cGAS抑制剂在制备治疗T细胞淋巴瘤的药物中的应用

cgas抑制剂在制备治疗t细胞淋巴瘤的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及cgas抑制剂在制备治疗t细胞淋巴瘤的药物中的应用。


背景技术：

2.淋巴瘤是一种发病率很高的恶性血液疾病，根据病理学特点，分为霍奇金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤两大类，其中非霍奇金淋巴瘤最常见，约占总发病率的 80％-90％。t细胞淋巴瘤(t cell lymphoma，tcl)是起源于t淋巴细胞异常增生的恶性肿瘤，可原发于淋巴结、结外组织或皮肤。tcl发病率低，约占非霍奇金淋巴瘤的10-15％。tcl包括t淋巴母细胞淋巴瘤(t lymphoblastic lymphoma, t-lbl)、皮肤型t细胞淋巴瘤(cutaneous t-cell lymphoma,ctcl)和外周t 细胞淋巴瘤(peripheral t-cell lymphoma,ptcl)等。t细胞淋巴瘤是一种具有高度侵袭性及异质性的疾病，在基因改变、临床特征、形态学表现、治疗反应和预后方面均存在差异。除了alk 的间变性大细胞淋巴瘤(anaplastic large celllymphoma，alcl)外，大多数t细胞淋巴瘤预后较差，目前一线治疗chop(环磷酰胺 多柔比星 长春新碱 泼尼松)样方案对t细胞淋巴瘤有效，但仍存在较高失败率和复发率等问题。因此需要不断探索chop样方案联合新型靶向药物以提高疗效。
3.组蛋白脱乙酰基酶(hdac)是一组参与基因表达表观遗传调控的酶。通过去除组蛋白中的乙酰基，从而调节染色质结构并改变转录因子对其目标dna序列的可及性，其抑制剂(hdaci)能够增加组蛋白和其他蛋白质的乙酰化，诱导染色质结构的变化，促进肿瘤抑制基因的表达，细胞凋亡，并因此具有抗肿瘤活性。自2006年以来，多种hdaci被fda批准应用于t细胞淋巴瘤的治疗，该类药物可提高疾病总体缓解率，然而生物利用度差及本身药物耐药问题导致治疗失败及复发率高等问题仍无法改善。cd30(肿瘤坏死因子受体超家族，成员8；tnfrsf8) 是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族。其单抗brentuximabvedotin的临床试验表明，联合chop治疗相比chop方案总体生存率(or)升高，但仅对cd30 t细胞淋巴瘤患者有效，因此应用范围缩小。双表观药物(西达本胺及阿扎胞苷)在复发或难治性(relapsed or refractory,r/r)tcl患者的治疗中显示出一定的疗效，然而治疗后早期进展的患者预后不佳。另外，pi3k 抑制剂等靶向药物及与pd-1抑制剂等药物的联合使用也在治疗tcl有一定的疗效。尽管目前各种靶向药及免疫治疗等为tcl患者提供了更多的选择，但是仍有部分tcl患者出现耐药、复发难治，所以需要探索新的治疗策略和治疗方案来进一步提高tcl患者的临床疗效。
4.研究发现，cgas抑制剂ru.521可通过阻断sting降低组织蛋白酶b的表达，降低bax和caspase3的表达，减少缺血缺氧后的组织损伤；ru.521可以减轻炎症反应，减轻氧化应激引起的损伤，通过增加脓毒症小鼠心脏中sirt3的表达，从而起到保护心脏的作用；ru.521抑制cgas可减轻小鼠烟曲霉菌角膜炎的严重程度；使用ru.521进行cgas的药理抑制可减少培养中特发性肺纤维化中肺泡上皮细胞的衰老，并减弱依托泊苷诱导的dna损伤而诱发的正常供者的肺泡上皮细胞的衰老。这些证据表明ru.521在抑制cgas、减轻炎症及免疫方面
具有良好的临床应用前景。但目前尚无cgas抑制剂用于治疗t细胞淋巴瘤的相关研究报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种cgas抑制剂的新用途，拓展cgas抑制剂的应用范围。
6.技术方案
7.本发明提供了cgas抑制剂在制备治疗t细胞淋巴瘤的药物中的应用。发明人课题组对cgas抑制剂在t细胞淋巴瘤中的作用和机制进行了试验和研究，发现cgas抑制剂在一定浓度范围(0.01～10μm)内可有效杀伤tcl细胞并表现出药物浓度依赖性，通过抑制tcl细胞中dna损伤修复相关蛋白uimc1(rap80) 的表达，减弱uimc1(rap80)对肿瘤细胞dna损伤的修复，诱导tcl细胞凋亡。
8.进一步，所述的t细胞淋巴瘤为t淋巴母细胞淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤或外周t细胞淋巴瘤。
9.进一步，所述cgas抑制剂为ru.521。ru.521可以很好地抑制tcl细胞中 cgas蛋白活性及其下游蛋白的表达，减弱uimc1(rap80)对肿瘤细胞dna损伤的修复，以增加细胞对药物的敏感性，诱导tcl细胞凋亡。
10.进一步，所述药物中，cgas抑制剂的作用浓度为0.01～10μm。
11.有益效果：
12.本发明提供了cgas抑制剂在制备治疗t细胞淋巴瘤的药物中的应用，发明人通过实验研究发现：cgas抑制剂在0.01～10μm浓度范围内可有效杀伤tcl细胞并表现出药物浓度依赖性，通过抑制tcl细胞中uimc1(rap80)的表达，减弱uimc1(rap80)对肿瘤细胞dna损伤的修复，可以增加细胞对药物的敏感性，诱导tcl细胞凋亡。本发明为临床t细胞淋巴瘤的治疗提供了一种新的方案。
附图说明
13.图1为tcl细胞经不同浓度ru.521处理后的细胞增殖活力测试结果；
14.图2为tcl细胞经不同浓度ru.521处理后的细胞凋亡情况的流式检测结果；
15.图3为ru.521处理前后tcl细胞相关蛋白表达信号的蛋白质谱dia分析结果；
16.图4为ru.521处理后凋亡蛋白的表达情况；
17.图5为ru.521处理后cgas、sting、irf3蛋白的表达情况；
18.图6为ru.521处理后dna损伤标志性蛋白的表达变化；
19.图7为tcl小鼠经ru.521给药治疗后的肿瘤照片；
20.图8为tcl小鼠经ru.521给药治疗后的肿瘤重量及体积测试结果。
具体实施方式
21.下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
22.实施例1肿瘤细胞增殖抑制实验
23.实验材料：
24.6种tcl细胞系(购自atcc公司)：成人t细胞淋巴瘤mt-4细胞，淋巴母细胞淋巴瘤molt4细胞，淋巴母细胞淋巴瘤jurkat细胞，淋巴母细胞淋巴瘤c8166 细胞，蕈样综合征h9
细胞，蕈样综合征hut78细胞。
25.ru.521购自sellect公司。
26.实验方法：
27.取对数生长期的tcl细胞与ru.521(0.1um，1um，10um)于37℃、5％co2的条件下共同孵育24h、48h后，将不同条件下处理后的tcl细胞100u加入96孔板，每组3个复孔，在避光的条件下每孔加10ul cck8试剂，孵育2-4h后，450nm波长处读取吸光度值，按如下公式计算细胞增殖活力：
28.细胞增殖活力(比值)＝[加药组吸光度值-空白孔吸光度值]/[对照组吸光度值-空白孔吸光度值]
[0029]
其中，加药组：具有细胞、cck8和药物溶液(ru.521)的孔；空白组：具有培养基、cck8、而没有细胞的孔；对照组：具有细胞、cck8、而没有药物溶液的孔。测试结果见图1。
[0030]
图1为tcl细胞经不同浓度ru.521处理后的细胞增殖活力测试结果，图1中，图1a为tcl细胞经不同浓度ru.521处理24h后的细胞增殖活力测试结果，图1b为 tcl细胞经不同浓度ru.521处理48h后的细胞增殖活力测试结果，可以看出，经不同浓度ru.521处理后，绝大多数tcl细胞系的存活率在一定范围内发生显著下调，在24h和48h组中趋势一致。
[0031]
实施例2 ru.521诱导tcl细胞发生凋亡
[0032]
取对数生长期的tcl细胞(mt-4，hut78，jurkat)与ru.521(1um，10um) 于37℃、5％co2的条件下共同孵育24h后，经流式细胞仪检测细胞凋亡情况，流式细胞仪检测细胞凋亡情况的方法为：取5-10万重悬的细胞，离心，弃上清，加入 annexin v-fitc结合液(fcmacs biotech co.,ltd.)轻轻重悬细胞，加入5μlannexin v-fitc和10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，室温(20-25℃)避光孵育 10-20分钟，上机进行流式细胞仪检测。结果见图2。
[0033]
图2为tcl细胞经不同浓度ru.521处理后的细胞凋亡情况的流式检测结果，可以看出，ru.521可诱导tcl细胞凋亡，凋亡水平呈浓度依赖性。
[0034]
实施例3蛋白质组dia分析挖掘ru.521作用靶点
[0035]
为了深入研究ru.521诱导tcl细胞凋亡的分子机制，挖掘ru.521的作用靶点，本研究拟通过dia模式定量蛋白质组分析方法，深入研究ru.521诱导tcl 细胞凋亡的分子机制，挖掘ru.521的作用靶点。首先，利用质谱dda模式建立 tcl细胞全蛋白质组谱图库：采集350-1250da内全部肽段，进行二级碎裂，实现蛋白和肽段的鉴定，建立谱图库。接下来，对加入ru.521诱导前后的tcl细胞(jurkat和mt-4)进行dia数据采集，每20da一个碎裂窗口，实现350-1250da 内全部肽段分段碎裂，利用diann软件进行肽段峰提取，进而实现蛋白质组的差异分析，结合统计学分析绘制差异蛋白质列表。最后，通过western blot验证，在tcl细胞中敲降或过表达候选基因后观察相应细胞表型的变化。
[0036]
图3为ru.521处理前后tcl细胞相关蛋白表达信号的蛋白质谱dia分析结果，图中圆点的大小表示的是加药后与未加药之间的蛋白表达量的比值，圆点越小表示加药后蛋白表达下降多，圆点大代表下降少，从图3可以看出，uimc1(rap80)下降最显著，说明ru.521处理后dna损伤修复定位信号分子uimc1(rap80)的表达被抑制。uimc1(rap80)参与受损dna的修复，抑制uimc1(rap80)的表达会削弱肿瘤细胞的dna损伤修复或降低dna稳定性，提高肿瘤细胞对放、化疗药物的敏感性。
[0037]
实施例4 western blot检测tcl中凋亡、磷酸化及dna损伤相关蛋白
[0038]
取对数生长期的tcl细胞(mt-4，hut78，jurkat)与ru.521(0um，1um，10um) 于37℃、5％co2的条件下共同孵育24h后，经western blot检测ru.521处理后凋亡蛋白的表达情况以及cgas、sting、irf3蛋白的表达情况，western blot检测方法为：收集ru.521处理后的细胞，并用ripa细胞裂解液裂解后，经离心机以 12000rmp离心后收集蛋白，之后经bca法定量蛋白，随后以每组等量的蛋白经电泳分离后，电转移至pvdf膜，以5％脱脂牛奶封闭一小时后，一抗孵育过夜，后二抗室温孵育一小时，通过ecl上机检测ru.521处理后凋亡蛋白的表达情况以及 cgas、sting、irf3蛋白的表达情况。
[0039]
图4为ru.521处理后凋亡蛋白的表达情况，可以看出，ru.521处理后，凋亡蛋白cleaved-caspase-3以及cleaved-parp表达均升高，同时抗凋亡蛋白bcl-2 表达降低，与流式检测结果一致；图5为ru.521处理后cgas、sting、irf3蛋白的表达情况，可以看出，ru.521处理后，cgas表达下降，ru.521抑制了tcl细胞的 cgas-sting及其下游蛋白的表达。
[0040]
图6为ru.521处理后dna损伤标志性蛋白的表达变化。结合图3和图6可以看出， ru.521作用后，uimc1(rap80)的表达被抑制，同时γ-h2ax水平上调，提示同时通过抑制uimc1(rap80)表达削弱了肿瘤细胞的dna损伤修复功能，组蛋白h2ax 的ser-139残基的磷酸化(γ-h2ax)标志着dna双链断裂(dsb)，被认为是最致命的dna损伤形式之一，严重损害了基因组稳定性，从而显著诱导细胞凋亡，对tcl细胞起到有效杀伤作用。
[0041]
实施例5 ru.521抑制小鼠体内tcl细胞生长
[0042]
构建tcl小鼠模型：
[0043]
将mt-4细胞用pbs重悬调整后，与基质胶按照体积比1：1混合后用于接种；选取6～8周龄雄鼠(购自维通利华公司)，通过前肢腋窝皮下接种mt-4细胞，1
×ꢀ
107cells/只，待肿瘤肉眼可见后定期测量肿瘤直径计算肿瘤体积，肿瘤大小计算公式：肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长径
×
肿瘤短径2，待肿瘤体积长至100～300mm3时，得到tcl小鼠。
[0044]
将tcl小鼠随机分为两组：对照组和ru.521组，每组3只，ru.521组按 75mg/kg的用量给予腹腔注射，隔天给一次药，治疗6次，对照组小鼠腹腔注射等量安慰剂，每4天检测肿瘤体积大小，连续监测12天，并在第12天后，拍照并称量肿瘤重量，确定受试物抗肿瘤药效。结果见图7。
[0045]
图7为tcl小鼠经ru.521给药治疗后的肿瘤照片，图8为tcl小鼠经ru.521 给药治疗后的肿瘤重量及体积测试结果，由图7和图8可以看出，加药组较未加药组的小鼠肿瘤体积随着时间明显减小，12天后两组小鼠之间肿瘤重量也存在显著差异。体内实验进一步验证了t细胞淋巴瘤中cgas-sting可能作为促肿瘤细胞增殖的作用因素的推测。