一种透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老、促进胶原蛋白生成中的用途的制作方法

1.本发明属于生物工程技术领域，具体地，涉及一种透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老、促进胶原蛋白生成中的用途。


背景技术：

2.透明质酸（ha）是一种普遍存在于细胞外基质的糖胺聚糖，由n
‑
乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸的二糖重复序列组成。透明质酸广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。透明质酸的分子量大小是表征其特性的基本参数之一，ha的生物学性质与其分子量大小有密切的关系。大分子透明质酸（hmw
‑
ha）通常起到维持细胞稳态的作用，而小分子透明质酸（lmw
‑
ha）和寡聚透明质酸（o
‑
ha）则行使生物活性的功能。
3.制备小分子的透明质酸的主要方法有物理降解法、化学降解法和酶解法。物理法主要有加热、辐照等手段。该方法制备的透明质酸产品稳定性较差。而化学法则常使用水解法和氧化降解法，这当中可能会引入一些化学试剂，易给透明质酸的性质和产品质控带来影响。而酶解法则是使用特定的酶，使得透明质酸中的糖苷键发生断裂，以获得小分子的透明质酸。使用特定的酶可以提高剪切糖苷键的专一性，得到纯分子量分布集中且纯度较高的小分子透明质酸。
4.皮肤衰老，也称为皮肤老化是指皮肤功能衰老性损伤，使皮肤对机体的防护能力，调节能力等减退，由此皮肤不能适应内外环境的变化，出现颜色、色泽、形态、质感等外观整体状况的改变。皮肤的老化分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是指皮肤随年龄增长的自然老化，表现为皮肤变白，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等。外源性老化的最主要原因是日晒所致的光老化，表现为皱纹、皮肤松弛、粗糙、淡黄或灰黄色的皮肤变色、毛细血管扩张、色素斑形成等。
5.然而，通常物质的结构对其生物活性会产生影响，寡糖类物质也展示出了复杂而紧密的构效关系。非专利文献1（han w, song l, wang y, et al. preparation, characterization, and inhibition of hyaluronic acid oligosaccharides in triple
‑
negative breast cancer[j]. biomolecules, 2019, 9(9): 436.）通过改变盐酸浓度，选择性地产生具有不同聚合度和还原端的透明质酸寡糖（haos），使用moe软件对haos与cd44和tlr4进行分子对接模拟的数据表明，haos与cd44和tlr4的结合能力随着haos的聚合度增加而增加，同时当haos的还原端为glcnac残基时结合能力显着增加，而当还原端为glca残基时结合能力没有显着变化。非专利文献2（yao w, chen m, dou x, et al. unravel a neuroactive sha sulfation pattern with neurogenesis activity by a library of defined oligosaccharides[j]. european journal of medicinal chemistry, 2019, 163: 583
‑
596.）批露了硫酸化透明质酸 (sha) 具有良好的生物学功能，特定的硫酸化模式在调节糖胺聚糖和蛋白质之间的结合模式中起着关键作用，证明了带有 6
‑
o
‑
硫酸化 (sha
‑
6s) 的 sha 四糖，在体外促进大鼠 e18 海马神经元轴突生长方
面具有重要作用。非专利文献3（solera c, macchione g, maza s, et al. chondroitin sulfate tetrasaccharides: synthesis, three
‑
dimensional structure and interaction with midkine[j]. 2016.）采用荧光偏振竞争测定来分析合成化合物的相对结合亲和力，并揭示了合成硫酸软骨素样四糖和中期因子之间具有相互作用。可以看出haos聚合度、空间结构或者残基的不同，都会对生物活性产生不同影响或者产生新的功能。这是非常值得去深入研究的。现有技术中，也尚未有具有糖醛酸端基的超小分子量透明质酸在改善皮肤衰老方面或者促进胶原蛋白形成方面的研究。
[0006]
因此，进一步对ha类物质的构效关系进行研究，以期得到更多有益的活性物质及功效，对拓展ha的应用具有非常重要的意义。


技术实现要素：

[0007]
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老、促进胶原蛋白生成中的用途。
[0008]
具体来说，本发明涉及如下方面：1. 一种透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老中的用途，其特征在于，所述透明质酸寡糖组合物包括式(i)所示结构的透明质酸寡糖：式(i)其中，x选自h、k、na、ca或zn，优选为na；n为选自0
‑
5的整数；在所述透明质酸寡糖组合物中，n=1的透明质酸寡糖的质量占比为35
‑
70%，n=0的透明质酸寡糖的质量占比为5
‑
40%，n=2的透明质酸寡糖的质量占比为10
‑
50%，n=3的透明质酸寡糖的质量占比为1
‑
15%，n=4的透明质酸寡糖的质量占比为0.1
‑
10%，n=5的透明质酸寡糖的质量占比为0.01
‑
5%。
[0009]
2. 根据项1所述的用途，其特征在于，所述透明质酸寡糖组合物通过促进胶原蛋白生成和/或表皮细胞增殖与分化而抗皮肤衰老。
[0010]
3. 根据项1所述的用途，其特征在于，在所述透明质酸寡糖组合物中，n=1的透明质酸寡糖的质量占比为40
‑
60%；n=0的透明质酸寡糖的质量占比为5
‑
20%；n=2的透明质酸寡糖的质量占比为20
‑
40%；n=3的透明质酸寡糖的质量占比为3
‑
8%；n=4的透明质酸寡糖的质量占比为1
‑
5%；n=5的透明质酸寡糖的质量占比为0.01
‑
1.5%。
[0011]
4. 根据项1所述的用途，其特征在于，所述透明质酸寡糖组合物的重均分子量小于等于1 kda。
[0012]
5. 根据项1所述的用途，其特征在于，所述透明质酸寡糖组合物施用于皮肤，优选的，所述施用于皮肤的方式为通过化妆品或医疗器械。
[0013]
6. 根据项5所述的用途，其特征在于，所述透明质酸寡糖组合物在所述化妆品或医疗器械中的质量浓度为0.0001%
‑
5%，优选为0.001%
‑
1%。
[0014]
7. 一种透明质酸寡糖组合物在促进胶原蛋白生成中的用途，其特征在于，所述透明质酸寡糖组合物包括式(i)所示结构的透明质酸寡糖：式(i)其中，x选自h、k、na、ca或zn，优选为na；n为选自0
‑
5的整数；在所述透明质酸寡糖组合物中，n=1的透明质酸寡糖的质量占比为35
‑
70%，n=0的透明质酸寡糖的质量占比为5
‑
40%，n=2的透明质酸寡糖的质量占比为10
‑
50%，n=3的透明质酸寡糖的质量占比为1
‑
15%，n=4的透明质酸寡糖的质量占比为0.1
‑
10%，n=5的透明质酸寡糖的质量占比为0.01
‑
5%。
[0015]
8. 根据项7所述的用途，其特征在于，所述透明质酸寡糖组合物用于制备促进胶原蛋白生成的保健品，或者用于制备保护、强化脏器的保健品，或者用于制备保护胃粘膜的保健品，或者用于制备补充钙质的保健品，或者用于制备关节润滑注射液，优选所述透明质酸寡糖组合物在所述保健品或注射液中的质量浓度为0.001%
‑
1%。
[0016]
9. 根据项7所述的用途，其特征在于，在所述透明质酸寡糖组合物中，n=1的透明质酸寡糖的质量占比为40
‑
60%；n=0的透明质酸寡糖的质量占比为5
‑
20%；n=2的透明质酸寡糖的质量占比为20
‑
40%；n=3的透明质酸寡糖的质量占比为3
‑
8%；n=4的透明质酸寡糖的质量占比为1
‑
5%；n=5的透明质酸寡糖的质量占比为0.01
‑
1.5%。
[0017]
10. 根据项7所述的用途，其特征在于，所述透明质酸寡糖组合物的重均分子量小于等于1 kda。
[0018]
本发明的透明质酸寡糖组合物分子量较小，在还原端具有糖醛酸，可以显著促进真皮成纤维细胞胶原蛋白的生成，使真皮中的胶原蛋白含量增加，减少皱纹的产生，具有一定的抗衰老活性。同时，胶原蛋白独有的三螺旋结构，能强力锁住30倍的水分，使皮肤持久水润、光泽、细嫩人体。本发明的透明质酸寡糖组合物可用于制备抗衰老和保湿的化妆品、医疗器械。本发明的透明质酸寡糖组合物具有促进胶原蛋白生成的用途，可进一步用于制备促进胶原蛋白生成的保健品，或者用于制备保护、强化脏器的保健品，或者用于制备保护胃粘膜的保健品，或者用于制备补充钙质的保健品，或者用于制备关节润滑注射液。
[0019]
附图说明
[0020]
图1为透明质酸寡糖组合物的液相图。
[0021]
图2为透明质酸寡糖组合物的质谱总离子流峰图。
[0022]
图3为透明质酸二糖（ha2）的离子强度图。
[0023]
图4为透明质酸四糖（ha4）的离子强度图。
[0024]
图5为透明质酸六糖（ha6）的离子强度图。
[0025]
图6为透明质酸八糖（ha8）的离子强度图。
[0026]
图7为透明质酸十糖（ha10）、透明质酸十二糖（ha12）的离子强度图。
[0027]
图8所示为使用样品1
‑
1、2
‑
1后成纤维细胞分泌胶原蛋白ⅰ的含量。
[0028]
图9所示为使用样品1、1
‑
1、1
‑
2、1
‑
3后成纤维细胞分泌胶原蛋白ⅰ的含量。
[0029]
图10所示为使用样品1、样品2后3d全层皮肤模型的结构。
[0030]
图11所示为样品4透皮情况的显微镜下照片。
[0031]
具体实施方式
[0032]
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
[0033]
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
[0034]
人类的皮肤随年龄增长自然老化或随着环境刺激而衰老，导致皮肤衰老。自然老化为内源性老化，表现为皮肤变白，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等，环境刺激为外源性老化，如日晒所致的光老化。如果皮肤得不到良好的保养或随着年龄增长而衰退，死皮就会附着在皮肤表面而不脱落，因而造成一系列问题，严重影响美容。
[0035]
为了解决皮肤衰老的问题，本发明提供一种透明质酸寡糖组合物在抗皮肤衰老中的用途，所述透明质酸寡糖组合物包括式(i)所示结构的透明质酸寡糖：式(i)其中，n为选自0
‑
5的整数；x选自h、k、na、ca或zn，优选为na。
[0036]
在所述透明质酸寡糖组合物中，n=1的透明质酸寡糖的质量占比为35
‑
70%，n=0的透明质酸寡糖的质量占比为5
‑
40%，n=2的透明质酸寡糖的质量占比为10
‑
50%，n=3的透明质酸寡糖的质量占比为1
‑
15%，n=4的透明质酸寡糖的质量占比为0.1
‑
10%，n=5的透明质酸寡糖的质量占比为0.01
‑
5%。
[0037]
皮肤衰老的原因主要由以下几点体现：1.真皮层细胞外基质的改变。胶原是真皮
细胞外基质的主要成分，在人体真皮中约占蛋白质的90%。胶原蛋白种类较多，常见类型为ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型、
ⅴ
型和
ⅺ
型。真皮中的蛋白主要由ⅰ型胶原（80%）和少量的ⅲ型胶原（10%）组成，胶原使皮肤有强度和弹性。随着年龄的增长，皮肤中胶原纤维减少，使皮肤失去弹性，产生皱纹。真皮中的胶原蛋白主要由成纤维细胞分泌，成纤维细胞分泌的胶原蛋白减少也是引起衰老、产生皱纹的一大原因之一。2.基底层结构的改变。人的皮肤在衰老后，基底层结构松弛，细胞连接稀松，使得真皮
‑
表皮间的物质交换效率降低。从而导致表皮营养不足，表皮细胞不能正常地增殖与分化。进而使得表皮变薄，产生松弛等现象。
[0038]
针对上述皮肤衰老的主要原因，所述透明质酸寡糖组合物可以通过促进胶原蛋白生成和/或表皮细胞增殖与分化而抗皮肤衰老。
[0039]
在一个具体的实施方式中，所述透明质酸寡糖组合物通过促进胶原蛋白生成而抗皮肤衰老。
[0040]
在一个具体的实施方式中，所述透明质酸寡糖组合物通过促进表皮细胞增殖与分化而抗皮肤衰老。
[0041]
在一个具体的实施方式中，所述透明质酸寡糖组合物可以通过促进胶原蛋白生成和表皮细胞增殖与分化而抗皮肤衰老。
[0042]
本发明中的透明质酸寡糖或透明质酸寡聚糖（oligosaccharides of ha，简称oligo
‑
ha）为分子量在10
4 da以下，单糖残基数量为2～25（一般为4～16）的透明质酸分子片段。oligo
‑
ha属于小分子多糖，其性质与普通透明质酸有很大不同。研究表明，oligo
‑
ha具有抗氧化、免疫调节、抗炎症和促进伤口愈合、促血管生成和抗肿瘤等生物活性。尤为重要的是，因其分子尺寸较小，可渗入到皮肤角质层发挥深层保湿和滋润的功效，可广泛应用到化妆品中。
[0043]
本发明的透明质酸寡糖组合物包括式(i)所示结构的透明质酸寡糖：式(i)由式(i)可以看出，本发明的透明质酸寡糖的还原端为糖醛酸结构。
[0044]
其中，n选自0
‑
5的整数，例如n可以为0、1、2、3、4或5，x选自h、k、na、ca或zn，优选为na。当n=0时，透明质酸寡糖为二糖，当n=1时，透明质酸寡糖为四糖，当n=2时，透明质酸寡糖为六糖，当n=3时，透明质酸寡糖为八糖，当n=4时，透明质酸寡糖为十糖，当n=5时，透明质酸寡糖为十二糖。所以，在本发明的透明质酸寡糖组合物中，四糖的质量占比为35
‑
70%；二糖的质量占比为5
‑
40%；六糖的质量占比为10
‑
50%；八糖的质量占比为1
‑
15%；十糖的质量占比为0.1
‑
10%；十二糖的质量占比为0.01
‑
5%。
[0045]
其中，透明质酸寡糖四糖的质量占比为35
‑
70%，例如可以为35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、31%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%，优选为40
‑
60%。
[0046]
透明质酸寡糖二糖的质量占比为5
‑
40%，例如可以为5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%，优选为5
‑
20%。
[0047]
透明质酸寡糖六糖的质量占比为10
‑
50%，例如可以为10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%，优选为20
‑
40%。
[0048]
透明质酸寡糖八糖的质量占比为1
‑
15%，例如可以为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%，优选为3
‑
8%。
[0049]
透明质酸寡糖十糖的质量占比为0.1
‑
10%，例如可以为0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，优选为1
‑
5%。
[0050]
透明质酸寡糖十二糖的质量占比为0.01
‑
5%，例如可以为0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%，优选为0.01
‑
1.5%。
[0051]
在一个具体的实施方式中，在所述透明质酸寡糖组合物中，透明质酸二糖的质量占比为5
‑
40%，透明质酸四糖的质量占比为35
‑
70%，透明质酸六糖的质量占比为10
‑
50%，透明质酸八糖的质量占比为1
‑
15%，透明质酸十糖的质量占比为0.1
‑
10%，透明质酸十二糖的质量占比为0.01
‑
5%。
[0052]
在一个具体的实施方式中，在所述透明质酸寡糖组合物中，透明质酸二糖的质量占比为5
‑
20%，透明质酸四糖的质量占比为40
‑
60%，透明质酸六糖的质量占比为20
‑
40%，透明质酸八糖的质量占比为3
‑
8%，透明质酸十糖的质量占比为1
‑
5%，透明质酸十二糖的质量占比为0.01
‑
1.5%。
[0053]
在一个具体的实施方式中，在所述透明质酸寡糖组合物中，透明质酸二糖的质量占比为5
‑
10%，透明质酸四糖的质量占比为45
‑
55%，透明质酸六糖的质量占比为30
‑
40%，透明质酸八糖的质量占比为2
‑
8%，透明质酸十糖的质量占比为1
‑
2%，透明质酸十二糖的质量占比为0.01
‑
1%。
[0054]
在一个具体的实施方式中，在所述透明质酸寡糖组合物中，透明质酸二糖的质量占比为10%，透明质酸四糖的质量占比为50%，透明质酸六糖的质量占比为33%，透明质酸八糖的质量占比为5%，透明质酸十糖的质量占比为1%，透明质酸十二糖的质量占比为1%。
[0055]
在一个具体的实施方式中，在所述透明质酸寡糖组合物中，透明质酸二糖的质量占比为9%，透明质酸四糖的质量占比为49%，透明质酸六糖的质量占比为32%，透明质酸八糖的质量占比为7%，透明质酸十糖的质量占比为2%，透明质酸十二糖的质量占比为1%。
[0056]
进一步地，所述透明质酸寡糖组合物的重均分子量小于等于1 kda，例如可以为1kda、990da、980da、970da、960da、950da、940da、930da、920da、910da、900da、890da、880da、870da、860da、850da、840da、830da、820da、810da、800da、790da、780da、770da、760da、750da、740da、730da、720da、710da、700da。
[0057]
在本发明的抗皮肤衰老的用途中，所述透明质酸寡糖组合物可以直接或间接地施用于皮肤，例如可以通过外敷、注射或口服等方式施用。
[0058]
在本发明的抗皮肤衰老的用途中，所述透明质酸寡糖组合物可用于化妆品、医疗器械，进一步适用于皮肤。例如，所述透明质酸寡糖组合物可以单独或与其他活性成分一起配制成化妆品，用于抗皮肤衰老。
[0059]
进一步地，当所述透明质酸寡糖组合物用于化妆品、医疗器械时，透明质酸寡糖组合物用于细胞中的质量浓度为0.0001%
‑
0.1%。根据细胞
‑
人体面部皮肤的表面积换算及所述透明质酸寡糖组合物的透皮情况，所述透明质酸寡糖组合物在所述化妆品或医疗器械中的质量浓度为0.0001%
‑
5%，例如可以为0.0001%、0.001%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%，优选为0.001%
‑
1%。
[0060]
本发明还提供上述透明质酸寡糖组合物在促进胶原蛋白生成中的用途。
[0061]
内脏器官及组织都含有胶原蛋白，在这些脏器表皮结构的下方是胶原蛋白，胶原蛋白能够保护及强化脏器，因此所述透明质酸寡糖组合物可用于制备保护、强化脏器的保健品。
[0062]
胶原蛋白是肌肉组织的主要成分，可以为肌肉提供所需营养，保护胃黏膜，因此所述透明质酸寡糖组合物可用于制备保护胃粘膜的保健品。
[0063]
胶原蛋白同时也是组成钙质附着网架，锁定骨钙，防止钙流失，因此所述透明质酸寡糖组合物可用于制备补充钙质的保健品。
[0064]
胶原蛋白还能有效修复关节软骨，恢复关节软骨表面的润滑，减少摩擦。因此所述透明质酸寡糖组合物可用于制备关节润滑注射液。
[0065]
在一个具体的实施方式中，所述透明质酸寡糖组合物在所述保健品或注射液中的质量浓度为0.0001%
‑
5%，例如可以为0.0001%、0.001%、0.01%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%，优选为0.001%
‑
1%。
[0066]
实施例
[0067]
实施例1 透明质酸寡糖组合物制备于5l反应器中，加入4l水，控制温度30℃，加入透明质酸酶（该酶为利用毕赤酵母工程菌表达的水蛭透明质酸酶，制备方法参照cn 103695448 a中描述的方法）4
×
10
7 u，体系酶活为1
×
104u/ml，加入5g透明质酸（分子量100kda），待其完全溶解后，采用超滤分离酶解反应物以得到产物原液，采用纳滤对所述产物原液进行浓缩以得到产物浓缩液。保持体系30℃搅拌反应12h。其中超滤采用截留分子量为1 kda的超滤膜，纳滤采用截留分子量为200 da的纳滤膜。反应结束，收集纳滤浓缩液，加入活性炭吸附后，过滤收集滤液，进行喷雾干燥，其中进风温度120℃，出风温度60℃。得到透明质酸寡糖组合物，产品收率为84%。
[0068]
将透明质酸寡糖组合物使用高效液相色谱仪分析其寡糖分布，具体的色谱条件为：色谱柱：superdex 200 10/300 gl柱温：40℃检测器：紫外
‑
可见分光检测器流动相：1mol/l硫酸铵溶液进样浓度：0.5%进样量：20 μl流速：2 ml/min检测波长：200nm 。
[0069]
结果如图1所示，在透明质酸寡糖组合物中，透明质酸二糖的质量占比为9.35%，透明质酸四糖的质量占比为47.84%，透明质酸六糖的质量占比为32.92%，透明质酸八糖的质量占比为6.04%，透明质酸十糖的质量占比为1.48%，透明质酸十二糖的质量占比为0.42%。
[0070]
使用激光光散射仪（型号：dawn heleos
‑
ii）测量透明质酸寡糖组合物的平均分子量为920 da。
[0071]
对比例1透明质酸寡糖组合物制备参考cn112646055a中描述的方法制备得到更高分子量的透明质酸寡糖组合物，具体制备方法如下：1)预处理：将50g分子量为1000kda的高分子量透明质酸溶于30倍重量份的水中，用0.1mol/l甲醇钠溶液调节溶液ph至8.5，在室温下充分搅拌溶胀，缓慢升温至90℃，恒温水解4h，然后将经浸提抽滤，滤渣重复上述浸提操作，合并两次滤液备用；2)中性盐分级沉淀：将步骤1)得到的溶液加热至40℃，加入溶液重量的25％的硫酸镁固体，搅拌完全溶解后用0.1μm的磺化聚砜超滤膜进行超滤，接着向滤液中再次加入溶液重量的43％的硫酸镁固体，搅拌至完全溶解后静置沉淀，然后进行过滤、超滤、干燥，再然后将干燥后的沉淀物加入6倍的纯化水复溶；3)过滤纯化：将步骤2)得到的溶液经截留分子质量为4kda的磺化聚砜微滤膜在0.3mpa透膜压力下进行超滤预处理；渗出液再经截留分子质量为2kda的磺化聚砜纳滤膜进行纳滤浓缩，最终所得浓缩液经真空冷冻干燥得到透明质酸寡糖组合物。
[0072]
使用激光光散射仪（型号：dawn heleos
‑
ii）测量透明质酸寡糖组合物的平均分子量为2682da。
[0073]
试验例试验例1（1）质谱检测采用esi
‑
ms对实施例1到的透明质酸寡糖组合物进行表征，质谱检测的条件为：离子源参数 esi，雾化器压力：30 psi；脱溶剂气体流速 50 l/h；温度 400℃；负离子模式。
[0074]
结果如图3
‑
7所示，在质谱总离子流峰图（图2）上1.380 min出现的质谱峰 [m]为397.1，鉴定为透明质酸二糖（图3）；在质谱总离子流峰图上3.649min出现的质谱峰 [m]为776.2，鉴定为透明质酸四糖（图4）；在质谱总离子流峰图上5.612min出现的质谱峰 [m]为1155.3，鉴定为透明质酸六糖（图5）；在质谱总离子流峰图上6.724 min出现的质谱峰 [m]为1535.5，鉴定为透明质酸八糖（图6）；在质谱总离子流峰图上7.257 min出现的质谱峰 [m]为1913.5，鉴定为透明质酸十糖（图7），在其后出现的质谱峰[m]为2292.6，鉴定为透明质酸十二糖。
[0075]
（2）透明质酸寡糖组合物的还原端鉴定对实施例1和对比例1得到的透明质酸寡糖组合物进行还原端鉴定。
[0076]
利用morgan
–
elson反应，根据比色法确定透明质酸寡糖组合物的还原端。如果变红证明还原端为n
‑
乙酰葡糖胺，如果不变红证明还原端为糖醛酸。
[0077]
反应缓冲液：碱性硼酸溶液（在10ml水中溶解1.73 g h3bo3和0.78 g koh，在使用前加入其体积十分之一的0.8 g ml
‑
1 k2co3。）对二甲基氨基苯甲醛溶液 (将2克对二甲基氨基苯甲醛溶液溶于2.5 ml 浓盐酸和7.5 ml 冰醋酸中，使用前用4倍体积冰醋酸稀释)。
[0078]
取400μl 10g/l的透明质酸寡糖组合物溶液，加入110μl碱性硼酸溶液，煮沸4min，加入了1.5ml的对二甲基氨基苯甲醛，在37℃下孵育20min。
[0079]
使用透明质酸（分子量1500kda）、透明质酸四糖（ha4，购自sigma，还原端为n
‑
乙酰葡糖胺）溶液作为对照。
[0080]
结果如表1所示，实施例1和对比例1制备的透明质酸寡糖组合物经moran
‑
elson反应没有显红色，证明还原端为糖醛酸。
[0081]
表1 morgan
–
elson反应结果实施例1不变红对比例1不变红试验例2称取实施例1和对比例1的透明质酸寡糖组合物各10mg，分散于10ml的dmem培养基中，0.22μm滤膜除菌过滤，分别得到质量浓度为0.1%的样品1和样品2。
[0082]
试验例2
‑
1 胶原蛋白含量测定胶原蛋白决定着包括皮肤在内的人体组织的物理特性。真皮中的胶原蛋白主要由成纤维细胞分泌。本发明通过评估透明质酸组合物对成纤维细胞分泌表达胶原蛋白的能力的影响来评估其对促进胶原蛋白生成的影响。
[0083]
1、样品准备取20μl样品1和样品2分别加入1.98ml的10�s
‑
dmem培养基中，制成终质量浓度为0.001%的溶液得样品1
‑
1、2
‑
1。
[0084]
取样品1加入10�s
‑
dmem培养基中，制成终质量浓度分别为0.001%、0.01%、0.0001%的溶液得样品1
‑
1、1
‑
2、1
‑
3。
[0085]
2、人成纤维细胞胶原ⅰ分泌实验将人成纤维细胞以1万/孔的密度铺于96孔板中，置于培养箱中培养24h。弃上清，将样品1、1
‑
1、1
‑
2、1
‑
3、2
‑
1加入孔板中，每孔200μl。置于培养箱中孵育48h。收集上清，将上清用dmem培养基稀释十倍后，使用human col
ⅰꢀ
elisa kit对上清中的胶原蛋白ⅰ进行定量。结果如图8和图9所示其中，对照组为不加入任何样品的试验组。
[0086]
3、结果显示如图8所示，虽然样品1
‑
1和2
‑
1均有一定的促进胶原生成的作用，但是小分子量的样品1
‑
1促胶原蛋白生成效果更为显著。其中样品1
‑
1使得胶原蛋白i的分泌量提高33%，而样品2
‑
1促胶原蛋白i的分泌量与对照组相比无显著性差异。
[0087]
如图9所示，样品1、样品1
‑
1、样品1
‑
2、1
‑
3均有显著的促进胶原生成的作用，说明实施例1的透明质酸寡糖组合物在质量浓度为0.0001%
‑
0.1%时均有促进成纤维细胞分泌胶原的作用。尤其是当质量浓度为0.001%时效果最佳。
[0088]
试验例2
‑
2 3d皮肤模型本发明通过评估透明质酸组合物对3d全层皮肤模型的组织结构影响来评估其对表皮细胞增殖与分化的作用。
[0089]
3d全层皮肤模型是利用组织工程技术，采用适当的培养基将正常人皮肤细胞在体外重建而成的类似于人体皮肤结构的活性组织。通过评估3d皮肤模型的组织结构可以判断
样品在抗衰老方面的作用。基底层为真皮
‑
表皮之间的物质交换屏障，基底层的结构越稳定，表示表皮层可吸收的养分越多，则表皮细胞能更好地增殖分化，从而达到抗衰老的作用。
[0090]
1、3d全层皮肤模型的构建通过将胶原与人真皮成纤维细胞组合构建成3d全层皮肤模型的真皮层，再于真皮层上接种人角质形成细胞形成表皮层，得到完整的具有真皮
‑
表皮结构的皮肤模型。再分别加入样品1、样品2对其进行处理。
[0091]
2、3d全层皮肤模型石蜡组织切片将组织放入包埋盒中，分别放入4%多聚甲醛、70%乙醇
‑
水溶液、80%乙醇
‑
水溶液、90%乙醇
‑
水溶液、95%乙醇
‑
水溶液、无水乙醇ⅰ、无水乙醇ⅱ、甲基环己烷ⅰ、甲基环己烷ⅱ中进行梯度脱水，每缸溶液1h。脱水完毕，将组织放入石蜡中包埋，修片，切成厚度为5μm的石蜡切片。
[0092]
3、3d全层皮肤模型苏木精
‑
伊红染色将石蜡切片分别放入甲基环己烷ⅰ、甲基环己烷ⅱ、无水乙醇、95%乙醇
‑
水溶液、80%乙醇
‑
水溶液、70%乙醇
‑
水溶液、蒸馏水中浸泡10 min进行脱蜡、复水后。放入苏木精染液中染色8 min后，依次放入盐酸
‑
乙醇溶液中分化2s、氨水溶液中复蓝1min。接着用伊红溶液染色1min，最后放入70%乙醇
‑
水溶液、95%乙醇
‑
水溶液、无水乙醇、甲基环己烷溶液中脱水，中性树胶封片。显微镜下拍照。结果见图10。其中，对照组为不加入任何样品的试验组。
[0093]
4、结果显示如图10所示，与对照组和样品2相比，在加入样品1后，3d全层皮肤模型基底层细胞连接紧密，表皮层分化良好、结构完整，棘层和颗粒层结构清晰。说明样品1具有良好的抗衰老作用。
[0094]
试验例3 透明质酸寡糖组合物透皮验证1. 样品荧光标记取实施例1的透明质酸寡糖组合物2g分散于40ml的水中配制成浓度为50mg/ml的溶液，加入20mldmso溶液混匀。向上述60ml溶液中加入500μl的50mg/ml 5
‑
羟基荧光素溶液，25μl的环己基异腈，100μl的25%乙醛溶液，在室温下搅拌反应5小时。移取40ml荧光标记过的溶液，取饱和氯化钠的冰乙醇溶液上层清液560ml加入，使之产生荧光标记的透明质酸沉淀。将上述溶液转移至离心管中，置于离心机以4000*g的离心力离心10分钟，弃去上层液体，取下荧光素标记的实施例1。
[0095]
2. 荧光标记物透皮取15mg荧光标记过的实施例1溶解于1ml的水中，制成终质量浓度为1.5%的样品4。以15ml的1
×
pbs为接收液，25mm直径猪皮装载在手动透皮仪上。接收液在(32.0
±
0.1)℃水浴加热，在定速磁力搅拌(300
±
5)r/min条件下平衡1小时。在皮肤上层加入500μl的样品4，加盖。经20h后结束，取下猪皮晾干。
[0096]
3.猪皮冰冻切片取晾干的猪皮，置于oct中于液氮中迅速冷却。置于冰冻切片机中切成厚度为10μm的切片，于荧光显微镜下观察。
[0097]
4.结果显示
如图11所示，样品4在表皮层和真皮层都有荧光亮度，这说明样品4能很好的渗透表皮层和真皮层。以上结果说明实施例1可渗透并停留在真皮和表皮发挥作用。