收及利用。
3.专利cn 202110938911.9公开了一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽的制备方法以及鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，以鱼皮为原料，将鱼皮经预处理、胃蛋白酶提取胶原蛋白、调节等电点、双水相萃取纯化胶原蛋白、碱性蛋白酶酶解成胶原蛋白肽、葡聚糖凝胶分离得到小分子鱼皮胶原蛋白肽。专利cn 201410274645.4提供了一种酶法制备具有促进伤口愈合活性的海洋胶原蛋白肽的方法，由酶法结合膜分离技术从海鲈鱼加工副产物中制备具有伤口愈合作用的高活性的生物活性。上述专利都没有对酶的回收利用进行优化改进，实际生产中可能出现酶的使用率低下，当酶的采购价格较高时会增加胶原蛋白肽的生产成本等技术问题。


技术实现要素：

4.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所解决的技术问题是：(1)制备一种用于除皱的生物细胞肽组合物，所述用于除皱的生物细胞肽组合物结构稳定，具有良好的抗氧化能力；(2)制备一种载酶粒子，为酶的回收创造条件，解决酶利用率较低的技术问题；(3)解决载酶粒子中酶固定化后运动受阻，难以与底物充分接触进行酶解反应的技术问题。
5.脂质体具有无毒、可生物降解和生物相容性佳的优先，能够将有效成分输送到体内，广泛应用于制药和化妆品的生产之中。然而发明人发现，脂质体不易溶于水，其在水中的低稳定性通过促进磷脂的氧化和水解降低了结构的完整性，导致通过皮肤层的渗透性低。为了解决这一技术问题，发明人使用胶原蛋白肽粉、大豆卵磷脂、月桂基葡糖苷制备了一种用于除皱的生物细胞肽组合物；所述生物细胞肽组合物由胶原蛋白肽与大豆卵磷脂形成脂质体，以月桂基葡糖苷作为脂质体双层膜之间的边缘激活剂，由大豆卵磷脂诱导脂质
体的高径向曲率，从而增加脂质体的形变能力，增加和胶原蛋白肽的结合能力，进而提高结构的完整性，提升了胶原蛋白肽的抗氧化性。
6.一种用于除皱的生物细胞肽组合物的制备方法，包括下述步骤：通过载酶纳米二氧化硅对鳕鱼胶原蛋白进行酶解，离心取上清液冷冻干燥得到胶原蛋白粉；将胶原蛋白粉、大豆卵磷脂、月桂基葡糖苷溶于乙醇中摇匀，去除乙醇，得到脂质体；将脂质体经超声处理分散于水中，冷冻干燥，得到所述用于除皱的生物细胞肽组合物；
7.所述载酶纳米二氧化硅为枯草杆菌蛋白酶在戊二醛活化下与纳米二氧化硅表面有机分子链端的氨基结合制备得到；所述有机分子链含有供酶自由旋转移动的醚键。
8.优选的，一种用于除皱的生物细胞肽组合物的制备方法，包括下述步骤：
9.(1)使用氢氧化钠水溶液对鳕鱼皮进行碱处理；将碱处理产物置于酒石酸水溶液中，沉淀、过滤得滤液、冷冻干燥，得到鳕鱼胶原蛋白粉；
10.(2)将纳米四氧化三铁、硅酸钠、甲苯经分散于水中，形成混合乳液；向所述混合乳液中加入硝酸水溶液，进行第一级反应；第一级反应结束后继续加入乙醇，进行第二级反应，第二级反应结束后经过滤得滤饼、醇洗、水洗、干燥，得到多孔纳米二氧化硅；
11.(3)无氧条件下，将所述多孔纳米二氧化硅和环氧丁基三甲氧基硅烷分散于乙醇，进行硅烷化反应，反应结束后过滤得滤饼、醇洗、水洗、干燥，得到硅烷化多孔纳米二氧化硅；将所述硅烷化多孔纳米二氧化硅和聚醚胺分散于水中，进行脱氢偶联反应，反应结束后过滤得滤饼、醇洗、水洗、干燥，得到氨基化多孔纳米二氧化硅；
12.(4)将所述氨基化多孔纳米二氧化硅和戊二醛分散于磷酸盐缓冲液中，进行活化反应，活化反应结束后经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤，得到活化多孔纳米二氧化硅；将所述活化多孔纳米二氧化硅再次分散于磷酸盐缓冲液中，继续加入枯草杆菌蛋白酶，进行固定化反应，反应产物经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤、冷冻干燥，得到载酶纳米二氧化硅；
13.(5)将所述鳕鱼胶原蛋白粉分散于水，加入所述载酶纳米二氧化硅并进行水解，水解产物经离心得上清液、冷冻干燥，得到胶原蛋白肽粉；
14.(6)将所述胶原蛋白肽粉、大豆卵磷脂、月桂基葡糖苷溶于乙醇中摇匀，去除乙醇，得到脂质体；将脂质体经超声处理分散于水中，冷冻干燥，得到所述用于除皱的生物细胞肽组合物。
15.鳕鱼胶原蛋白水解为胶原蛋白肽的过程需要酶的参与，传统的水解工艺一般直接加入酶，水解完成后将酶经过灭活后分离。所述加工方式中酶的利用是一次性的，使用率低下，当酶的采购价格较高时会增加胶原蛋白肽的生产成本。因此，将酶负载于具有磁性的载体制成可回收利用的固定化酶是一种可行的途径。针对这一技术问题，发明人将具有磁性的纳米四氧化三铁与二氧化硅结合，制备了一种具有磁性的多孔纳米二氧化硅；所述多孔纳米二氧化硅比表面积大，能够提高酶的负载效率；酶和多孔纳米二氧化硅结合后形成的载酶颗粒可以在酶解结束后通过磁场收集，无需灭活，为酶的二次利用创造了条件。
16.在实际的使用中发明人观察到，相比于游离态的酶，固定化酶的水解效率较低，最终多肽得率不及游离态酶。产生这种现象的原因可能在于，将酶负载于载体后，由于表面拥挤受到空间阻碍或无法自由旋转，酶难以和底物充分接触并进行反应。为了解决这一技术问题，发明人做出改进，对多孔纳米二氧化硅粒子进行烷硅化及脱氢偶联处理，在二氧化硅
表面引入有机分子链，所述有机分子链含有醚键，醚键内聚能低，并易旋转，可以为酶的运动提供合适的空间条件；同时有机分子链的链端为氨基，可在戊二醛活化下与酶反应并连结，达到酶的固定化。采用上述方法制备的载酶纳米二氧化硅中，酶通过能够灵活运动旋转的长分子链与二氧化硅颗粒相连，固定的同时大大增加了与底物的接触能力，从而提升了酶解的效率。
17.进一步优选的，一种用于除皱的生物细胞肽组合物的制备方法，包括下述步骤，以重量份计：
18.s1在0～4℃温度下，使用65～80份浓度为3.5～8wt％的氢氧化钠水溶液对7.5～20份鳕鱼皮进行碱处理；将碱处理产物置于45～60份浓度为0.15～0.35wt％的酒石酸水溶液中，沉淀、过滤得滤液、冷冻干燥，得到鳕鱼胶原蛋白粉；
19.s2将1.75～3份纳米四氧化三铁、4～6份硅酸钠、6～10份甲苯经分散于16～20份水中，形成混合乳液；向所述混合乳液中加入10～16份浓度为1～1.5mol/l的硝酸水溶液，进行第一级反应；第一级反应结束后继续加入7.5～12份乙醇，进行第二级反应，第二级反应结束后经过滤得滤饼、醇洗、水洗、干燥，得到多孔纳米二氧化硅；
20.s3无氧条件下，将所述多孔纳米二氧化硅和14～20份环氧丁基三甲氧基硅烷分散于40～60份乙醇，进行硅烷化反应，反应结束后过滤得滤饼、醇洗、水洗、干燥，得到硅烷化多孔纳米二氧化硅；将所述硅烷化多孔纳米二氧化硅和6～9.5份聚醚胺分散于35～50份水中，进行脱氢偶联反应，反应结束后过滤得滤饼、醇洗、水洗、干燥，得到氨基化多孔纳米二氧化硅；
21.s4将所述氨基化多孔纳米二氧化硅和1.6～2.8份戊二醛分散于18～30份磷酸盐缓冲液中，进行活化反应，活化反应结束后经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤，得到活化多孔纳米二氧化硅；将所述活化多孔纳米二氧化硅再次分散于18～30份磷酸盐缓冲液中，继续加入0.06～0.3份枯草杆菌蛋白酶，进行固定化反应，反应产物经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤、冷冻干燥，得到载酶纳米二氧化硅；
22.s5将所述鳕鱼胶原蛋白粉分散于50～80份水，加入所述载酶纳米二氧化硅并进行水解，水解产物经离心得上清液、冷冻干燥，得到胶原蛋白肽粉；
23.s6将所述胶原蛋白肽粉、5～12份大豆卵磷脂、0.35～0.5份月桂基葡糖苷溶于18～30份乙醇中摇匀，去除乙醇，得到脂质体；将脂质体经超声处理分散于水中，冷冻干燥，得到所述用于除皱的生物细胞肽组合物。
24.优选的，步骤s1中所述碱处理的温度为28～36℃，处理时间为0.5～2h。
25.优选的，步骤s2中所述第一级反应的温度为20～25℃，反应时间为0.5～1h。
26.优选的，步骤s2中所述第二级反应的温度为45～60℃，反应时间为6～12h。
27.优选的，步骤s3中所述硅烷化反应的温度为55～70℃，反应时间为2～6h。
28.优选的，步骤s3中所述脱氢偶联反应的温度为45～60℃，反应时间为8～18h。
29.优选的，步骤s4中所述活化反应的温度为15～20℃，反应时间为1～3h。
30.优选的，步骤s4中所述固定化反应的温度为18～24℃，反应时间为6～12h。
31.优选的，步骤s4中所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：取250ml摩尔浓度为0.2mol/l磷酸二氢钾水溶液和118ml摩尔浓度为0.2mol/l氢氧化钠水溶液混合，用水稀释至1000ml，摇匀后即得ph为7.0的磷酸盐缓冲液。
32.优选的，步骤s5中所述水解的温度为28～36℃，水解时间为1～2h。
33.优选的，步骤s5中所述离心的转速为9000～12000rpm，离心时间为15～45min。
34.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以任意组合，即得本发明各较佳实施例。
35.本发明配方中部分原料的介绍及作用如下：
36.纳米四氧化三铁：无机物，具有磁性的黑色颗粒，不溶于水、碱溶液及乙醇、乙醚等有机溶剂，具有较大比比表面积。本发明中作为制备多孔纳米二氧化硅的原料。
37.硅酸钠：无机物，是一种可溶性的无机硅酸盐，其水溶液俗称水玻璃。本发明中作为制备多孔纳米二氧化硅的原料。
38.环氧丁基三甲氧基硅烷：有机物，本发明中作为烷硅化的原料。
39.聚醚胺：主链为聚醚结构，末端活性官能团为胺基的聚合物。本发明中作为制备载酶纳米二氧化硅的原料。
40.枯草杆菌蛋白酶：芽孢杆菌属细菌所分泌的胞外碱性蛋白酶，催化水解蛋白质为氨基酸，在有机溶剂中也能催化多肽的合成。
41.大豆卵磷脂：又称大豆蛋黄素，是精制大豆油过程中的副产品，大豆卵磷脂中含有卵磷脂、脑磷脂等，具延缓衰老、预防心脑血管疾病等作用。
42.月桂基葡糖苷：有机物，烷基糖苷类的表面活性剂，在烷基糖苷类中的清洁效果最好，起泡细腻，同时也比较温和，对皮肤和眼睛的刺激性也比较小，在化妆品、护肤品里主要作用是增泡剂、清洁剂、增稠剂、表面活性剂。
43.本发明的有益效果：
44.与现有技术相比，本发明使用胶原蛋白肽粉、大豆卵磷脂、月桂基葡糖苷制备了一种用于除皱的生物细胞肽组合物，由胶原蛋白肽与大豆卵磷脂形成脂质体，以月桂基葡糖苷作为脂质体双层膜之间的边缘激活剂，由大豆卵磷脂诱导脂质体的高径向曲率，从而增加脂质体的形变能力，增加和胶原蛋白肽的结合能力，进而提高结构的完整性，提升了胶原蛋白肽的抗氧化性。
45.相比现有技术，本发明将具有磁性的纳米四氧化三铁与二氧化硅结合，制备了一种具有磁性的多孔纳米二氧化硅，其比表面积大，能够提高酶的负载效率，并且酶和多孔纳米二氧化硅结合后形成的载酶颗粒可以在酶解结束后通过磁场收集，无需灭活，为酶的二次利用创造了条件。
46.与现有技术相比，本发明对多孔纳米二氧化硅粒子进行烷硅化及脱氢偶联处理，在二氧化硅表面引入有机分子链，所述有机分子链含有醚键，醚键内聚能低，并易旋转，可以为酶的运动提供合适的空间条件，同时有机分子链的链端为氨基，可在戊二醛活化下与酶反应并连结，达到酶的固定化；酶通过能够灵活运动旋转的长分子链与二氧化硅颗粒相连，固定的同时大大增加了与底物的接触能力，从而提升了酶解的效率。
具体实施方式
47.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
48.本发明对照例及实施例中部分原材料参数如下：
49.环氧丁基三甲氧基硅烷，cas号：7335-84-4；
50.聚醚胺，cas号：9046-10-0；
51.枯草杆菌蛋白酶，酶活力：10万u/g，cas号：42613-33-2；
52.月桂基葡糖苷，cas号：110615-47-9。
53.实施例中所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：取250ml摩尔浓度为0.2mol/l磷酸二氢钾水溶液和118ml摩尔浓度为0.2mol/l氢氧化钠水溶液混合，用水稀释至1000ml，摇匀后即得ph为7.0的磷酸盐缓冲液。
54.实施例1
55.一种用于除皱的生物细胞肽组合物的制备方法，包括下述步骤，以重量份计：
56.s1在4℃温度下，使用65kg浓度为4.5wt％的氢氧化钠水溶液对12.5kg鳕鱼皮进行碱处理；将碱处理产物置于45kg浓度为0.25wt％的酒石酸水溶液中，沉淀、过滤得滤液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到鳕鱼胶原蛋白粉；
57.s2将4.8kg硅酸钠、6kg甲苯经分散于16kg水中，形成混合乳液；向所述混合乳液中加入12kg浓度为1mol/l的硝酸水溶液，进行第一级反应；第一级反应结束后继续加入7.5kg乙醇，进行第二级反应，第二级反应结束后经过滤得滤饼、乙醇洗3次、去离子水洗3次、干燥，得到多孔纳米二氧化硅；
58.s3将所述多孔纳米二氧化硅和2.2kg戊二醛分散于24kg磷酸盐缓冲液中，进行活化反应，活化反应结束后经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤3次，得到活化多孔纳米二氧化硅；将所述活化多孔纳米二氧化硅再次分散于24kg磷酸盐缓冲液中，继续加入0.18kg枯草杆菌蛋白酶，进行固定化反应，反应产物经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤3次、冷冻干燥，得到载酶纳米二氧化硅；
59.s4将所述鳕鱼胶原蛋白粉分散于50份去离子水，加入所述载酶纳米二氧化硅并进行水解，水解产物经离心得上清液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到胶原蛋白肽粉；
60.s5将所述胶原蛋白肽粉、7.5kg大豆卵磷脂、0.35kg月桂基葡糖苷溶于18kg乙醇中并摇匀，去除乙醇，得到脂质体；将脂质体经超声处理分散于水中，冷冻干燥，得到所述用于除皱的生物细胞肽组合物。
61.步骤s1中所述碱处理的温度为28℃，处理时间为1.5h。
62.步骤s2中所述第一级反应的温度为20℃，反应时间为1h。
63.步骤s2中所述第二级反应的温度为52℃，反应时间为8h。
64.步骤s3中所述活化反应的温度为15℃，反应时间为1.5h。
65.步骤s3中所述固定化反应的温度为24℃，反应时间为6h。
66.步骤s4中所述水解的温度为30℃，水解时间为1h。
67.步骤s4中所述离心的转速为9000rpm，离心时间为30min。
68.实施例2
69.一种用于除皱的生物细胞肽组合物的制备方法，包括下述步骤，以重量份计：
70.s1在4℃温度下，使用65kg浓度为4.5wt％的氢氧化钠水溶液对12.5kg鳕鱼皮进行碱处理；将碱处理产物置于45kg浓度为0.25wt％的酒石酸水溶液中，沉淀、过滤得滤液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到鳕鱼胶原蛋白粉；
71.s2将1.75kg纳米四氧化三铁、4.8kg硅酸钠、6kg甲苯经分散于16kg水中，形成混合乳液；向所述混合乳液中加入12kg浓度为1mol/l的硝酸水溶液，进行第一级反应；第一级反应结束后继续加入7.5kg乙醇，进行第二级反应，第二级反应结束后经过滤得滤饼、乙醇洗3次、去离子水洗3次、干燥，得到多孔纳米二氧化硅；
72.s3将所述多孔纳米二氧化硅和2.2kg戊二醛分散于24kg磷酸盐缓冲液中，进行活化反应，活化反应结束后经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤3次，得到活化多孔纳米二氧化硅；将所述活化多孔纳米二氧化硅再次分散于24kg磷酸盐缓冲液中，继续加入0.18kg枯草杆菌蛋白酶，进行固定化反应，反应产物经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤3次、冷冻干燥，得到载酶纳米二氧化硅；
73.s4将所述鳕鱼胶原蛋白粉分散于50份去离子水，加入所述载酶纳米二氧化硅并进行水解，水解产物经离心得上清液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到胶原蛋白肽粉；
74.s5将所述胶原蛋白肽粉、7.5kg大豆卵磷脂、0.35kg月桂基葡糖苷溶于18kg乙醇中并摇匀，去除乙醇，得到脂质体；将脂质体经超声处理分散于水中，冷冻干燥，得到所述用于除皱的生物细胞肽组合物。
75.步骤s1中所述碱处理的温度为28℃，处理时间为1.5h。
76.步骤s2中所述第一级反应的温度为20℃，反应时间为1h。
77.步骤s2中所述第二级反应的温度为52℃，反应时间为8h。
78.步骤s3中所述活化反应的温度为15℃，反应时间为1.5h。
79.步骤s3中所述固定化反应的温度为24℃，反应时间为6h。
80.步骤s4中所述水解的温度为30℃，水解时间为1h。
81.步骤s4中所述离心的转速为9000rpm，离心时间为30min。
82.实施例3
83.一种用于除皱的生物细胞肽组合物的制备方法，包括下述步骤，以重量份计：
84.s1在4℃温度下，使用65kg浓度为4.5wt％的氢氧化钠水溶液对12.5kg鳕鱼皮进行碱处理；将碱处理产物置于45kg浓度为0.25wt％的酒石酸水溶液中，沉淀、过滤得滤液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到鳕鱼胶原蛋白粉；
85.s2将1.75kg纳米四氧化三铁、4.8kg硅酸钠、6kg甲苯经分散于16kg水中，形成混合乳液；向所述混合乳液中加入12kg浓度为1mol/l的硝酸水溶液，进行第一级反应；第一级反应结束后继续加入7.5kg乙醇，进行第二级反应，第二级反应结束后经过滤得滤饼、乙醇洗3次、去离子水洗3次、干燥，得到多孔纳米二氧化硅；
86.s3氮气保护下，将所述多孔纳米二氧化硅和14kg环氧丁基三甲氧基硅烷分散于48kg乙醇中并摇匀，进行硅烷化反应，反应结束后过滤得滤饼、乙醇洗3次、去离子水洗3次、干燥，得到硅烷化多孔纳米二氧化硅；
87.s4将所述硅烷化多孔纳米二氧化硅和2.2kg戊二醛分散于24kg磷酸盐缓冲液中，进行活化反应，活化反应结束后经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤3次，得到活化多孔纳米二氧化硅；将所述活化多孔纳米二氧化硅再次分散于24kg磷酸盐缓冲液中，继续加入0.18kg枯草杆菌蛋白酶，进行固定化反应，反应产物经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤3次、冷冻干燥，得到载酶纳米二氧化硅；
88.s5将所述鳕鱼胶原蛋白粉分散于50份去离子水，加入所述载酶纳米二氧化硅并进
行水解，水解产物经离心得上清液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到所述用于除皱的生物细胞肽组合物。
89.步骤s1中所述碱处理的温度为28℃，处理时间为1.5h。
90.步骤s2中所述第一级反应的温度为20℃，反应时间为1h。
91.步骤s2中所述第二级反应的温度为52℃，反应时间为8h。
92.步骤s3中所述硅烷化反应的温度为65℃，反应时间为4h。
93.步骤s4中所述活化反应的温度为15℃，反应时间为1.5h。
94.步骤s4中所述固定化反应的温度为24℃，反应时间为6h。
95.步骤s5中所述水解的温度为30℃，水解时间为1h。
96.步骤s5中所述离心的转速为9000rpm，离心时间为30min。
97.实施例4
98.一种用于除皱的生物细胞肽组合物的制备方法，包括下述步骤，以重量份计：
99.s1在4℃温度下，使用65kg浓度为4.5wt％的氢氧化钠水溶液对12.5kg鳕鱼皮进行碱处理；将碱处理产物置于45kg浓度为0.25wt％的酒石酸水溶液中，沉淀、过滤得滤液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到鳕鱼胶原蛋白粉；
100.s2将1.75kg纳米四氧化三铁、4.8kg硅酸钠、6kg甲苯经分散于16kg水中，形成混合乳液；向所述混合乳液中加入12kg浓度为1mol/l的硝酸水溶液，进行第一级反应；第一级反应结束后继续加入7.5kg乙醇，进行第二级反应，第二级反应结束后经过滤得滤饼、乙醇洗3次、去离子水洗3次、干燥，得到多孔纳米二氧化硅；
101.s3氮气保护下，将所述多孔纳米二氧化硅和14kg环氧丁基三甲氧基硅烷分散于48kg乙醇，进行硅烷化反应，反应结束后过滤得滤饼、乙醇洗3次、去离子水洗3次、干燥，得到硅烷化多孔纳米二氧化硅；
102.s4将所述硅烷化多孔纳米二氧化硅和2.2kg戊二醛分散于24kg磷酸盐缓冲液中，进行活化反应，活化反应结束后经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤3次，得到活化多孔纳米二氧化硅；将所述活化多孔纳米二氧化硅再次分散于24kg磷酸盐缓冲液中，继续加入0.18kg枯草杆菌蛋白酶，进行固定化反应，反应产物经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤3次、冷冻干燥，得到载酶纳米二氧化硅；
103.s5将所述鳕鱼胶原蛋白粉分散于50份去离子水，加入所述载酶纳米二氧化硅并进行水解，水解产物经离心得上清液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到胶原蛋白肽粉；
104.s6将所述胶原蛋白肽粉、7.5kg大豆卵磷脂、0.35kg月桂基葡糖苷溶于18kg乙醇中并摇匀，去除乙醇，得到脂质体；将脂质体经超声处理分散于水中，冷冻干燥，得到所述用于除皱的生物细胞肽组合物。
105.步骤s1中所述碱处理的温度为28℃，处理时间为1.5h。
106.步骤s2中所述第一级反应的温度为20℃，反应时间为1h。
107.步骤s2中所述第二级反应的温度为52℃，反应时间为8h。
108.步骤s3中所述硅烷化反应的温度为65℃，反应时间为4h。
109.步骤s4中所述活化反应的温度为15℃，反应时间为1.5h。
110.步骤s4中所述固定化反应的温度为24℃，反应时间为6h。
111.步骤s5中所述水解的温度为30℃，水解时间为1h。
112.步骤s5中所述离心的转速为9000rpm，离心时间为30min。
113.实施例5
114.一种用于除皱的生物细胞肽组合物的制备方法，包括下述步骤，以重量份计：
115.s1在4℃温度下，使用65kg浓度为4.5wt％的氢氧化钠水溶液对12.5kg鳕鱼皮进行碱处理；将碱处理产物置于45kg浓度为0.25wt％的酒石酸水溶液中，沉淀、过滤得滤液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到鳕鱼胶原蛋白粉；
116.s2将1.75kg纳米四氧化三铁、4.8kg硅酸钠、6kg甲苯经分散于16kg水中，形成混合乳液；向所述混合乳液中加入12kg浓度为1mol/l的硝酸水溶液，进行第一级反应；第一级反应结束后继续加入7.5kg乙醇，进行第二级反应，第二级反应结束后经过滤得滤饼、乙醇洗3次、去离子水洗3次、干燥，得到多孔纳米二氧化硅；
117.s3氮气保护下，将所述多孔纳米二氧化硅和14kg环氧丁基三甲氧基硅烷分散于48kg乙醇，进行硅烷化反应，反应结束后过滤得滤饼、乙醇洗3次、去离子水洗3次、干燥，得到硅烷化多孔纳米二氧化硅；将所述硅烷化多孔纳米二氧化硅和6.5kg聚醚胺分散于35kg水中，进行脱氢偶联反应，反应结束后过滤得滤饼、乙醇洗3次、去离子水洗3次、干燥，得到氨基化多孔纳米二氧化硅；
118.s4将所述氨基化多孔纳米二氧化硅和2.2kg戊二醛分散于24kg磷酸盐缓冲液中，进行活化反应，活化反应结束后经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤3次，得到活化多孔纳米二氧化硅；将所述活化多孔纳米二氧化硅再次分散于24kg磷酸盐缓冲液中，继续加入0.18kg枯草杆菌蛋白酶，进行固定化反应，反应产物经过滤得滤饼、磷酸盐缓冲液洗涤3次、冷冻干燥，得到载酶纳米二氧化硅；
119.s5将所述鳕鱼胶原蛋白粉分散于50份去离子水，加入所述载酶纳米二氧化硅并进行水解，水解产物经离心得上清液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到胶原蛋白肽粉；
120.s6将所述胶原蛋白肽粉、7.5kg大豆卵磷脂、0.35kg月桂基葡糖苷溶于18kg乙醇中并摇匀，去除乙醇，得到脂质体；将脂质体经超声处理分散于水中，冷冻干燥，得到所述用于除皱的生物细胞肽组合物。
121.步骤s1中所述碱处理的温度为28℃，处理时间为1.5h。
122.步骤s2中所述第一级反应的温度为20℃，反应时间为1h。
123.步骤s2中所述第二级反应的温度为52℃，反应时间为8h。
124.步骤s3中所述硅烷化反应的温度为65℃，反应时间为4h。
125.步骤s3中所述脱氢偶联反应的温度为45℃，反应时间为12h。
126.步骤s4中所述活化反应的温度为15℃，反应时间为1.5h。
127.步骤s4中所述固定化反应的温度为24℃，反应时间为6h。
128.步骤s5中所述水解的温度为30℃，水解时间为1h。
129.步骤s5中所述离心的转速为9000rpm，离心时间为30min。
130.对照例1
131.一种用于除皱的生物细胞肽组合物的制备方法，包括下述步骤，以重量份计：
132.s1在4℃温度下，使用65kg浓度为4.5wt％的氢氧化钠水溶液对12.5kg鳕鱼皮进行碱处理；将碱处理产物置于45kg浓度为0.25wt％的酒石酸水溶液中，沉淀、过滤得滤液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到鳕鱼胶原蛋白粉；
133.s2将所述鳕鱼胶原蛋白粉分散于50份去离子水，加入0.18kg枯草杆菌蛋白酶并进行水解，水解产物经离心得上清液、冷冻干燥、乙醇洗3次、冷冻干燥，得到胶原蛋白肽粉；
134.s3将所述胶原蛋白肽粉、7.5kg大豆卵磷脂、0.35kg月桂基葡糖苷溶于18kg乙醇中并摇匀，去除乙醇，得到脂质体；将脂质体经超声处理分散于水中，冷冻干燥，得到所述用于除皱的生物细胞肽组合物。
135.步骤s1中所述碱处理的温度为28℃，处理时间为1.5h。
136.步骤s2中所述水解的温度为30℃，水解时间为1h。
137.步骤s2中所述离心的转速为9000rpm，离心时间为30min。
138.测试例1
139.本发明制备过程中鳕鱼胶原蛋白酶解效率通过多肽得率以表征，称量各实施例及对照例中酶解后的多肽量与胶原蛋白的原料总量，由如下公式：多肽得率(％)＝(多肽量/胶原蛋白原料总量)
×
100％计算得到。鳕鱼胶原蛋白酶解效率的结果见表1。
140.表1
141.组样多肽得率(％)实施例128.3实施例232.8实施例336.7实施例442.2实施例566.9对照例168.4
142.多肽得率反映了酶解效率的高低，多肽得率越高，则酶将底物酶解为多肽的效率越高。通过上述实施例和对照例的对比可以看出，实施例5在所有实施例中具有最佳的酶解效率，其多肽得率和对照例1中游离态酶的多肽得率相近。产生这种现象的原因在于，实施例5将具有磁性的纳米四氧化三铁与二氧化硅结合，制备了一种具有磁性的多孔纳米二氧化硅，其比表面积大，能够提高酶的负载效率；此外实施例5对多孔纳米二氧化硅粒子进行烷硅化及脱氢偶联处理，在二氧化硅表面引入有机分子链，所述有机分子链含有醚键，醚键内聚能低，并易旋转，可以为酶的运动提供合适的空间条件，同时有机分子链的链端为氨基，可在戊二醛活化下与酶反应并连结，达到酶的固定化；酶通过能够灵活运动旋转的长分子链与二氧化硅颗粒相连，固定的同时大大增加了与底物的接触能力，从而提升了酶解的效率。
143.测试例2
144.用于除皱的生物细胞肽组合物的抗氧化性能测试参考gb/t 39100-2020《多肽抗氧化性测定dpph和abts法》中的具体要求进行。本测试按照所述国标要求使用dpph法，自由基的清除能力以待测多肽半数清除量与谷胱甘肽半数清除量的比值来表示。结果以平行测试值的算术平均值表示，保留三位有效数字。用于除皱的生物细胞肽组合物的抗氧化性能测试结果见表2。
145.表2
146.组样dpph清除率(％)实施例152.1
实施例271.8实施例355.3.实施例475.4实施例582.4对照例144.6
147.dpph清除率反映了用于除皱的生物细胞肽组合物的抗氧化性能，dpph清除率越高则抗氧化性能越好。通过上述实施例及对照例的对比可以看出，使用胶原蛋白肽粉、大豆卵磷脂、月桂基葡糖苷制备的用于除皱的生物细胞肽组合物具有较高的dpph清除率。产生这种现象的原因可能在于，由胶原蛋白肽与大豆卵磷脂形成脂质体，以月桂基葡糖苷作为脂质体双层膜之间的边缘激活剂，由大豆卵磷脂诱导脂质体的高径向曲率，从而增加脂质体的形变能力，增加和胶原蛋白肽的结合能力，进而提高结构的完整性，提升了胶原蛋白肽的抗氧化性。