联合疗法的制作方法

联合疗法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年4月30日提交的美国临时专利申请第62/840,906号的优先权，该申请的内容全部通过引用并入本技术，并要求对其享有优先权。
3.序列表
4.该即时申请包含以ascⅱ格式通过电子方式提交的序列表，并在此通过引用纳入其整体。所述ascⅱ副本，创建于2020年4月29日，命名为072734_1037_st25.txt，大小为12,288字节。
技术领域
5.本公开涉及用于治疗例如癌症的疾病或病症的联合疗法。特别地，本公开提供了治疗方法，其包括施用基因工程细胞和放射。


背景技术：

6.放射疗法(xrt)通过肿瘤细胞的dna损伤局部发挥作用，并可诱导全身性远端效应，也就是说，它可以在放射场之外提供免疫介导的抗肿瘤反应。产生并形成全身性tcr介导的抗肿瘤免疫反应的新抗原的释放促进了这种反应(sridharan等,br j cancer(2016)；115:252-60；tang等,cancer immunol res(2014)；2:831-8)。检查点阻断与并行的xrt协同，可能是因为这增加了t细胞暴露于新抗原等,oncoimmunology(2014)；3:e28780；postow等,n engl j med.(2012)；366:925-31；park等,cancer immunol res(2015)；3:610-9；victor等,nature(2015)；520:373-7)。
7.各种免疫疗法和/或细胞疗法可用于治疗疾病和病症。例如，过继性细胞疗法(包括那些涉及施用表达对目标疾病或病症特异性的嵌合受体的细胞，如嵌合抗原受体(car)和/或其他重组抗原受体，以及其它的过继免疫细胞和过继性t细胞疗法)，可有效地治疗癌症和其它疾病和病症。替代的方法是需要的，例如，用于在某些患者群体中增加疗效和/或降低细胞因子释放综合征和/或用于治疗某些疾病或病症的方法。在所提供的实施方式中包括解决此类需求的方法和用途。


技术实现要素：

8.提供了用于治疗患有或疑似患有例如癌症或其他增生性疾病的疾病或病症的受试者的方法和组合物。在某些实施方式中，所述方法包括(a)向患有疾病或病症的受试者施用一定剂量的表达结合抗原的重组受体的细胞；和(b)向所述受试者施用放射，其中所述放射的施用启动时间不迟于施用所述重组受体表达细胞后约2周。
9.在某些实施方式中，放射的施用启动不迟于施用重组受体表达细胞后约一周。在某些实施方式中，在施用重组受体表达细胞后约5天至约10天之间开始施用放射。在某些实施方式中，受试者在放射给药启动时或在放射给药启动前没有复发。
10.在某些实施方式中，疾病或病症是肿瘤或癌症。所述疾病或病症可选自：血癌、b细
胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺癌、宫颈癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤文肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、及其组合。在某些实施方式中，血癌选自：白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴母细胞白血病(all)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom’s macroglobulinemia)、急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤和惰性b细胞淋巴瘤。在某些实施方式中，疾病或病症是多发性骨髓瘤。
11.所述抗原可以是肿瘤抗原或病原体抗原。在某些实施方式中，所述抗原是肿瘤抗原。所述肿瘤抗原可以选自：bcma，gprc5d，fcrl5，孤儿型酪氨酸激酶受体ror1，tegfr，her2，l1-cam，cd19，cd20，cd22，间皮素，cea和乙型肝炎表面抗原，抗叶酸受体，cd23，cd24，cd30，cd33，cd38，cd44，egfr，egp-2，egp-4，0epha2，erb-b2，erb-b3，erb-b4，fbp，胎儿型乙酰胆碱e受体，gd2，gd3，hmw-maa，il-22r-α，il-13r-α2，kdr，kappa轻链，lewis y，l1-细胞粘附分子，mage-a1，间皮素，muc1，muc16，psca，nkg2d配体，ny-eso-1，mart-1，gp100，瘤胎抗原，ror1，tag72，vegf-r2，癌胚抗原(cea)，前列腺特异性抗原，psma，her2/neu，雌激素受体，孕酮受体，ephrinb2，cd123，c-met，gd-2和mage a3，ce7，wilms瘤1(wt-1)，细胞周期蛋白和生物素化分子。在某些实施方式中，肿瘤抗原是bcma。
12.在某些实施方式中，所述重组受体是t细胞受体(tcr)或功能性非t细胞受体。在某些实施方式中，所述重组受体是嵌合抗原受体(car)。
13.car可包含特异性结合抗原的细胞外抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，所述细胞内信号传导结构域包含cd3-zeta(cd3ζ)链的细胞内结构域。所述细胞内信号传导结构域还可包括共刺激信号传导区。所述共刺激信号传导区可包括cd28或其部分的信号传导结构域，4-1bb或其部分的信号传导结构域，ox40或其部分的信号传导结构域，icos或其部分的信号传导结构域，dap-10或其部分的信号传导结构域，或其组合。在某些实施方式中，所述共刺激信号传导区包括4-1bb或其部分的信号传导结构域。
14.car还可包括跨膜结构域。所述跨膜结构域可包括cd8或其部分的跨膜结构域，或cd28或其部分的跨膜结构域。在某些实施方式中，所述跨膜结构域包含cd8或其部分的跨膜结构域。
15.在某些实施方式中，所述细胞外抗原结合结构域包含scfv。在某些实施方式中，所述细胞外抗原结合结构域包含：包含如seq id no：1所示的氨基酸序列的重链可变区(“v
h”)cdr1；包含如seq id no：2所示的氨基酸序列的v
h cdr2；包含如seq id no：3所示的氨基酸序列的v
h cdr3；包含如seq id no：4所示的氨基酸序列的轻链可变区(“v
l”)cdr1；包含如seq id no：5所示的氨基酸序列的v
l cdr2；和包含如seq id no：6所示的氨基酸序列的v
l cdr3。
16.在某些实施方式中，所述细胞是t细胞。所述t细胞可以选自：细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)和天然杀伤t(nkt)细胞。所述细胞对于受试者可以是自体的或异体的。
17.在某些实施方式中，所述细胞剂量包含足以降低受试者中疾病或病症的负担的细胞数量。在某些实施方式中，所述方法包括在向所述受试者施用第一剂量的重组受体表达细胞之后向所述受试者施用连续剂量的重组受体表达细胞。
18.所述放射可选自：外部束放射，放射性药剂及其组合。在某些实施方式中，所述放射是外部束放射。在某些实施方式中，向受试者的病变部位施用总共至少约10gy的放射。在某些实施方式中，向受试者的病变部位施用总共约10gy和约30gy之间的放射。在某些实施方式中，向受试者的病变部位施用总共约20gy的放射。
19.在某些实施方式中，所述放射的施用和所述重组受体表达细胞的施用提供了一种协同的远端效应。在某些实施方式中，所述放射的施用和所述重组受体表达细胞的施用提供了延迟或减少的crs样反应。在某些实施方式中，所述放射的施用和所述重组受体表达细胞的施用提供了新的t细胞受体(tcr)克隆的全身性扩增。
20.本文还提供了放射和表达结合抗原的重组受体的细胞用于治疗，其中在施用重组受体表达细胞后不迟于约2周开始施用放射。
附图说明
21.图1a-1f描述了bcma靶向car-t细胞治疗后进行放射治疗(xrt)导致临床反应、tcr克隆性的扩增和xrt后crs样结果。受试者接受环磷酰胺和氟达拉滨的调理治疗，随后在第0天使用car-t细胞。在第6天至第20天(方框)进行了10次以上的放射治疗(xrt)。图1a为治疗前的pet/ct扫描，显示广泛的骨内和骨外fdg-avid疾病，包括软组织和胸膜基肿块。图1b显示在xrt期间m峰(m-spike)开始下降。图1c显示治疗后8周的pet/ct显示mm病变的消退。图1d显示在xrt结束后，il6和crp(与car-t细胞活性相关的促炎标志物)的产生达到峰值。图1e所示为每日最高温度曲线，显示在il6和crp达到峰值时出现发烧。图1f为tcr克隆性分析，显示了新的tcr克隆的扩增。随着时间的推移，包含新扩增的克隆的tcr子集显示出来。
22.图2a和2b描述了放射治疗的局部早期反应。图2a显示了car-t细胞治疗前(左)和治疗后4周(右)(放射治疗结束后1周)的mri。图2b显示了放射场。在胸椎(t1至t8)进行5天以上的常规分段放射治疗，随后在全脑至c2进行5天以上的常规分段放射治疗。每个部位的总剂量为2000cgy，分5次。
23.图3a-3c描述了响应于car-t细胞治疗加放射治疗的其他的炎症标志物升高的情况。图3a为铁蛋白。图3b为d-二聚体。图3c为il-10。
24.图4描述了在高剂量类固醇开始逐渐减少后，包括整个放射治疗期间，car-t细胞扩增并保持持久性。通过pcr检测外周血中car转基因。
25.图5描述了在tcr克隆性扩增时期car-t细胞的持久性和xrt后crs样结果。在car-t细胞治疗5周后，通过流式细胞术使用荧光标记抗体识别由car载体额外表达的替代转导标志物以对患者血液中的car-t细胞进行评估。外周血单个核细胞的流式细胞术以cd3

活细胞设门。红色方框标出了转导标志物阳性的细胞(9.3％的循环t细胞)。注意，这些持久的基因修饰t细胞主要是cd8

。
26.图6所示为骨髓tcr库对外周血tcr库的映射。对同一时间点的骨髓和外周血单个核细胞的tcr库进行评价。采用morisita重叠指数(cd)比较tcr的多样性。
27.图7描述了在car-t细胞治疗上加入放射治疗，随着时间的推移增加了tcr库的多样性。morisita重叠指数(cd)的热图显示了随时间推移与外周血样本中tcr库的相似程度。指数范围从0(tcr克隆型没有重叠)到1(所有tcr克隆型在两个样本中都以相同的比例出现)。
28.图8显示高表达的基线tcr克隆在car-t细胞施用和放射治疗后没有扩增。显示了包含具有基线》2％频率的tcr克隆的tcr子集随时间推移的频率。
具体实施方式
29.本公开的主题提供了涉及对患有疾病或病症的受试者施用基因工程细胞和放射的治疗方法。所述细胞被设计成表达一种或多种重组受体，例如嵌合抗原受体(car)。
30.这里所使用的节标题仅用于组织目的，并不得被解释为限制所描述的主题。
31.为了明确披露的清晰性，而不是为了限制，详细的描述分为以下几个小节：
32.7.1.定义；
33.7.2.利用基因工程细胞和放射的治疗方法；
34.7.3.由细胞表达的重组受体；
35.7.4.基因工程细胞和产生细胞的方法；
36.7.5.基因工程细胞的组合物和制剂；
37.7.6.基因工程细胞的剂量；
38.7.7.放射治疗；
39.7.8.放射治疗的施用；
40.7.9.减少疾病负担，疗效和存活；和
41.7.10.试剂盒
42.7.1.定义
43.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义通常为本领域的技术人员所普遍理解。
44.在本文中，术语“大约”或“约”是指某一由本领域的普通技术人员测定的特定值在可接受的误差范围内，这部分取决于该值是如何测量或测定的，即测量系统的局限性。例如，在本领域的实践中，“大约”可以指在3个或3个以上的标准差范围内。此外，“大约”可以表示给定值的高达20％，例如，高达10％、高达5％或高达1％的范围。或者，特别在生物系统或过程中，这个术语可以指在一个数量级内，例如在一个值的5倍或2倍之内。
45.如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的抗体分子，而且是指保留免疫原结合能力的抗体分子的片段。这样的片段在本领域中也是众所周知的，并且在体外和体内均经常使用。因此，如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的免疫球蛋白分子，而且是众所周知的活性片段f(ab')2和fab。缺少完整抗体fc片段的f(ab')2和fab片段，从循环中清除得更快，并且可能具有更少的完整抗体的非特异性组织结合(wahl等人，j.nucl.med.24:316-325(1983))。如本文所用，抗体包括完整的天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；fab、fab'、单链v区片段(scfv)、融合多肽和非常规抗体。在某些实施方式中，抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链。每条重链由重链可变区(在本文中简称为vh)和重链恒定(ch)区组成。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中简称为v
l
)和轻链恒定c
l
区组成。轻链恒定区由一个结构域c
l
组成。vh区和v
l
区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间散布有更保守的区，称为框架区(fr)。每个vh和v
l
由三个cdr和四个fr组成，它们从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。
抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。
46.如本文所用，“cdr”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见，例如，kabat等，sequences of proteins of immunological interest，第4版，美国国立卫生研究院卫生与公共服务部(1987)。通常，抗体在可变区中包含三个重链和三个轻链cdr或cdr区。cdr提供大多数接触残基，以使抗体与抗原或表位结合。在某些实施方式中，使用kabat系统勾勒出cdr区域(kabat，e.a，等(1991)sequences of proteins of immunological interest，第五版，美国卫生和公共服务部，nih出版号91-3242)。在某些实施方式中，使用chothia编号系统描述cdr(chothia等,j mol biol.(1987)196:901-17)。在某些实施方式中，使用abm编号系统描述cdr(abhinandan等,mol.immunol.2008,45,3832-3839)。在某些实施方式中，使用imgt编号系统描述cdr区域(可访问http://www.imgt.org/imgtscientificchart/numbering/imgtigvlsuperfamily.html，http://www.imgt.org/imgtindex/numbering.php)。
47.如本文所用，术语“单链可变片段”或“scfv”是共价连接以形成vh::v
l
异二聚体的免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(v
l
)的可变区的融合蛋白。vh和v
l
直接连接或通过肽编码接头(例如10、15、20、25个氨基酸)连接，该接头将vh的n端与v
l
的c端或vh的c端与v
l
的n端相连。接头通常富含甘氨酸以提高柔韧性，并富含丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度。
48.如本文所用，术语“接头”是指一个共价结合两个或多个多肽或核酸使它们彼此连接的功能基团(如化学品或多肽)。如本文所用，“肽接头”是指将两种蛋白质结合在一起(例如，结合vh和v
l
)的一个或多个氨基酸。尽管去除了恒定区并引入了接头，scfv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链fv多肽抗体可以由如huston等(proc.nat.acad.sci.usa,85:5879-5883,1988)所述的包括vh和v
l
编码序列的核酸表达。还参见美国专利第5,091,513号，第5,132,405号和第4,956,778号。以及美国专利公开号20050196754和20050196754。已经描述具有抑制活性的拮抗scfv(参见，例如，zhao等，hyrbidoma(larchmt)2008 27(6)：455-5l；peter等，j cachexia sarcopenia muscle 2012年8月12日；shieh等，j imunol 2009 183(4)：2277-85；giomarelli等，thromb haemost 2007 97(6)：955-63；fife等，j clin invst 2006 116(8)：2252-61；brocks等，immunotechnology 1997 3(3)：173-84；moosmayer等，ther immunol 1995 2(10：31-40)。已经描述具有刺激活性的激动性scfv(参见，例如，peter等，j bioi chern 2003 25278(38)：36740-7；xie等，nat biotech 1997 15(8)：768-71；ledbetter等，crit rev immunol 1997 17(5-6)：427-55；ho等，biochim biophys acta 2003 1638(3)：257-66)。
49.本文所使用的“f(ab)”是指与抗原结合的抗体结构的一个片段，但它是单价的并且没有fc部分，例如，一个抗体被木瓜蛋白酶消化产生两个f(ab)片段和一个fc片段(例如，一个重(h)链恒定区，不与抗原结合的fc区)。
50.本文所使用的“f(ab’)
2”是指由整个igg抗体经胃蛋白酶消化产生的抗体片段，其中该片段有两个抗原结合(ab’)(二价)区域，其中每个(ab’)区域包含两个独立的氨基酸链，由s-s键相连用于结合抗原的一条h链的一部分和一条轻(l)链，且其余h链部分连接在一起。“f(ab’)
2”片段可以分裂成两个独立的fab’片段。
51.本文使用的术语“载体”是指任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色
体、病毒、病毒颗粒等，其当关联有适当的控制元件时能够复制，并且其可以将基因序列转移到细胞中。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体和质粒载体。在某些实施方式中，载体是指能够传播与之相连的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体，以及作为整合到宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导它们所有效连接的核酸的表达。这样的载体在这里称为“表达载体”。
52.本文使用的术语“表达载体”是指一种重组核酸序列，即重组dna分子，其含有所需的编码序列和在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当的核酸序列。用于在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(可选的)和核糖体结合位点，通常伴有其它序列。已知真核细胞利用启动子、增强子和终止子及聚腺苷酸化信号。
53.本文使用的术语“亲和力(affinity)”是指结合强度的量度。亲和力取决于抗体结合位点和抗原决定簇之间的立体化学匹配的紧密程度、它们之间接触区域的大小以及带电和疏水基团的分布。如本文使用，术语“亲和力”还包括“亲合力(avidity)”，其是指形成可逆复合物后抗原-抗体键的强度。用于计算抗体对抗原的亲和力的方法在本领域是已知的，包括但不限于各种抗原结合实验，如功能试验(例如，流式细胞术试验)。
[0054]“基本同一性”或“基本同源性”是指与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文描述的任一核酸序列)表现出至少约50％同源性或同一性的多肽或核酸分子。在某些实施方式中，这样的序列与用于比较的氨基酸或核酸序的列为至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性。
[0055]
序列同一性可以通过使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组的序列分析软件包，威斯康星州麦迪逊市53705大学大道1710号，blast、bestfit、gap或pileup/prettybox程序)进行测量。这样的软件通过将同源性程度分配给各种取代、缺失和/或其它修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，其中e-3和e-100之间的概率得分指示密切相关的序列。
[0056]“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况、疾病或病症，例如肿瘤和细胞的病原体感染。
[0057]“调节”是指正或负改变。示例性调节包括约1％、约2％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或约100％的变化。
[0058]“增加”是指正改变至少约5％。改变可以为约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、约100％或更多。
[0059]“减少”是指负改变至少约5％。改变可以为约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％或甚至约100％。
[0060]
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯净的”是指物质在不同程度上不含在其原始状态下通常与其伴随的组分。“分离”表示与原始来源或环境的分离度。“纯化”表示分离度高于分离。“纯化的”或“生物纯净的”蛋白质充分不含其它物质，以使任何杂质均不会实质性地影响蛋白质的生物学特性或引起其它不利后果。也就是说，如果核酸或肽通过重组
dna技术生产而基本不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者通过化学合成而基本不含化学前体或其它化学品，则其是纯化的。纯度和均质性通常使用分析化学技术确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一个条带。对于可以进行修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，可以将其分别纯化。
[0061]“分离的细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞组分分离的细胞。
[0062]
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指能够特异性结合细胞上存在的特定抗原决定簇或抗原决定簇组的结构域。
[0063]“肿瘤(neoplasm)”是指以细胞或组织的病理性增生及其随后向其它组织或器官的迁移或侵袭为特征的疾病。肿瘤的生长通常是不受控制的和进行性的，并且在不引起正常细胞增殖或者导致正常细胞增殖停止的条件下发生。肿瘤可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自以下的器官：膀胱、骨骼、大脑、乳房、软骨、神经胶质、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道，子宫和阴道、或其组织或细胞类型。肿瘤包括癌症，例如肉瘤、肿瘤或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。
[0064]“识别”是指选择性地结合靶标。识别肿瘤的t细胞可以表达与肿瘤抗原结合的car。
[0065]“特异性结合”是指多肽或其片段识别并结合所关注的生物分子(例如多肽)，但基本上不识别并结合样品中的其他分子，例如天然地包括本发明多肽的生物样品中的其他分子。
[0066]
本文所使用的术语“肿瘤抗原”包括只存在于肿瘤细胞上而不存在于其他细胞上的肿瘤特异性抗原(tsa)和存在于一些肿瘤细胞和一些正常细胞上的肿瘤相关抗原(taa)。在某些实施方式中，肿瘤抗原是tsa。在某些实施方式中，与正常或非肿瘤细胞相比，肿瘤抗原在肿瘤细胞上的表达是独特的或有差异的。在某些实施方式中，肿瘤抗原包括任何由肿瘤表达的能够通过抗原识别受体(如间皮素)激活或诱导免疫反应或能够通过受体-配体结合抑制免疫反应的多肽(如cd47，pd-l1/l2，b7.1/2)。
[0067]
术语“包含”，“包括”旨在具有美国专利法中赋予它们的广义含义，并且可以表示“含有”，“包含”等。
[0068]
本文所使用的“治疗(treatment)”(及其语法变体，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指的是疾病或病症或病情、或与之相关的症状、不良影响或结果或表型的完全或部分改善或减少。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、和缓解或改善预后。该术语并不意味着完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果有效。
[0069]
本文所使用的“延缓疾病的发展”是指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、抑制和/或延缓疾病(如癌症)的发展。这种延缓可能有不同的时间长度，取决于疾病史和/或正在接受治疗的个体。对于本领域技术人员来说显而易见的是，充分或显著的延缓实际上可以包括预防，因为个体不会患上这种疾病。例如，晚期癌症，如转移的发展，可被延缓。
[0070]
本文所使用的“预防”，包括对可能易患该疾病但尚未诊断出该疾病的受试者的疾
病发生或复发提供预防。在某些实施方式中，所提供的细胞和组合物用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
[0071]
本文所使用的“抑制”功能或活性是指与除目的条件或参数外其他都相同的条件相比或与另一个条件相比，该功能或活性有所减少。例如，抑制肿瘤生长的细胞与没有该细胞时的肿瘤生长速度相比降低了该肿瘤的生长速度。
[0072]
药剂(例如，药物制剂、细胞或组合物)的“有效量”是指在给药的情况下，在必要的时间内按剂量/数量达到预期结果(如治疗或预防结果)的有效量。
[0073]
药剂(例如，药物制剂或细胞)的“治疗有效量”是指按剂量以及在必要的一段时间内，达到预期治疗结果(如治疗疾病，病症，或病情，和/或治疗的药代动力学和药效学效果)的有效量。治疗有效量可以根据受试者的疾病状态、年龄、性别、体重以及施用的细胞群变化。在某些实施方式中，所提供的方法包括以有效量(如治疗有效量)施用细胞和/或组合物。
[0074]“预防有效量”是指按剂量和在必要的时间内，达到预期的预防效果的有效量。因为预防剂量是在受试者疾病之前或早期阶段使用的，预防有效量通常但也不是必要地会低于治疗有效量。在肿瘤负荷较低的情况下，某些方面的预防有效量会高于治疗有效量。
[0075]
本文中的“个体”或“受试者”是脊椎动物，例如人或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。非人动物受试者的非限制性实例包括啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔子；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；和非人灵长类动物，例如猿和猴子。在某些实施方式中，灵长类动物是猴子或猿。受试者可以是雄性或雌性，可以是任何合适的年龄，包括幼年、少年、青年、成年和老年受试者。在某些实施方式中，受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
[0076]
在本文中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式该包含复数指代物。例如，“a”或“an”表示“至少一个”或“一个或多个”。
[0077]
本文使用的“组合物”是指两种或多种产品、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水性、非水性，或其任何组合。
[0078]
在整个本公开中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应被解释为对所要求保护主题的范围的硬性限制。因此，一个范围的描述应该被认为是明确地披露了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，如果提供了一个范围值，则应当理解为，在该范围的上限和下限的每一个中间值和在规定范围内的任何其他规定的或中间值都被涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可单独包括在较小范围内，也包括在所要求的主题内，但须受所规定范围内任何具体排除的限制。如果所规定范围包括一个或两个限制，则不包括其中一个或两个限制的范围也包括在所要求保护的主题中。无论范围的广度如何，这都适用。
[0079]
7.2利用基因工程细胞和放射的治疗方法
[0080]
本发明的主题是基于以下发现：基因工程细胞(例如表达嵌合抗原受体(car)的t细胞)可以与放射源如外部束放射或放射性同位素(如放射性药物)联合使用，以提供治疗有效的抗癌作用。
[0081]
此外，基因工程细胞和放射源之间出乎意料的协同效应会产生增强的或协同的治疗效果，其中联合效应大于以治疗剂量施用细胞和放射各自所产生的加性效应。这些观察
结果支持了基因工程细胞(例如嵌合car表达的t细胞)可以与放射治疗联合使用来治疗疾病或病症(例如，癌症)。
[0082]
本公开至少是基于以下观察结果：对有需要的受试者进行包括施用有效量的如本文所述的基因工程细胞(例如，car表达的t细胞)的第一治疗程序和使用如本文所述的放射治疗的第二治疗程序的联合，可以提供a)协同的类远端效应，治疗有效的抗癌作用，延缓或减少crs样反应，和/或新的t细胞受体(tcr)克隆的全身性扩增(如在外周血中)。
[0083]
提供治疗包括各种癌症和肿瘤的疾病或病症的方法。在某些实施方式中，该方法包括施用(a)放射和(b)表达重组受体的细胞，这些重组受体被设计为能识别和/或特异性结合与要治疗的疾病或病症相关的分子(如抗原)并产生反应，例如，与这种分子结合而产生的免疫反应。重组受体包括嵌合受体，如嵌合抗原受体(car)和其他转基因抗原受体，包括转基因t细胞受体(tcr)。
[0084]
在某些实施方式中，所述方法的优点在于其治疗患有诸如癌症(例如，多发性骨髓瘤)等特定疾病或病症的受试者的能力，其通过在受试者接受表达重组受体的细胞(称为“重组受体表达细胞”)后不久开始放射治疗。例如，在某些实施方式中，所述方法包括在施用重组受体表达细胞后不迟于约两周开始放射治疗。在某些实施方式中，所述方法包括放射治疗的启动不迟于施用重组受体表达细胞后约一周。在某些实施方式中，所述方法包括放射治疗的启动在施用重组受体表达细胞后约5天至约10天之间。在某些实施方式中，所述方法包括放射治疗的启动在施用重组受体表达细胞后约5天。在某些实施方式中，所述方法包括放射治疗的启动在施用重组受体表达细胞后6天。
[0085]
在某些实施方式中，受试者在放射治疗开始时或刚开始前未复发。
[0086]
在某些实施方式中，所述方法包括将所述重组受体表达细胞或包含所述细胞的组合物施用于受试者、组织或细胞，例如患有、处于患病风险或怀疑患有疾病、病症或病情的人。
[0087]
在某些实施方式中，所述重组受体表达细胞或包含其的组合物被施用于患有要治疗的特定疾病或病症的受试者，例如通过过继细胞疗法，如过继t细胞治疗。在某些实施方式中，将所述重组受体表达细胞或包含其的组合物施用于受试者，例如患有疾病或病症或处于风险的受试者，以改善疾病或病症的一种或多种症状。
[0088]
被治疗的疾病或病症通常为与目标抗原的表达有关和/或与其病因有关的疾病或病症，例如，其中抗原引起、加剧该类疾病、病症、或病情或与该类疾病、病症、或病情有关，或者抗原仅仅是疾病或病症的标志物，或在疾病或病症的细胞上过度表达或独特表达。典型的疾病和病症可以包括但不限于与恶性肿瘤或细胞转化相关的疾病或病症(如癌症)。典型的抗原，包括如上所述的与可治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在某些实施方式中，car或tcr特异性地结合与疾病或病症相关的抗原。
[0089]
在这些疾病、病症和病情中，有肿瘤，包括实体瘤、血液系统恶性肿瘤(如血癌)和黑色素瘤，并且包括局部和转移性肿瘤。在某些实施方式中，受试者患有传染病，例如感染了病毒或其他病原体，如hiv、hcv、hbv、cmv和寄生虫病。
[0090]
在某些实施方式中，所述疾病或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、赘生物或其他增生性疾病或病症。这些疾病包括但不限于血癌(包括但不限于白血病、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴细胞白血病(all)、非霍奇金淋巴瘤(如难治性滤泡性淋巴瘤)、瓦尔登斯特
伦巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤、急性髓系白血病、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤和惰性b细胞淋巴瘤)、b细胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺癌、宫颈癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤和/或间皮瘤。在某些实施方式中，受试者患有血癌。在某些实施方式中，所述疾病为多发性骨髓瘤。
[0091]
在某些实施方式中，所述疾病或病症是一种感染性疾病病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原虫感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(cmv)、人类疱疹病毒(ebv)、腺病毒、bk多瘤病毒。在某些实施方式中，疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎，例如类风湿性关节炎(ra)、i型糖尿病、系统性红斑狼疮(sle)、炎症性肠病、牛皮癣、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫氏病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘、和/或与移植相关的疾病或病症。
[0092]
在某些实施方式中，与疾病或病症相关的抗原选自以下：bcma、孤儿型酪氨酸激酶受体ror1、tegfr、her2、li-cam、cd 19、cd20、cd22、间皮素、cea和乙肝表面抗原、抗叶酸受体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、egfr、egp-2、egp-4、0epha2、erb-b2、erb-b3、erb-b4、fbp、胎儿型乙酰胆碱e受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-alpha、il-13r-alpha2、kdr、kappa轻链、lewis y、ll细胞粘附分子、mage-a1、间皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配体、ny-eso-1、mart-1、gp100、瘤胎抗原、ror1、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特异性抗原、psma、her2/neu、雌激素受体、孕激素受体、ephrinb2、cd123、c-met、gd-2、mage a3、ce7、wilms瘤1(wt-1)、细胞周期蛋白(例如，细胞周期蛋白a1(ccna1))，生物素化分子，hiv、hcv、hbv和其他病原体表达的分子。在某些实施方式中，抗原为bcma。
[0093]
在某些实施方式中，所提供的方法可以提高在治疗时表现出特定水平的疾病负担(如形态学或轻微疾病)的受试者的总体生存率。
[0094]
7.3.细胞表达的重组受体
[0095]
在某些实施方式中，用于提供的方法或与提供的方法结合给药的细胞含有或被改造为含有重组受体(或工程受体)，例如工程抗原受体(如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr))。还提供了此类细胞群、包含此类细胞和/或富含此类细胞的组合物，例如其中富集或选择了某种类型的细胞，例如t细胞或cd8

或cd4

细胞。组合物包括用于给药的药物组合物和制剂，例如用于过继细胞疗法。还提供了根据所提供的方法将细胞和组合物给药于受试者(例如病人)的治疗方法。
[0096]
在某些实施方式中，所述细胞包含通过基因工程引入的一种或多种核酸，从而表达这些核酸的重组或基因工程产品。在某些实施方式中，基因转移首先通过刺激细胞来完成，例如通过将其与诱发诸如增殖、存活、和/或激活等反应的刺激相结合，例如，通过表达细胞因子或活化标记来判断，然后转导活化细胞，并在培养基中扩增至足以用于临床应用的数量。
[0097]
细胞通常表达重组受体，如抗原受体，包括功能性非tcr抗原受体，如嵌合抗原受体(car)，以及其他抗原结合受体，如转基因t细胞受体(tcr)。
[0098]
7.3.1.嵌合抗原受体(car)
[0099]
在所提供的方法和用途的某些实施方式中，所述重组受体是嵌合抗原受体(car)，它包括为抗原(如肿瘤抗原)提供特异性的细胞外抗原结合结构域和细胞内信号传导结构
域。在某些实施方式中，所述car包括跨膜结构域。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域是激活的细胞内结构域部分(如t细胞激活结构域)，提供主要的激活信号。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括促进效应体功能的共刺激信号传导区。在某些实施方式中，经基因工程进入免疫细胞的重组受体可以调节t细胞的活性，在某些情况下，可以调节t细胞的分化或稳态，从而导致基因工程细胞在寿命、生存和/或在体内的持久性方面有所提高，例如应用于过继细胞治疗方法中。
[0100]
包括car在内的典型的抗原受体以及工程化和引入受体进入细胞的方法，包括以下所描述的那些，例如，国际专利申请公开号wo200014257、wo2013126726、wo2012/129514、wo2014031687、wo2013/166321、wo2013/071154、wo2013/123061，美国专利申请公开号us2002131960、us2013287748、us20130149337，美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，欧洲专利申请号ep2537416，和/或sadelain等,cancer discov.2013april；3(4):388-398；davila等,(2013)plos one 8(4):e61338；turtle等,curr.opin.immunol.,2012october,24(5):633-39；wu等,cancer,2012march 18(2):160-75。在某些实施方式中，重组受体包括美国专利号：7,446,190中描述的car以及在国际专利申请公开号wo/2014055668a1中描述的那些。car的例子包括在上述任何公开中披露的car，例如，wo2014031687、us 8,339,645、us 7,446,179、us 2013/0149337，美国专利号：7,446,190、美国专利号：8,389,282，kochenderfer等,2013,nature reviews clinical oncology,10,267-276(2013)；wang等,(2012)j.immunother.35(9):689-701；和brentjens等,sci transl med.2013 5(177)。另请参阅wo2014031687、us 8,339,645、us 7,446,179、us 2013/0149337，美国专利号：7,446,190和美国专利号：8,389,282。
[0101]
重组受体，如car，通常包括细胞外抗原结合结构域，如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(vh)链区和/或可变轻(v
l
)链区。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含scfv。scfv可以是人、鼠或人源化的scfv。在某些实施方式中，scfv是人scfv。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含fab，其可任选地交联。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含f(ab)2。在某些实施方式中，上述任何分子都可以包含在具有异源序列的融合蛋白中，以形成细胞外抗原结合结构域。在某些实施方式中，通过使用抗原-fc融合蛋白筛选scfv噬菌体库来鉴定scfv。scfv可以从携带人v
l
和/或vh基因的小鼠中获得。scfv也可以替换为骆驼科重链(如，来自骆驼科，羊驼属的vhh)或细胞表面受体的部分天然配体。
[0102]
在某些实施方式中，受体所靶向的抗原是多肽。在某些实施方式中，它是碳水化合物或其他分子。在某些实施方式中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(如肿瘤或发病细胞)上选择性表达或过表达。在某些实施方式中，抗原在正常细胞和/或工程细胞上表达。在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。
[0103]
在某些实施方式中，受体所靶向的抗原包括但不限于bcma、g蛋白偶联受体(例如，g蛋白偶联受体家族c5组成员d(gprc5d))、fc受体样5(fcrl5)、孤儿型酪氨酸激酶受体ror1、tegfr、her2、li-cam、cd19、cd20、cd22、间皮素、cea和乙肝表面抗原、抗叶酸受体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、egfr、egp-2、egp-4、0epha2、erb-b2、erb-b3、erb-b4、fbp、胎儿型乙酰胆碱e受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-alpha、il-13r-alpha2、kdr、kappa
轻链、lewis y、ll细胞粘附分子、mage-a1、间皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配体、ny-eso-1、mart-1、gp100、瘤胎抗原、ror1、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特异性抗原、psma、her2/neu、雌激素受体、孕激素受体、ephrinb2、cd123、c-met、gd-2、mage a3、ce7、wilms瘤1(wt-1)、细胞周期蛋白(例如，细胞周期蛋白a1(ccna1))，生物素化分子。在某些实施方式中，受体靶向的抗原包括但不限于hiv、hcv、hbv和其他病原体表达的分子。
[0104]
在某些实施方式中，car与病原体特异性抗原结合。在某些实施方式中，car对病毒抗原(如hiv、hcv、hbv等)、细菌抗原和/或寄生虫抗原具有特异性。
[0105]
在某些实施方式中，重组受体(如car)靶向bcma(如，人bcma)。在某些实施方式中，本发明公开的主题的细胞表达了在国际专利申请公开号wo2016/090320中公开的bcma靶向car，其全部内容通过引用并入本文。在某些实施方式中，本发明公开的主题的细胞表达了smith等,molecular therapy(2018)；26(6):1447-1456中公开的bcma靶向car，其全部内容通过引用并入本文。在某些实施方式中，bcma靶向car的细胞外抗原结合结构域包括在wo2016/090320和wo2016/090327中公开的抗原结合片段(如scfv)，其全部内容通过引用并入本文。
[0106]
在某些实施方式中，car包括含有抗体或其片段的细胞外抗原结合结构域。在某些实施方式中，car包含细胞外抗原结合结构域和一个细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括scfv。
[0107]
在某些实施方式中，所述car包括细胞外抗原结合结构域，该结构域包括：包含如seq id no:1所示的氨基酸序列的重链可变区(“v
h”)cdrl；包含如seq id no:2所示的氨基酸序列的v
h cdr2；包含如seq id no:3所示的氨基酸序列的v
h cdr3；包含如seq id no:4所示的氨基酸序列的轻链可变区(“v
l”)cdrl；包含如seq id no:5所示的氨基酸序列的v
l cdr2；和包含如seq id no:6所示的氨基酸序列的v
l cdr3。在某些实施方式中，根据kabat编号系统对cdr进行标识。seq id no:1-6如下所示。
[0108][0109][0110][0111][0112][0113][0114]
在某些实施方式中，所述car包括细胞外抗原结合结构域，该结构域包括：包含如seq id no:7所示的氨基酸序列的v
h cdr1；包含如seq id no:8所示的氨基酸序列的v
h cdr2；包含如seq id no:3所示的氨基酸序列的v
h cdr3；包含如seq id no:4所示的氨基酸序列的v
l cdr1；包含如seq id no:5所示的氨基酸序列的v
l cdr2；和包含如seq id no:6所示的氨基酸序列的v
l cdr3。在某些实施方式中，根据chothia编号系统对cdr进行标识。seq id no:7和8如下所示。
[0115][0116][0117]
在某些实施方式中，所述car包含细胞外抗原结合结构域，该结构域包括：包含如
seq id no:9所示的氨基酸序列的v
h cdr1；包含如seq id no:10所示的氨基酸序列的v
h cdr2；包含如seq id no:3所示的氨基酸序列的v
h cdr3；包含如seq id no:4所示的氨基酸序列的v
l cdr1；包含如seq id no:5所示的氨基酸序列的v
l cdr2；和包含如seq id no:6所示的氨基酸序列的v
l cdr3。在某些实施方式中，根据abm编号系统对cdr进行标识。seq id no:9和10如下所示。
[0118][0119][0120]
在某些实施方式中，所述car包含细胞外抗原结合结构域，该结构域包括vh，所述vh包含与seq id no:11所示的氨基酸序列具有至少约80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述car包括细胞外抗原结合结构域，该结构域包括：包含如seq id no:11所示的氨基酸序列的vh。seq id no:11如下所示。
[0121][0122]
在某些实施方式中，所述car包括细胞外抗原结合结构域，该结构域包括v
l
，所述v
l
包含与seq id no:12所示的氨基酸序列具有至少约80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述car包括细胞外抗原结合结构域，该结构域包括：包含如seq id no:12所示的氨基酸序列的vh。seq id no:12如下所示。
[0123][0124]
在某些实施方式中，所述car包括细胞外抗原结合结构域，该结构域包括：包含如seq id no:13所示的氨基酸序列的v
h cdr1；包含如seq id no:14所示的氨基酸序列的v
h cdr2；包含如seq id no:15所示的氨基酸序列的v
h cdr3；包含如seq id no:16所示的氨基酸序列的v
l cdr1；包含如seq id no:17所示的氨基酸序列的v
l cdr2；和包含如seq id no:18所示的氨基酸序列的v
l cdr3。在某些实施方式中，根据rabat编号系统对cdr进行标识。seq id no:13-18如下所示。
[0125][0126][0127][0128][0129][0130][0131]
在某些实施方式中，所述car包括细胞外抗原结合结构域，该结构域包括：包含如
seq id no:19所示的氨基酸序列的v
h cdr1；包含如seq id no:20所示的氨基酸序列的v
h cdr2；包含如seq id no:15所示的氨基酸序列的v
h cdr3；包含如seq id no:16所示的氨基酸序列的v
l cdr1；包含如seq id no:17所示的氨基酸序列的v
l cdr2；和包含如seq id no:18所示的氨基酸序列的v
l cdr3。在某些实施方式中，根据chothia编号系统对cdr进行标识。seq id no:19和20如下所示。
[0132][0133][0134]
在某些实施方式中，所述car包括细胞外抗原结合结构域，该结构域包括：包含如seq id no:21所示的氨基酸序列的v
h cdr1；包含如seq id no:22中所述氨基酸序列的v
h cdr2；包含如seq id no:15中所述氨基酸序列的v
h cdr3；包含如seq id no:16中所述氨基酸序列的v
l cdr1；包含如seq id no:17中所述氨基酸序列的v
l cdr2；和包含如seq id no:18所述的氨基酸序列的v
l cdr3。在某些实施方式中，根据abm编号系统对cdr进行标识。seq id no:21和22如下所示。
[0135][0136][0137]
在某些实施方式中，所述car包含细胞外抗原结合结构域，该结构域包括vh，其包含与seq id no:23中列出的氨基酸序列具有至少约80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述car包括细胞外抗原结合结构域，该结构域包括：包含如seq id no:23所述氨基酸序列的vh。seq id no:23如下所示。
[0138][0139]
在某些实施方式中，所述car包含细胞外抗原结合结构域，该结构域包括v
l
，其包含与seq id no:24中列出的氨基酸序列具有至少约80％，至少约81％，至少约82％，至少约83％，至少约84％，至少约85％，至少约86％，至少约87％，至少约88％，至少约89％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述car包括细胞外抗原结合结构域，该结构域包括：包含如seq id no:24所述氨基酸序列的vh。seq id no:24如下所示。
[0140][0141]
在某些实施方式中，重组受体(如car)的抗体部分还包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分，如铰链区(如igg4铰链区)，和/或ch1/cl和/或fc区。在某些实施方式中，所述恒定区或部分是人igg，如igg4或igg1。在某些实施方式中，恒定区的部分作为抗原识别元件(如scfv)和跨膜结构域之间的间隔区。与没有间隔区相比，间隔区的长度可以增加抗原结
合后细胞的反应性。典型的间隔区包括但不限于hudecek等,(2013)clin.cancer res.,19:3153，国际专利申请公开号wo2014031687，美国专利号第8,822,647号或专利申请公开号第us2014/0271635号中描述的那些。
[0142]
在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域直接或间接地与细胞外抗原结合结构域相连。在某些实施方式中，car包括连接细胞外抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在某些实施方式中，所述细胞内信号传导结构域包括一个itam。例如，在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域与一个或多个细胞内信号传导元件相连接，例如在car的情况下，通过抗原受体复合物(如tcr复合物)模拟激活的信号传导元件，和/或通过另一个细胞表面受体的信号。
[0143]
在某些实施方式中，使用了天然与受体(例如car)中的一个结构域相关联的跨膜结构域。在某些实施方式中，通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与受体复合物的其他成员之间的相互作用。
[0144]
在某些实施方式中，跨膜结构域来自于天然来源或合成来源。如果来源是天然的，则在某些实施方式中，所述结构域来自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括来源于以下的那些(即至少包括以下的跨膜区)：t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cds、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。或者，在某些实施方式中，跨膜结构域是合成的。在某些实施方式中，所合成的跨膜结构域主要由疏水残基(如亮氨酸和缬氨酸)组成。在某些实施方式中，发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体存在于合成的跨膜结构域的每一端。在某些实施方式中，通过接头、间隔区和/或跨膜结构域进行连接。在某些实施方式中，跨膜结构域包括cd28的跨膜部分。在某些实施方式中，跨膜结构域包括cd8的跨膜部分。
[0145]
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域可以直接或间接连接。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域通过间隔区连接，如本文所述的任何间隔区。在某些实施方式中，重组受体(如car)包括衍生出跨膜结构域的分子的细胞外部分，如cd28细胞外部分或cd8细胞外部分。
[0146]
细胞内信号传导结构域包括模拟或模仿通过天然抗原受体的信号，通过这种受体与共刺激受体结合的信号，和/或仅通过共刺激受体的信号的那些。在某些实施方式中，短寡肽或多肽接头，例如，长度为2到10个氨基酸的接头(例如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，如，甘氨酸-丝氨酸双氨基酸接头)，在car的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间存在并形成连接。
[0147]
在某些实施方式中，t细胞激活被描述为由两类细胞质信号传导序列介导：一些是通过tcr(初级细胞质信号传导序列)启动抗原依赖的初级激活，以及一些是通过不依赖抗原的方式提供次级或共刺激信号(次级细胞质信号传导序列)。在某些实施方式中，所述car包括一种或两种这样的信号传导元件。
[0148]
重组受体(如，car)通常包括至少一种细胞内信号传导元件。在某些实施方式中，所述car包括一个调节tcr复合物的初级激活的初级细胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可能包含被称为免疫受体酪氨酸激活基序或itam的信号传导基序。包含初级细胞质信号传导序列的itam的例子包括衍生自cd3ζ链、fcrγ、cd3γ、cd3
δ和cd3ε的那些。在某些实施方式中，car中的细胞质信号传导分子包含细胞质信号传导结构域，其部分或衍生自cd3ζ的序列。
[0149]
在某些实施方式中，重组受体包括tcr复合物的细胞内元件，例如，介导t细胞激活和细胞毒性的tcr cd3链(如cd3ζ链)。因此，在某些实施方式中，抗原结合部分与一个或多个细胞信号传导模块相连接。在某些实施方式中，细胞信号传导模块包括cd3跨膜结构域、cd3细胞内信号传导结构域，和/或其他cd跨膜结构域。在某些实施方式中，重组受体(如car)还包括一个或多个额外分子(如fc受体γ和cd8、cd4、cd25或cd16)的一部分。例如，在某些实施方式中，car或其他嵌合受体包括cd3-zeta(cd3-ζ)或fc受体γ与cd8、cd4、cd25或cd16之间的嵌合分子。
[0150]
在某些实施方式中，在连接car或其他重组受体后，受体的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域至少激活免疫细胞(例如工程化表达car的t细胞)的一种正常效应器功能或反应。例如，在某些实施方式中，car诱导t细胞的功能，如细胞溶解活性或t辅助活性(如分泌细胞因子或其他因子)。在某些实施方式中，抗原受体元件或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分被用来代替完整的免疫刺激链，例如，如果它转导效应器功能信号。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括t细胞受体(tcr)的细胞质序列，并且在某些实施方式中，还包括那些在自然环境中与这些受体协同作用，在抗原受体参与后启动信号转导的共受体的细胞质序列。
[0151]
在天然tcr的情况下，完全的活化通常不仅需要通过tcr的信号传导，而且还需要一个共刺激信号。因此，在某些实施方式中，为了促进完全的活化，car中也包含一个产生次级或共刺激信号的元件。在某些实施方式中，所述car不包括用于产生共刺激信号的元件。在某些实施方式中，在同一细胞中表达额外的car并提供用于产生次级或共刺激信号的元件。
[0152]
在某些实施方式中，car既包括激活元件也包括共刺激元件。在某些实施方式中，所述car的细胞内信号传导结构域包括至少一个共刺激信号传导区。在某些实施方式中，所述至少一个共刺激信号传导区包括共刺激分子或其部分的细胞内结构域。共刺激分子的非限制性例子包括cd28、4-1bb、ox40、dap10和icos。在某些实施方式中，共刺激分子是cd28。在某些实施方式中，共刺激分子为4-1bb。
[0153]
在某些实施方式中，激活结构域包含在一个car中，而共刺激元件由识别另一个抗原的另一个car提供。在某些实施方式中，car包括激活性或刺激性car，共刺激性car，两者都在同一细胞上表达(见wo2014/055668)。在某些实施方式中，细胞包括一个或多个刺激性或激活性car和/或共刺激性car。在某些实施方式中，细胞进一步包含抑制性car(“icar”，见fedorov等,sci.transl.medicine(2013)；5:215)作为识别与疾病或病状有关并/或对其有特异性的抗原以外的抗原的car，从而通过抑制性car与其配体的结合，使通过靶向疾病的car递送的激活信号得以减少或抑制，例如，以降低脱靶作用。
[0154]
在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括与cd3(如cd3-ζ)细胞内结构域连接的cd28跨膜和信号传导结构域。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括与cd3(如cd3-ζ)细胞内结构域连接的4-1bb跨膜和信号传导结构域。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括与cd3ζ细细胞内结构域连接的嵌合cd28和cd137(4-1bb，tnfrsf9)共刺激结构域。
[0155]
在某些实施方式中，car在细胞质部分包含一个或多个(例如两个或多个)共刺激结构域和激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性的car包括cd3-ζ、cd28和4-1bb的细胞内元件。
[0156]
在某些实施方式中，重组受体还包括标记物，并且/或者表达car或其他抗原受体的细胞还包括替代标记物，例如细胞表面标记物，其可以用于确认用以表达受体的细胞的转导或改造。在某些实施方式中，标记物包括全部或部分(例如，截短形式)的cd34、ngfr或表皮生长因子受体，例如截短形式的该细胞表面受体(例如，tegfr)。在某些实施方式中，编码标记物的核酸与编码接头序列例如可切割接头序列例如t2a的多核苷酸可操作连接。例如，标记物和任选的接头序列可以如专利申请公开第wo2014031687号所公开中的任意者。例如，标记物可以是截短的egfr(egfrt)，其任选地与接头序列例如t2a可切割接头序列连接。
[0157]
在某些实施方式中，标记物是分子，例如，t细胞上未天然发现或者t细胞表面上未天然发现的细胞表面蛋白质或者其一部分。在某些实施方式中，分子是非自身(non-self)分子，例如，非自身蛋白质，即，不被细胞所要过继转移到其中的宿主的免疫系统识别为自身的蛋白质。
[0158]
在某些实施方式中，标记物不发挥治疗性功能，并且/或者不产生用作基因改造标记物(例如用于选择被成功改造的细胞)以外的作用。在其他实施方式中，标记物可以是治疗性分子或者另外施加一些所需效果的分子，例如，细胞要在体内遇到的配体，例如，共刺激或免疫检查点分子，以提高和/或抑制过继转移和遇到配体时的细胞反应。
[0159]
在某些实施方式中，car被称作是第一、第二和/或第三代car。在某些实施方式中，第一代car是在抗原结合时仅仅提供cd3-链诱导的信号的那些，例如不包含共刺激信号传导区。在某些实施方式中，第二代car提供这样的信号和共刺激信号，如car包括共刺激信号传导区(例如，细胞内信号传导结构域或共刺激分子(如cd28或4-1bb)的一部分)。在某些实施方式中，第三代car包括多个共刺激区域，例如不同共刺激分子(如cd28和4-1bb)的细胞内信号传导结构域。
[0160]
在某些实施方式中，car含有抗体例如抗体片段、作为或含有cd28或其功能性变体的跨膜部分的跨膜结构域、以及含有cd28或其功能性变体的信号传导部分和cd3ζ或其功能性变体的信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，car含有抗体例如抗体片段、作为或含有cd28或其功能性变体的跨膜部分的跨膜结构域、以及含有4-1bb或其功能性变体的信号传导部分和cd3ζ或其功能性变体的信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，car包括抗体，例如抗体片段、作为或含有cd8或其功能性变体的跨膜部分的跨膜结构域、以及含有4-1bb或其功能性变体的信号传导部分和cd3ζ或其功能性变体的信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，受体还包括间隔区，该间隔区含有ig分子例如人ig分子的一部分，例如ig铰链，例如igg4铰链，例如仅铰链的间隔区。
[0161]
在某些实施方式中，car包括抗体，例如抗体片段(包括scfv)，间隔区，例如含有免疫球蛋白分子一部分例如铰链区的间隔区和/或一个或多个重链分子的恒定区，例如含有ig-铰链的间隔区，含有全部或部分源自cd28的跨膜结构域的跨膜结构域，源自cd28的细胞内信号传导结构域，和cd3ζ信号传导结构域。在某些实施方式中，car包括抗体或片段例如
scfv，间隔区，例如任意的含有ig-铰链的间隔区，源自cd28的跨膜结构域，源自4-1bb的细胞内信号传导结构域，和cd3ζ信号传导结构域。在某些实施方式中，car包括抗体或其片段，如scfv，间隔区例如任意的含有ig-铰链的间隔区，源自cd8的跨膜结构域，源自4-1bb的细胞内信号传导结构域，和cd3ζ信号传导结构域。
[0162]
在某些实施方式中，编码这些car构建物的核酸分子还包括编码t2a核糖体跳过(skip)元件和/或tegfr序列的序列，例如在编码car的序列的下游。在某些实施方式中，也可以产生表达抗原受体(例如car)的t细胞，以将截短的egfr(egfrt)表达成非免疫原性选择表位(例如，通过引入编码由t2a核糖体开关隔开的car和egfrt的构建物，以从同一构建物表达两种蛋白质)，然后将其用作检测这些细胞的标记物(参见，例如，美国专利第8,802,374号)。
[0163]
由给予到受试者的细胞表达的重组受体例如car通常识别或特异性结合在被治疗的疾病或病症或其细胞中表达、与其相关并/或对其有特异性的分子。一经与该分子例如抗原特异性结合，受体通常向细胞中递送免疫刺激信号，例如itam-转导的信号，从而促进靶向疾病或病状的免疫反应。例如，在某些实施方式中，细胞表达car，其与疾病或病症的细胞或组织表达的或者与疾病或病症相关的抗原特异性结合。
[0164]
7.3.2tcr
[0165]
在某些实施方式中，重组受体包括重组t细胞受体(tcr)和/或由天然t细胞克隆的tcr。在某些实施方式中，从患者中识别、分离目标抗原(例如癌症抗原)的高亲和力t细胞克隆，并将其引入到细胞中。在某些实施方式中，目标抗原的tcr克隆已经在用人免疫系统基因(例如，人白血球抗原系统或hla)改造的转基因小鼠中产生。参见，例如，肿瘤抗原(参见，例如，parkhurst等人(2009)clin cancer res.15:169-180；和cohen等人.(2005)j immunol.175:5799-5808)。在某些实施方式中，使用噬菌体展示来分离针对目标抗原的tcr(参见，例如，varela-rohena等人.(2008)nat med.14:1390-1395；和li(2005)nat biotechnol.23:349-354)。
[0166]
在某些实施方式中，获得t细胞克隆之后，将tcrα和β链分离并克隆到基因表达载体中。在某些实施方式中，tcr的α和β基因通过一个小核糖核酸病毒2a核糖体跳跃肽连接，使得这两条链共表达。在某些实施方式中，tcr的遗传转移通过逆转录病毒或慢病毒载体或通过转座子来完成(参见，例如，baum等,(2006)molecular therapy:the journal of the american society of gene therapy.13:1050-1063；frocha等,(2010)molecular therapy:the journal of the american society of gene therapy.18:1748-1757；hackett等,(2010)molecular therapy:the journal of the american society of gene therapy.18:674-683)。
[0167]
7.4基因工程细胞和产生细胞的方法
[0168]
在某些实施方式中，所提供的方法包括向患有疾病或病症的受试者施用表达重组受体的细胞。用于引入基因工程化元件(如重组受体(如car或tcr))的各种方法都是众所周知的，并且可以与所提供的方法和组合物一起使用。示例性的方法包括转移编码受体的核酸的方法，包括通过病毒(例如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。
[0169]
表达受体并由所提供的方法给药的细胞是工程细胞。基因工程通常涉及将编码重组或工程化元件的核酸引入含有细胞的组合物中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化。
[0170]
7.4.1用于基因工程的载体和方法
[0171]
在某些实施方式中，使用重组感染性病毒颗粒(例如，源自猿猴病毒40(sv40)、腺病毒、腺相关病毒(aav)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在某些实施方式中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(例如，γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到t细胞中(参见，例如，koste等,(2014)gene therapy 2014apr 3.doi:10.1038/gt.2014.25；carlens等,(2000)exp hematol 28(10):1137-46；alonso-camino等,(2013)mol ther nucl acids 2，e93；park等,trends biotechnol.2011november 29(11):550-557)。
[0172]
在某些实施方式中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(ltr)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、骨髓增殖性肉瘤病毒(mpsv)、鼠胚胎干细胞病毒(mesv)、鼠干细胞病毒(mscv)、脾病灶形成病毒(sffv)或腺相关病毒(aav)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在某些实施方式中，逆转录病毒包括源自任何鸟类或哺乳动物细胞来源的病毒。逆转录病毒典型地是双嗜性的，意味着它们能够感染若干物种包括人的宿主细胞。在一个实施方式中，要表达的基因代替逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；miller和rosman,(1989)biotechniques 7:980-990；miller,a.d.(1990)human gene therapy 1:5-14；scarpa等,(1991)virology 180:849-852；bums等,(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:8033-8037；以及boris-lawrie和temin,(1993)cur.opin.genet.develop.3:102-109)。
[0173]
慢病毒转导的方法是已知的。示例性的方法描述于以下文献中，例如，wang等,(2012)j.immunother.35(9):689-701；cooper等,(2003)blood.101:1637-1644；verhoeyen等,(2009)methods mol biol.506:97-114；和cavalieri等,(2003)blood.102(2):497-505。
[0174]
在某些实施方式中，重组核酸通过电穿孔转移到细胞中(参见，例如，chicaybam等,(2013)plos one 8(3):e60298和van tedeloo等,(2000)gene therapy 7(16):1431-1437)。在某些实施方式中，重组核酸通过转座转移到t细胞中(参见，例如，manuri等,(2010)hum gene ther 21(4):427-437；sharma等,(2013)molec ther nucl acids 2,e74；和huang等,(2009)methods mol biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如current protocols in molecular biology,john wiley&sons,new york.n.y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进微粒轰击(johnston,nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶dna共沉淀(brash等,mol.cell biol.,7:2031-2034(1987))。
[0175]
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体描述于，例如，国际专利申请、公开号：wo2014055668和美国专利号7,446,190中。
[0176]
在某些实施方式中，细胞(例如，t细胞)可以在扩增期间或之后被转染，例如，使用t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。例如，引入所需受体的基因的这种转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以从初始刺激物(例如，cd3/cd28刺激物)释放基因修饰的细胞群体，随后将其用第二类型的刺激物例如经由从头诱导的受体刺激。该第二类型的刺激物可以包括以下形式的抗原性刺激物：肽/mhc分子，基因引入的受体的同源(交联)配体(例如，天然car受体)或者任何(例如通过识别受体内的恒定区)直接结合在新受体框
内的配体(例如抗体)。参见，例如，cheadle等,“chimeric antigen receptors for t-cell based therapy”methods mol biol.2012；907:645-66或barrett等,chimeric antigen receptor therapy for cancer annual review of medicine.vol.65:333-347(2014)。
[0177]
在一些情况下，可以使用不要求细胞例如t细胞被激活的载体。在一些这样的情况下，可以在激活之前对细胞进行选择和/或转导。因此，可以在细胞培养之前或之后对细胞进行改造，并且在一些情况下在培养的同时或者在至少一部分培养的过程中对细胞进行改造。
[0178]
在额外的核酸当中，例如，用于引入的基因是例如通过提高转移的细胞的生存力和/或功能来提高治疗效力的基因；为细胞的选择和/或评价提供基因标记物的基因，例如，以在体内评价存活或定位；提高安全性的基因，例如，通过使细胞在体内对阴性选择易感，如以下文献所述：lupton s.d.等,mol.and cell biol.,11:6(1991)；riddell,human gene therapy 3:319-338(1992)；还参见lupton等的pct/us91/08442和pct/us94/05601的公开，其说明了由将显性阳性选择标记物与阴性选择标记物融合得到双功能选择融合基因的用途。参见，例如，riddell等，美国专利号6,040,177，在第14-17栏。
[0179]
7.4.2细胞和基因工程细胞的制备
[0180]
在某些实施方式中，核酸是异源的，即，正常不存在于细胞或获自细胞的样品中，例如，获自另一有机体或细胞，例如，其通常不发现于被改造的细胞和/或这些细胞所源自的有机体中。在某些实施方式中，核酸不是天然存在的，例如，自然界不存在的核酸，其包括，包括编码来自多种不同细胞类型的不同结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
[0181]
所述细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在某些实施方式中，细胞来自于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，例如，先天或获得性免疫的细胞。在某些实施方式中，所述细胞是淋巴系统的细胞或骨髓系统的细胞。在某些实施方式中，所述细胞是淋巴系统的细胞。在某些实施方式中，所述淋巴系统的细胞选自t细胞、自然杀伤(nk)细胞、可从中分化出淋巴系统细胞的干细胞。干细胞可以是专能(multipotent)和多能干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞。在某些实施方式中，多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。细胞通常是原代细胞，例如，直接分离自受试者和/或分离自受试者并冷冻的细胞。在某些实施方式中，细胞包括t细胞或其他细胞类型的一种或多种亚群，例如整个t细胞群体、cd4

细胞、cd8

细胞及其亚群，例如，通过功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记物或细胞因子分泌图谱和/或分化程度定义的亚群。参考要治疗的受试者，细胞可以是同种异体和/或自体的。这些方法包括现成(off-the-shelf)的方法。在某些实施方式中，例如，对于现成的技术，细胞是多能和/或专能的，例如干细胞，例如诱导的多能干细胞(ipsc)。在某些实施方式中，该方法包括从受试者中分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或改造，并在冷冻保存之前或之后将其再引入到相同受试者中。
[0182]
在某些实施方式中，所述细胞是t细胞。t细胞和/或cd4

和/或cd8

t细胞的亚型和亚群的非限制性实例包括幼稚t(tn)细胞、自然杀伤t细胞、效应t细胞(t
eff
)、记忆t细胞及其亚型，如干细胞记忆t(t
scm
)、中枢记忆t(t
cm
)、效应记忆t(t
em
)、终末分化效应记忆t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、未成熟t细胞、成熟t细胞、辅助t细胞、细胞毒性t细胞、粘膜相关
不变性t(mait)细胞、调节性t(treg)细胞、辅助t细胞(例如th1细胞、th2细胞、th3细胞、th17细胞、th9细胞、th22细胞和滤泡辅助t细胞)、α/βt细胞和δ/γt细胞。
[0183]
在某些实施方式中，所述细胞是自然杀伤(nk)细胞。在某些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
[0184]
在某些实施方式中，细胞是骨髓系统的细胞。骨髓系统的细胞的非限制性实例包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、肥大细胞、红细胞、血小板和从中可分化出骨髓细胞的干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。
[0185]
在某些实施方式中，所述细胞包括一种或多种通过基因工程引入的核酸分子，从而表达此类核酸的重组或基因工程产物。在某些实施方式中，所述核酸分子是异源的，即正常不存在于细胞或获自细胞的样品中，例如从另一种生物体或细胞获得的，例如，通常不存在于被改造的细胞和/或产生这种细胞的生物体中。在某些实施方式中，核酸分子不是天然存在的，例如自然界中不存在的核酸分子，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸分子的嵌合组合的核酸分子。
[0186]
在某些实施方式中，工程细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码转基因受体例如car的核酸分子的细胞可以从样品(例如生物样品，如从受试者中获得或衍生自受试者的样品)中分离。在某些实施方式中，分离细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在某些实施方式中，受试者是需要特定治疗干预的人(例如细胞被分离、加工和/或改造的过继细胞疗法)。
[0187]
因此，某些实施方式中的细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、体液和其他样品，以及由一个或多个处理步骤(例如分离、离心、基因工程(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)产生的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液(例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由此衍生的加工样品。
[0188]
在某些实施方式中，从中提取或分离细胞的样品为血液或血液来源的样品，或者是或源自血液成分分离术(apheresis)或白细胞去除术的产物。典型的样品包括全血、外周血单个核细胞(pbmc)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠道相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官，和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的环境下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
[0189]
在某些实施方式中，细胞源自细胞系，例如t细胞系。在某些实施方式中，细胞获自异种来源，例如来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
[0190]
在某些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备步骤和/或基于非亲和性的细胞分离步骤。在某些实施方式中，在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育细胞，例如以去除不需要的成分、富集所需成分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在某些实施方式中，细胞基于一种或多种特性分离，例如密度、粘附特性、大小、敏感性和/或对特定成分的抵抗力。
[0191]
在某些实施方式中，来自受试者的循环血液的细胞例如通过血液成分分离术或白
cell expander)对cd3

和cd28

t细胞进行阳性选择。
[0200]
在某些实施方式中，通过阳性选择富集特定细胞群或通过阴性选择耗尽特定细胞群来实现分离。在某些实施方式中，通过用一个或多个抗体或其他结合剂(特异性结合一个或多个在阳性或阴性选择细胞上表达(标志物

)或表达在一个相对较高水平(标志物
高
)的表面标志物)孵育细胞来完成阳性或阴性选择。
[0201]
在某些实施方式中，通过对在非t细胞例如b细胞、单核细胞或其他白血球上表达的标记物例如cd14的阴性选择，从pbmc样品中分离t细胞。在某些实施方式中，采用cd4

或cd8

选择步骤分离cd4

辅助t细胞和cd8

细胞毒性t细胞。通过对在一个或多个幼稚、记忆和/或效应t细胞亚群上表达或以相对较高的程度表达的标志物的阳性或阴性选择，此类cd4

和cd8

群体可以被进一步分选为亚群。
[0202]
在某些实施方式中，cd8

细胞进一步富集或耗尽幼稚t细胞、中枢记忆t细胞、效应记忆t细胞和/或中枢记忆干细胞，例如通过基于与各自亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择。在某些实施方式中，进行中枢记忆t(t
cm
)细胞的富集以提高功效，例如改善给药后的长期存活、扩增和/或移植，这在某些实施方式中在此类亚群中特别稳健。见terakuraet等,(2012)blood.1:72-82；wang等,(2012)j immnnother.35(9):689-701。在某些实施方式中，组合富含t
cm
的cd8

t细胞和cd4

t细胞进一步增强功效。
[0203]
在某些实施方式中，记忆t细胞存在于cd8

外周血淋巴细胞的cd62l

和cd62l亚群中。pbmc可以富集或耗尽cd62l-cd8

和/或cd62l

cd8

部分，例如使用抗cd8和抗cd62l抗体。
[0204]
在某些实施方式中，中枢记忆t(t
cm
)细胞的富集基于cd45ro、cd62l、ccr7、cd28、cd3和/或cd127的阳性或高表面表达。在某些实施方式中，它基于对表达或高表达cd45ra和/或颗粒酶b的细胞的阴性选择。在某些实施方式中，通过耗尽表达cd4、cd14、cd45ra的细胞，并对表达cd62l的细胞进行阳性选择或富集来分离富含t
cm
细胞的cd8

群体。一方面，以基于cd4表达选择的阴性部分细胞开始，对其进行基于cd14和cd45ra表达的阴性选择，以及基于cd62l的阳性选择，进行中枢记忆t(t
cm
)细胞的富集。这样的选择在某些实施方式中是同时进行的，而在其他方面则以任一顺序依次进行。在某些实施方式中，相同的基于cd4表达的选择步骤用于制备cd8

细胞群体或亚群，也用于产生cd4

细胞群体或亚群，使得来自基于cd4分离的阳性和阴性部分均加以保留，并用于该方法的后续步骤中，任选地其在一个或多个进一步的阳性或阴性选择步骤之后。
[0205]
在某些实施方式中，对pbmc样品或其他白细胞样品进行cd4

细胞的选择，其中阴性和阳性部分均被保留。然后根据cd14和cd45ra或cd19的表达对阴性部分进行阴性选择，并根据中枢记忆t细胞的标志物特征(例如cd62l或ccr7)进行阳性选择，其中以任一顺序进行阳性和阴性选择。
[0206]
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，cd4

t辅助细胞被分选为幼稚细胞、中枢记忆细胞和效应细胞。cd4

淋巴细胞可以通过标准方法获得。在某些实施方式中，幼稚cd4

t淋巴细胞是cd45ro-、cd45ra

、cd62l

、cd4

t细胞。在某些实施方式中，中枢记忆cd4

细胞是cd62l

和cd45ro

。在某些实施方式中，效应cd4

细胞是cd62l-和cd45ro-。
[0207]
在某些实施方式中，为了通过阴性选择富集cd4

细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr、和cd8的抗体。在某些实施方式中，抗体或结合配偶体结合于固体支持物或基质(例如磁珠或顺磁珠)，以允许分离细胞进行阳性和/或阴性选
择。例如，在某些实施方式中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术分离或隔离细胞和细胞群(综述于methods in molecular medicine,vol.58:metastasis research protocols,vol.2:cell behavior in vitro and in vivo，p 17-25编辑：sa brooks和u.schumacherhumana press inc.,totowa,nj)。
[0208]
在某些实施方式中，制备方法包括在隔离、孵育和/或工程化之前或之后进行的冷冻(例如冷冻保存)细胞的步骤。在某些实施方式中，冷冻和随后的解冻步骤去除粒细胞，并且在一定程度上去除细胞群中的单核细胞。在某些实施方式中，将细胞(例如在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后)悬浮在冷冻溶液中。在某些实施方式中可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。例如，使用含有20％dmso和8％人血清白蛋白(hsa)的pbs，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基1:1稀释，使dmso和hsa的终浓度分别为10％和4％。然后细胞通常以每分钟1
°
的速度冷冻至-80℃并储存在液氮储存罐的气相中。
[0209]
在某些实施方式中，在基因改造之前或者与其结合，将细胞孵育和/或培养。孵育步骤可以包括培养(culture)、培育(cultivation)、刺激、活化和/或繁殖。孵育和/或改造可以在培养容器中进行，例如，单位、室、孔、柱、管、管道组、阀门、小瓶、培养皿、袋或其他用于细胞培养的容器。在某些实施方式中，将组合物或细胞在刺激条件或刺激试剂的存在下孵育。这些条件包括设计成诱导群体中细胞增殖、扩增、激活和/或存活，以模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因改造例如引入重组抗原受体的那些条件。
[0210]
条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如营养物、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白质、重组可溶性受体和任何其他设计成激活细胞的试剂。
[0211]
在某些实施方式中，刺激条件或试剂包括一种或多种试剂，例如，能够激活tcr复合物的细胞内信号传导结构域的配体。在某些实施方式中，试剂开启或引发t细胞中的tcr/cd3细胞内信号传导级联。这些试剂可以包括抗体，例如，对tcr组件和/或共刺激受体有特异性的抗体，例如，抗cd3、抗cd28，其与固体载体如珠子和/或一种或多种细胞因子结合。任选地，扩增方法还可以包括(例如，以至少大约0.5ng/ml的浓度)向培养基中加入抗cd3和/或抗cd28抗体的步骤。在某些实施方式中，刺激试剂包括il-2和/或il-15，例如，il-2浓度为至少大约10单位/ml。
[0212]
在某些实施方式中，孵育根据以下文献中所述的技术进行：riddell等人的美国专利第6,040,177号；klebanoff等人.(2012)j immunother.35(9):651-660；terakura等人(2012)blood.1:72-82；和/或wang等人.(2012)j immunother.35(9):689-701。
[0213]
在某些实施方式中，t细胞通过下方法增殖：向培养引发组合物中加入饲养细胞，例如不分裂的外周血单核细胞(pbmc)(例如，使得对于要增殖的初始群体中的每个t淋巴细胞，产生的细胞群体含有至少大约5、10、20或40或更多的pbmc饲养细胞)；和孵育培养物(例如，时间足够长，以使t细胞的数量扩大)。在某些实施方式中，不分裂的饲养细胞可以包括γ-辐照的pbmc饲养细胞。在某些实施方式中，pbmc用范围大约3000-3600拉德的γ射线辐照，以防止细胞分裂。在某些实施方式中，在加入t细胞群体之前，向培养基中加入饲养细胞。
[0214]
在某些实施方式中，刺激条件包括适合于人t淋巴细胞生长的温度，例如，至少大约25℃，通常为至少大约30℃，通常为大约37℃。任选地，孵育还可以包括加入不分裂的
ebv-转化的淋巴母细胞样细胞(lcl)作为饲养细胞。lcl可以用范围大约6000-10,000拉德的γ射线辐照。某些实施方式中的lcl饲养细胞可以任何适当的量提供，例如，lcl饲养细胞与初始t淋巴细胞的比例为至少大约10:1。
[0215]
在实施方式中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性t淋巴细胞获得抗原特异性t细胞(例如抗原特异性cd4

和/或cd8

t细胞)。例如，通过从受感染的受试者身上分离出t细胞并用相同的抗原在体外刺激细胞，可以产生针对巨细胞病毒抗原的抗原特异性t细胞系或克隆。
[0216]
7.5.基因工程细胞的组合物和制剂
[0217]
在某些实施方式中，提供包括用重组抗原受体例如car或tcr改造的细胞作为组合物或制剂，例如药物组合物或制剂。这些组合物可以根据提供的方法使用，例如用于预防或治疗疾病、病症和病情，或者用于检测、诊断和预防方法。
[0218]
术语“药物制剂”是指其形式使得其中含有的活性成分的生物活性有效、并且不含额外的对将会给予制剂的受试者来说不可接受的毒性的额外组分的制剂。
[0219]“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分之外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0220]
在某些实施方式中，载体的选择一部分由特定细胞或药剂和/或给药方法决定。因此，有多种合适的配方。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在某些实施方式中，使用两种或多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于，例如，remington's pharmaceutical sciences第16版，osol,a.ed.(1980)中。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲双铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯等对羟基苯甲酸烷基酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；盐形成反离子，如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(peg)。
[0221]
在某些实施方式中，缓冲剂包含在组合物中。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他酸和盐。在某些实施方式中，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法是已知的。典型的方法在例如remington:the science and practice of pharmacy,lippincott williams&wilkins；21st ed.(may 1，2005)中有更详细的描述。
[0222]
制剂或组合物还可以含有多于一种的用于采用细胞或试剂进行预防或治疗的特定适应症、疾病或病症有效的活性成分，其各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以对预期目的有效的量适当地组合存在。因此，在某些实施方式中，药物组合物进一步包括其他药物活性剂或药物，例如化疗药剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、氨甲蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱、长春新
碱等。在某些实施方式中，药剂或细胞以盐例如药学可接受的盐的形式给予。合适的药学可接受的酸加成盐包括衍生自以下酸的盐：无机酸，例如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸；和有机酸，例如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如，对甲苯磺酸。
[0223]
活性成分可以包埋在微胶囊中，胶体药物释放系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或者粗乳液中。在某些实施方式中，药物组合物配制成包合物，例如环糊精包合物复合物，或者配制成脂质体。脂质体可以起到将药剂或宿主细胞(例如t-细胞或k细胞)靶向特定组织的作用。制备脂质体可以有许多种方法，例如描述于szoka等，ann.rev.biophys.bioeng.,9:467(1980)和美国专利第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号和第5,019,369号。
[0224]
某些实施方式中的药物组合物可以使用时间释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得组合物的递送在要治疗的部位敏化之前发生，并有足够的时间导致敏化。许多种类型的释放递送系统是有效和已知的。这些系统可以避免组合物的反复给予，从而增加受试者和医师的便利性。
[0225]
在某些实施方式中，药物组合物包括有效治疗或预防疾病或病症的一定量(例如治疗有效量或预防有效量)的药剂或细胞。在某些实施方式中，治疗或预防效力通过对被治疗受试者的定期评价检测。对于在若干天或更长时间内重复给药，取决于条件，重复治疗，直至发生所需的疾病症状的抑制。但是，也可使用，并可以确定其他的剂量方案。要求的剂量可以通过组合物的单次大剂量灌注给药、通过组合物的多次大剂量灌注给药或者通过组合物的连续灌注给药来递送。
[0226]
用于过继细胞疗法的细胞给药方法是已知的并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，在gruenberg等的美国专利申请公开号第2003/0170238号中描述了过继t细胞疗法；授予rosenberg的美国专利第4,690,915号；rosenberg(2011)nat rev clin oncol.8(10)：577-85。参见，例如，themeli等,(2013)nat biotechnol 31(10):928-933；tsukahara等,(2013)biochem biophys res commun 438(1):84-9；davila等,(2013)plos one 8(4):e61338。
[0227]
在某些实施方式中，细胞疗法，例如过继细胞疗法(如过继t细胞疗法)，通过自体移植进行，其中细胞是从将接受细胞疗法的受试者身上或从来自这样的受试者的样本中分离和/或以其他方式制备的。因此，在某些实施方式中，细胞源自需要治疗和细胞的受试者(例如患者)，并且细胞在经过分离和加工之后施用于同一受试者。
[0228]
在某些实施方式中，细胞疗法，例如过继细胞疗法(如过继t细胞疗法)，通过同种异体移植进行，其中细胞是从除将接受或最终接受细胞疗法的受试者(如第一受试者)以外的受试者身上分离和/或以其他方式制备。在此类实施方式中，然后将细胞施用于相同物种的不同受试者(如第二受试者)。在某些实施方式中，第一和第二受试者基因相同。在某些实施方式中，第一和第二受试者基因相似。在某些实施方式中，第二受试者表达与第一受试者相同的hla类别或超型。
[0229]
药剂或细胞可以通过任何合适的方式给药，例如，通过大量输注(bolus infusion)，通过注射，例如，静脉或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔(trans-septal)注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、
subconjectval注射、结膜下注射、眼球筋膜下(sub-tenon's)注射、眼球后注射、眼球周注射或后巩膜旁递送。在某些实施方式中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给药，并且如果需要局部治疗，可病灶内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在某些实施方式中，通过单次大剂量推注细胞或药剂来给予指定的剂量。在某些实施方式中，将其通过细胞或药剂的多次大量输注给药例如在不超过3天的时间内或者通过细胞或药剂的连续输注给药来给予。
[0230]
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可以取决于要治疗的疾病的类型、药剂或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、出于预防性还是治疗性目的而给予药剂或细胞、在先的治疗、受试者的病史和对药剂或细胞的应答以及由主治医师决定。在某些实施方式中，将组合物一次性或经过一系列治疗适当地给予受试者。
[0231]
可以使用标准给药技术、制剂和/或装置来给药细胞或药剂。提供了用于组合物的储存和给药的制剂和装置，例如注射器和小瓶。对于细胞，给药可以是自体的或异体的。例如，细胞或祖细胞可以从一名受试者获得，并给药于同一受试者或不同的、相容的受试者。外周血衍生细胞或其后代(例如，体内、体外或体外衍生的)可以通过局部注射给药，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉注射或肠胃外给药。当给药治疗组合物(例如，含有基因修饰细胞或治疗或改善神经毒性症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配置成可注射形式(溶液、悬液、乳液)的单位剂型。
[0232]
制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂给药的那些。在某些实施方式中，药剂或细胞群经肠胃外给药。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给药。在某些实施方式中，通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送将药剂或细胞群给药于受试者。
[0233]
在某些实施方式中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在某些实施方式中可缓冲至选定的ph。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物在某种程度上更便于给药，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在合适的粘度范围内配制以提供与特定组织的更长接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可为包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。
[0234]
无菌可注射溶液可以通过将试剂或细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物也可以被冻干。组合物可含有辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝或增粘添加剂、防腐剂、调味剂、色素等，这取决于给药方式和所需的准备。在某些实施方式中可以参考标准文本来制备合适的制剂。
[0235]
可以添加提高组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来保证微生物的预防作用。通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可使注射剂型延长吸收时间。
[0236]
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，上述基质是成型制品例如膜或微胶囊的形式。
[0237]
用于体内给药的制剂通常是无菌的。无菌很容易实现，例如通过无菌过滤膜过滤。
[0238]
7.6.基因工程细胞的剂量
[0239]
在某些实施方式中，基因工程细胞的剂量大小或时间是由受试者中特定疾病或病症的功能决定的。根据所提供的描述，凭经验确定针对特定疾病的剂量大小或时间是在技术人员的水平之内的。对于疾病的预防或治疗，适当的剂量取决于要治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、这些细胞是用于预防还是治疗目的、既往治疗、受试者的临床病史和对细胞的反应以及主治医生的判断。在某些实施方式中，将组合物和细胞一次性或经过一系列治疗适当地给药于受试者。
[0240]
在过继细胞治疗的背景中，给予指定的“剂量”包括给予指定量或数量的细胞作为单一组合物和/或单次不间断的给药，例如，作为单次注射或连续输注，并且还包括在不超过3天的特定一段时间内，给予指定量或数量的细胞作为分次剂量(split dose)，其在多个单独的组合物或输注物中提供。因此，在一些情形中，首次或连续剂量是在单一时间点给予或开始的单次或连续的特定数量的细胞的给药。但是，在一些情形中，首次或连续剂量在不超过3天的时间段内，在多次注射或输注中给予，例如3天或2天内一天一次，或者通过在单日时间内多次输注。
[0241]
因此，在某些实施方式中，第一剂量的细胞在单一药物组合物中给予。在某些实施方式中，连续剂量的细胞以单一药物组合物给药。
[0242]
在某些实施方式中，第一剂量的细胞在合计含有第一剂量细胞的多个组合物中给予。在某些实施方式中，连续剂量的细胞在合计含有连续剂量细胞的多个组合物中给予。在某些实施方式中，额外的连续剂量可以在不超过3天的时间内在多个组合物中给予。
[0243]
给药的细胞量因接受治疗的受试者而异。在某些实施方式中，约1
×
104至约1
×
10
10
之间、约1
×
105至约1
×
109之间、或约1
×
106至约1
×
108之间的基因工程细胞(重组受体表达细胞)被施用于受试者(例如人受试者)。更有效的细胞可以以更少的数量施用。在某些实施方式中，至少约1
×
106、至少约1
×
107、至少约1
×
108(例如，约2
×
108、约3
×
108、约4
×
108，或约5
×
108)的基因工程细胞(重组受体表达细胞)被施用于受试者(例如，人受试者)。被认为有效的剂量的精确确定可以基于每个受试者个体因素，包括他们的大小、年龄、性别、体重和特定受试者的状况。本领域技术人员根据本公开内容和本领域知识可以容易地确定剂量。
[0244]
在某些实施方式中，细胞的数量和/或浓度是指表达重组受体(例如，car)的细胞的数量。在某些实施方式中，细胞的数目和/或浓度是指给药的所有细胞、t细胞或外周血单个核细胞(pbmc)的数目或浓度。
[0245]
在某些实施方式中，剂量的大小是基于一个或多个标准确定的，例如受试者对先前治疗(例如，化疗)的反应、受试者的疾病负担，(例如肿瘤负荷、体积、大小或程度、范围或转移的类型、阶段)和/或受试者出现中毒结果(例如，crs、巨噬细胞活化综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性)的可能性或发生率，和/或宿主对所施用的细胞和/或重组受体的免疫反应。
[0246]
在某些实施方式中，剂量的大小由受试者的疾病或病症的负担决定。例如，在某些实施方式中，给予的细胞数量基于给予细胞剂量之前即刻受试者中存在的肿瘤负担确定。在某些实施方式中，剂量大小与疾病负担呈负相关。在某些实施方式中，如在疾病负担严重的情况下，向受试者给药少量细胞。
[0247]
在某些实施方式中，在细胞数量方面，这些值指的是重组受体(例如car表达)表达细胞的数量；在其他实施方式中，它们是指施用的t细胞或pbmc或总细胞的数量。
[0248]
在某些实施方式中，可以给予一个或多个另外的连续剂量。在某些实施方式中，在连续剂量中给予的细胞数量与在任意在此的实施方式中第一剂量中给予的细胞数量相同或类似。在某些实施方式中，选择具体的剂量方案，以降低或最小化给予表达重组抗原受体的细胞时受试者中的毒性，例如国际专利申请公开号第wo2016/064929号中所述，其通过引用并入本文。
[0249]
在某些实施方式中，在特定的疾病或情形中如果要求或需要，提供的方法涉及以相比于第一剂量的细胞增加的数量、因而以更高的剂量给予连续剂量的细胞。在某些实施方式中，首先给予低剂量重组受体-表达(例如car-表达)细胞的方法可以降低受试者中的疾病负担，例如从形态学病变状态降低至最小病变，使得在受试者中后续给予更高剂量的重组受体-表达(例如car-表达)细胞不太可能在大多数被治疗的受试者中导致毒性结果。
[0250]
在某些实施方式中，在给予第一剂量之后、给予连续剂量之前，可对受试者进行肿瘤负担的评价，以确认与用第一剂量治疗之前存在的肿瘤负担相比较，肿瘤负担已降低。在某些实施方式中，如果对受试者的评价表明肿瘤负担降低和/或受试者表现出非形态学病变，例如分子水平上可检测的病变和/或最小病变，则提供的方法包括给予比首次或初始剂量高的连续剂量的重组受体-表达(例如car-表达)细胞。在某些实施方式中，如果对受试者的评价表明肿瘤负担没有降低和/或受试者表现出形态学病变，则提供的方法包括给予等于或小于首次或初始剂量的连续剂量的重组受体-表达(例如car-表达)细胞。
[0251]
在某些实施方式中，在给予首次或初始剂量的细胞之后受试者的肿瘤负担有可能已经通过第一剂量降低的时间，给予受试者连续剂量的重组受体-表达(例如car-表达)细胞。在某些实施方式中，给予连续剂量之前所有受试者中肿瘤负担均实际上被降低并非必需，但在被治疗的受试者中肿瘤负担平均上得以降低，例如，基于临床数据，其中大多数用该第一剂量治疗过的受试者表现出降低的肿瘤负担，例如，至少大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％或更多的用首次或初始剂量治疗的受试者表现出降低的肿瘤负担。通常，在疾病负担已通过第一剂量降低或者有可能已通过第一剂量降低之后的时间点，给予受试者连续剂量，从而进一步降低和/或消除疾病或其症状或结果或者防止其扩散或发展。在某些实施方式中，在连续给药时疾病负担降低的情形中，转移的细胞耗尽的可能性降低，从而提高了效力。与第一剂量相比较，连续剂量可以相同、更低或更高。在某些实施方式中，在第一剂量之后给予多个连续剂量。
[0252]
在某些实施方式中，以高于第一剂量的剂量给予连续剂量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞，使得通过连续剂量将数量增加的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞给予受试者。在某些实施方式中，较高剂量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞可以促进反应或效力的增加，例如，与给予较低剂量或数量的细胞所实现的情形相比较，肿瘤负担改善或有更多的降低和/或受试者的总生存期提高或更大。在某些实施方式中，由于给予第一剂量的细胞可以降低受试者中的肿瘤负担，以较高数量的细胞给予连续剂量，可以在给予连续剂量之后，在受试者中避免否则可能在具有形态学病变的受试者中发生的crs和/或神经毒性或使其最小化。
[0253]
在某些实施方式中，连续剂量大于第一剂量。例如，在某些实施方式中，连续剂量
包括多于约1
×
106个细胞(例如，约或至少约2
×
106、约3
×
106、约5
×
106、约1
×
107、约1
×
108或约1
×
109)重组受体(例如car)表达细胞。在某些实施方式中，连续剂量的量或大小足以减少疾病负担或其指标，和/或疾病或病症的一种或多种症状。在某些实施方式中，剂量的大小有效地提高受试者的生存期，例如，诱导受试者的生存期、无复发生存期或无事件生存期为至少6个月或者至少大约1、大约2、大约3、大约4或大约5年。在某些实施方式中，在连续剂量中给药的重组受体(例如，car)表达细胞(例如，表达car的t细胞)的数量和/或在连续剂量中，每体重受试者的细胞数目比在第一剂量中给予的数量多至少约2倍、约3倍、约5倍、约10倍。在某些实施方式中，与给予第一剂量或连续剂量之前即刻相比较，在连续剂量之后疾病负荷、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负荷或体积减少至少约50％、约60％、约70％、约80％或约90％或更多。
[0254]
在某些实施方式中，在连续剂量中给予的细胞数量低于在第一剂量中给予的细胞数量。
[0255]
在某些实施方式中，在第一剂量之后给予多个连续剂量，使得在给予连续剂量之后给予额外的剂量或多个剂量。在某些实施方式中，额外的剂量或多个剂量(即，第三个、第四个、第五个等等)中给予受试者的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或类似。在某些实施方式中，额外的剂量或多个剂量大于在先的剂量。
[0256]
在某些实施方式中，连续剂量相对于第一剂量和/或相对于彼此的时机设计成降低有害毒性结果的风险，并促进最大效力。在某些实施方式中，在受试者中疾病负担保持降低或受试者疾病负担平均降低(例如，基于临床数据)、但crs和/或神经毒性风险保持低的时候，给予连续剂量，例如相同、较低或较高的连续剂量。在某些实施方式中，通常在毒性结果或症状或其生化指标—例如crs或神经毒性、巨噬细胞激活综合症或肿瘤溶解综合症—等于或低于可接受水平时相对于首次或之前的剂量的时间点，给予连续剂量。例如，在初始剂量之后，可以在毒性结果达到高峰并在降低中或者已减少至低于可接受水平之后给予连续剂量。在某些实施方式中，通过监测和/或评价与毒性事件有关的一种或多种症状或结果的存在，并在确定症状或结果处在或低于可接受水平之后递送连续剂量，确定适当的时机。
[0257]
一旦将细胞施用于受试者(例如，人)，工程细胞的生物活性可以通过多种已知方法中的任一种来测量。要评估的参数包括工程或天然t细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，在体内(例如，通过成像)，或在体外(例如，通过elisa或流式细胞术)。在某些实施方式中，可以使用本领域任何已知的合适方法测量工程细胞破坏靶细胞的能力，例如细胞毒性试验(如kochenderfer等,j.immunotherapy,32(7):689-702(2009)和herman等,j.immunological methods,285(1):25-40(2004)中所描述)。在某些实施方式中，还可以通过测定某些细胞因子(例如cd107a、ifnγ、il-2和tnf)的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在某些实施方式中，通过评估临床结果(例如肿瘤负荷或负载的减少)来测量生物活性。在某些实施方式中，评估毒性结果、细胞的持续性和/或扩增、和/或宿主免疫反应的存在或不存在。
[0258]
7.7.放射治疗
[0259]
适用于本文所述的联合治疗的放射治疗包括但不限于外部束放射、包括放射的放射性同位素的放射性药剂、内部放射治疗、放射性核素治疗和放射手术。
[0260]
在某些实施方式中，本公开的联合方法包括使用外部束放射疗法。外部束放射疗
法使用放射(电离放射)源，该放射(电离放射)源是在受试者的外部(例如，受试者的病灶所在区域)，通常是放射性同位素，例如
60
co，
137
cs，或高能x射线源，例如线性加速器。在某些实施方式中，外部束放射治疗包括正电压(即，浅层)放射束以治疗和/或破坏存在于皮肤上的病变。在某些实施方式中，外部束放射治疗包括兆伏(例如，深层)放射束用于治疗内部病变，例如膀胱，肠道，前列腺，肺或脑的病变。在某些实施方式中，外部束放射治疗包括将x射线，伽马射线，电子束，质子束或电离核束传送给病变。在某些实施方式中，用线性加速器，准直器，钴机，浅层放射治疗(srt)仪，orthovoltage x射线仪进行外部束放射疗法。
[0261]
外部源产生直接进入病人的病灶(如肿瘤)部位的准直光束。通过将外部放射束以各种“机架”角度将光束聚集在病变(如肿瘤)部位射入患者体内，在肿瘤组织中维持给定剂量的放射的同时，放射对健康组织的不利影响得以减少。健康组织的特定体积元素沿着放射束的路径发生变化，从而减少了在整个治疗过程中对健康组织的每个这种元素的总剂量。还可以通过将放射束严格地对准肿瘤的垂直于放射束轴线的大体横截面减少对健康组织的照射。有许多系统可以产生这样的周向准直，其中一些使用多个滑动百叶窗，可以分段地生成任意轮廓的不透射线的掩模。
[0262]
在某些实施方式中，本公开的联合方法包括向受试者施用放射性药剂。如本文所定义的“放射性药剂”是指包含至少一个发出放射的放射性同位素的药剂。放射性药剂经常用于核医学中各种疾病的诊断和/或治疗。放射性标记的药剂，例如放射性标记抗体，包括用作放射源的放射性同位素(ri)。
[0263]
如本文所用，术语“放射性同位素”包括金属和非金属放射性同位素。基于放射性标记的药剂的医学应用来选择放射性同位素。当放射性同位素是金属放射性同位素时，通常使用螯合剂将金属放射性同位素结合到分子的其余部分。当放射性同位素是非金属放射性同位素时，非金属放射性同位素通常直接连接或通过接头连接到分子的其余部分。
[0264]
如本文所用，“金属放射性同位素”是可用于体内或体外的治疗或诊断程序的任何合适的金属放射性同位素。合适的金属放射性同位素包括但不限于：锕-225、锑-124、锑-125、砷-74、钡-103、钡-140、铍-7、铋-206、铋-207、铋-212、铋-213、镉-109、镉-115m、钙-45、铈-139、铈-141、铈-144、铯-137、铬-51、钴-55、钴-56、钴-57、钴-58、钴-60、钴-64、铜-60、铜-62、铜-64、铜-67、铒-169、铕-152、镓-64、镓-67、镓-68、钆l53、钆-157、金-195、金-199、铪-175、铪-175-181、钬-166、铟-110、铟-111、铱-192、铁-55、铁-59、氪-85、铅-203、铅-210、镏-177、锰-54、汞-197、汞203、钒-99、钕-147、镎-237、镍-63、铌95、锇-185 191、钯-103、钯-109、铂-195m、镨-143、钷-147、钷-149、镤-233、镭-226、铼-186、铼-188、铷-86、钌-97、钌-103、钌-105、钌-106、钐-153、钪-44、钪-46、钪-47、硒-75、银-110m、银-111、钠-22、锶-85、锶-89、锶-90、硫磺-35、钽-182、锝-99m、碲-125、碲-132、铊-204、钍-228、钍-232、铊-170、锡-113、锡-114、锡-117m、钛-44、钨-185、钒-48、钒-49、镱-169、钇-86、钇-88、钇-90、钇-91、锌-65、锆-89、锆-95和镝-165。
[0265]
如本文所用，“非金属放射性同位素”是可用于体内或体外的治疗或诊断程序的任何合适的非金属的放射性同位素(非金属放射性同位素)。合适的非金属放射性同位素包括但不限于：碘-131，碘-125，碘-123，磷-32，砹-211，氟-18，碳-11，氧-15，溴-76和氮-13。
[0266]
本领域普通技术人员可以根据肿瘤上存在的细胞表面分子选择特定的生物分子，用于对特定肿瘤进行放射性核素治疗。
a.leibel等,textbook of radiation oncology(1998)(w.b.saunders company出版)全文特别是章节13和14中找到。放射也可以通过其他方法传递，比如靶向递送(例如通过放射性“籽粒”)，或通过全身递送靶向放射性偶联物。j.；padawer等,combined treatment with radioestradiol lucanthone in mouse c3hba mammary adenocarcinoma and with estradiol lucanthone in an estrogen bioassay,int.j.radiat.oncol.biol.phys.7:347-357(1981)。
[0276]
对于肿瘤治疗，已经研究了α和β粒子发射器。α颗粒是特别好的细胞毒性剂，因为它们在一个或两个细胞直径内散发大量的能量。(β粒子发射器有相对较长的穿透范围(组织中2-12mm)，这取决于能量水平。远程穿透对于具有不均匀血流和/或受体表达的实体肿瘤尤为重要。即使当它们在靶组织内不均匀分布时，(β粒子发射器也能产生更加均匀的剂量分布。
[0277]
7.8.放射治疗的施用
[0278]
本公开的联合方法包括向受试者施用有效剂量的放射。放射可以通过靶向递送提供。还可以通过全身递送(例如，靶向放射性偶联物(如放射性标记抗体)的全身递送)提供放射。
[0279]
7.8.1.外部束放射的施用
[0280]
对于外部束放射的施用，量可以是每隔一天至少一次每次至少约1戈瑞(gy)的治疗量至病变部位。在某些实施方式中，以每天(每日)至少一次每次至少2戈瑞(gy)的治疗量至病变部位施用放射。在某些实施方式中，以每天(每日)至少一次每次至少约4戈瑞(gy)的治疗量至病变部位施用放射。在某些实施方式中，对病变部位每天至少一次，每周至少连续五天，以每次至少约2戈瑞(gy)的治疗量至病变部位进行放射给药。在某些实施方式中，每周至少五天，至少每天一次以每次至少约4戈瑞(gy)的治疗量至病变部位进行放射给药。在某些实施方式中，每日在病变部位每次约4戈瑞(gy)进行放射给药，持续五天。在某些实施方式中，在病变部位连续五天每日至少一次每次至少约4戈瑞(gy)进行放射给药。在某些实施方式中，在病变部位以每周三次每隔一天10gy的治疗量进行放射给药。
[0281]
在某些实施方式中，向需要的受试者的病变部位施用总共至少约5gy至约40gy(例如，约5gy和约30gy之间，在约10gy和约30gy之间，在约5gy和约20gy之间，在约10gy和约20gy之间，或在约10gy和约30gy之间)。在某些实施方式中，将总共至少约10gy施用于有此需要的受试者的病变部位。在某些实施方式中，将总共至少约20gy施用于有此需要的受试者的病变部位。在某些实施方式中，将至少约30gy施用于有此需要的受试者的病变部位。在某些实施方式中，将至少约40gy施用于有此需要的受试者的病变部位。在某些实施方式中，将总共约20gy施用于有此需要的受试者的病变部位。
[0282]
通常，受试者每周四或五次接收外部束治疗。整个治疗过程通常持续一到七周，具体取决于癌症的类型和治疗的目标。例如，受试者可以在30天内接受2gy/天的剂量。
[0283]
7.8.2.放射性药剂的施用
[0284]
存在许多用于施用放射性药剂的方法。例如，放射性药剂可以通过靶向递送或通过靶向放射性偶联物的全身递送(例如放射性标记的抗体、放射性标记的肽和脂质体递送系统)进行施用。
[0285]
在靶向递送的某些实施方式中，放射性标记的药剂可以是放射性标记的抗体。参
见，例如，ballangrud a.m.等cancer res.，2001；61:2008-2014and goldenber，d.m.j.nucl.med.，2002；43(5):693-713，其内容通过引用并入本文。在靶向递送的某些实施方式中，放射性药剂可以以脂质体递送系统的形式给药，例如小的单层囊泡、大的单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由各种磷脂形成，例如胆固醇，硬脂胺或磷脂酰胆碱。参见，例如，emfietzoglou d，kostarelos k，sgouros g.an analytical dosimetry study for the use of radionuclide-liposome conjugates in internal radiotherapy.jnucl med 2001；42:499-504，其内容通过引用并入本文。
[0286]
在靶向递送的某些实施方式中，放射性标记的药剂可以是放射性标记的肽。参见，例如，weiner re，thakur ml.radiolabeled peptides in the diagnosis and therapy of oncological diseases.appl radiat isot 2002nov；57(5):749-63，其内容通过引用并入本文。
[0287]
除了靶向递送外，近距离放射治疗可用于将放射性药剂递送到靶位点。近距离放射治疗是一种技术，使放射源尽可能接近于病变(例如，肿瘤)部位。通常，源直接插入病变(例如，肿瘤)。放射源可以是线，籽粒或棒的形式。通常，使用铯，铱或碘。
[0288]
必要的放射量可由该领域的技术人员根据某一特定类型的疾病或病症(如癌症)的已知剂量确定。在某些实施方式中，当放射与工程细胞一起施用以提供意想不到的协同效应(例如，一种协同的类远端效应)时，施用有效量的放射可引起癌症的停滞或消退。hdac抑制剂。
[0289]
7.9.减少疾病负担，疗效和生存
[0290]
符合本公开的方法的给药通常减少或阻止受试者中疾病或病症的扩张或负担。例如，在疾病或病症是肿瘤的情况下，该方法通常可以减少肿瘤大小，体积，转移，骨髓母细胞百分比或分子可检测的癌症，和/或改善与肿瘤负担相关的预后或生存或其他症状。
[0291]
疾病负担可包括受试者中或受试者的器官、组织或体液(如肿瘤的器官或组织或其他部位(如有转移迹象的部位))中疾病细胞的总数。例如，在某些血液恶性肿瘤的情况下，可以在血液或骨髓中检测和/或量化肿瘤细胞。在某些实施方式中，疾病负担包括肿瘤的质量，转移的数量或程度和/或骨髓中存在的母细胞的百分比。在某些实施方式中，受试者患有血癌。在某些实施方式中，受试者患有多发性骨髓瘤(“mm”)。疾病负担程度可以通过评估血液或骨髓中的残留的mm来确定，例如，基于国际骨髓瘤工作组(imwg)诊断标准。在某些实施方式中，如果检测到单克隆副蛋白(m峰)(例如，通过血清蛋白电泳(spep))，则受试者表现出形态学疾病。在某些实施方式中，如果单克隆恶性血浆细胞(pc)的骨髓浸润约为5％或更大，则受试者表现出形态学疾病。在某些实施方式中，如果检测到骨基和/或骨外的mm病变，则受试者表现出形态学疾病。在某些实施方式中，如果无法检测到m峰，单克隆恶性浆细胞(pc)对骨髓的浸润小于5％，和/或不存在骨基和/或骨外的mm病变，则受试者表现出完全或临床缓解。
[0292]
在某些实施方式中，在给药第一剂量后疾病或病症持续存在和/或给药第一剂量并不足以根除病人的疾病或病症。
[0293]
在某些实施方式中，与第一剂量之前疾病负担或与连续剂量之前的疾病负担相比，连续剂量的给药减少了疾病负担。在某些实施方式中，例如在复发的情况下，与第一剂量的给药后的疾病负担的峰值相比，连续剂量的给药可减少疾病负担。
[0294]
在某些实施方式中，与使用可替代的剂量方案的可比方法(例如，包含没有放射治疗的施用基因工程细胞的方法)观察到的减少相比，所述方法以更大的程度和/或更长的时间降低了疾病或病症的负担(例如肿瘤细胞的数量，肿瘤的尺寸，患者生存或无事件生存的持续时间)。
[0295]
在某些实施方式中，检测，评估或测量受试者中疾病或病症的负担。可以通过检测受试者身上、或受试者的器官、组织或体液(如血液或血清)中疾病或疾病相关细胞(例如肿瘤细胞)的总数来检测疾病负担。在某些实施方式中，通过测量固体肿瘤和/或转移的数量或程度来评估疾病负担，如肿瘤负担。在某些实施方式中，对受试者的生存、在一定时间内的生存、生存程度、无事件或无症状生存的存在和持续时间、或无复发生存进行了评估。在某些实施方式中，评估疾病或病症的任何症状。在某些实施方式中，规定了疾病或病症负担的量度。
[0296]
在某些实施方式中，与其他方法相比，所述方法提高了受试者的无事件生存率或总生存率。例如，在某些实施方式中，使用所述方法治疗的受试者的无事件生存率可能性在第一剂量的约五周，约六周，约七周，约八周，约三个月，约四个月，约五个月，约六个月后大于约40％，大于约50％，大于约60％，大于约70％，大于约80％，大于约90％，或大于约95％。在某些实施方式中，总生存率大于约40％，大于约50％，大于约60％，大于约70％，大于约80％，大于约90％，或大于约95％。在某些实施方式中，用所述方法治疗的受试者表现出无事件生存，无复发生存，或生存到至少约五周，约六周，约七周，约八周，约三个月，约四个月，约五个月，约六个月，至少约1年，约2年，约3年，约4年，约5年，约6年，约7年，约8年，约9年或约10年。在某些实施方式中，在第一剂量后提高了疾病进展的时间，例如进展的时间大于约6个月，至少约1年，约2年，大约3年，大约4年，约5年，大约6年，大约7年，大约8年，约9年，或者约10年。
[0297]
在某些实施方式中，通过所述方法治疗后，与其他方法相比，复发的概率减小。例如，在某些实施方式中，在第一剂量的约五周，约六周，约七周，约八周，约三个月，约四个月，约五个月，约六个月后复发率与其他方法(例如，包括在没有放射治疗的情况下施用基因工程细胞的方法)相比小约80％，小约70％，小约60％，小约50％，小约40％，小约30％，小约20％，或小约10％。
[0298]
7.10.试剂盒
[0299]
另外提供制品，例如试剂盒，其含有根据所提供实施方式中任意者、例如所述制剂或组合物中任意者的一个或多个细胞剂量(其可以存在于一个或多个容器中，例如袋子或小瓶，细胞的数量或浓度足以用于单个剂量或其一部分的给药)，以及说明书和/或包装材料或者具有用于根据本文所提供方法给药的指示的文献。在一些方面，说明书示出任意所述实施方式的警告或禁忌。
[0300]
8.实施例
[0301]
仅出于说明目的包括以下实施例，其无意于对本发明的范围加以限定。
[0302]
本发明无意被局限于例如为说明本发明各个方面而提供的具体公开的实施方式的范围。从本文的说明和教导，对所描述组合物和方法的各种修改将会是显而易见的。这些变化可以在不偏离本公开内容真实范围和精神的情况下加以实施，其均要落入本公开内容的范围内。
[0303]
实施例1-bcma靶向car-t细胞治疗加放射疗法治疗难治性骨髓瘤显示出潜在的协同作用
[0304]
概括：
[0305]
本实施例报告一例多发性复发难治性骨髓瘤患者，其临床病程显示对car-t细胞治疗和局部放射治疗(xrt)的协同类远端效应的证据。在接受b细胞成熟抗原(bcma)靶向car-t细胞治疗后不久，患者需要紧急大剂量类固醇和xrt进行脊髓压迫。尽管存在类固醇，但患者具有持久的全身反应，不能仅归因于xrt。xrt后的结果包括第二波发烧以及crp和il6升高，开始于car-t细胞后21天，这对于本试验中单独使用car-t细胞治疗的细胞因子释放综合征(crs)来说是晚的。考虑到xrt之后立即出现的这种类似于crs的反应，对患者t细胞受体(tcr)库的变化进行了超过10个连续时间点的调查。通过morista重叠指数(cd)对比t细胞多样性，发现尽管与基线相比，car-t细胞治疗后的多样性最初是稳定的(cd＝0.89-0.97，基线vs car-t细胞后4个时间点)，xrt结束后t细胞多样性发生变化，出现》30％新扩增tcr(cd＝0.56-0.69，基线vs xrt后4个时间点)。这些结果表明放射和car-t细胞疗法之间的潜在协同作用，导致了类远端效应。
[0306]
材料和方法
[0307]
临床方案：该患者接受了一项评估自体bcma靶向car-t细胞的试验(试验登记id：nct03070327；根据美国共同规则(us common rule)进行的试验；获得患者的书面知情同意)。基因修饰通过编码car的逆转录病毒完成，car由人来源的抗bcma scfv、cd8跨膜结构域、融合到“自切割”的p2a元件上的4-1bb和cd3ζ的信号传导结构域、和编码替代转导标记的单独基因组成(smith等,mol ther.(2018jun 6)；26(6):1447-1456)。在试验方案下，患者接受白细胞去除术，且外周血单个核细胞(pbmc)被冷冻。在适当的时间，对pbmc进行解冻、用cd3/cd28珠筛选和活化，并在il2的存在下扩增。在施用car-t细胞之前，患者接受了环磷酰胺和氟达拉滨(分别为300mg/m2和30mg/m2，连续3天)的淋巴细胞清除。这是一个3
×
3剂量递增试验，患者接受了3级剂量治疗，以计划的450
×
106剂量的car

活性t细胞。
[0308]
放射治疗：使用线性加速器(varian medical systems，palo alto，ca)递送使用6mv光子的外部束放射治疗。目标区域包括具有右侧脊旁肿瘤块的t1至t8椎体和全脑至c2椎体。使用常规的对穿场(胸部的ap/pa，和全脑的对穿侧)。总剂量为2000cgy，每天分5次到每个部位。
[0309]
细胞因子测量：通过在ella(protein simple；san jose,ca)上进行4路微流控夹层免疫试验，检测外周血清中的il-1β，il6，il-10和tnfα。使用abbott architect化学分析仪(abbott laboratories；chicago,il)通过自动免疫比浊法检测crp。使用tosoh aia 2000(tosoh bioscience；japan)通过自动化双位点免疫酶试验检测铁蛋白。使用stago sta-r max分析仪(stago；france)通过自动免疫比浊法检测d-二聚体。
[0310]
流式细胞术：为了给car-t细胞染色，使用了抗cd3克隆7d-6(thermo-fisher；waltham,ma)，抗cd3克隆3b5(thermo-fisher；waltham,ma)和西妥昔单抗(eli lilly,indianapolis,in)与lightning link标记盒(innova biosciences,cambridge,uk)结合。使用7aad排除判断生存力(thermo-fisher；waltham,ma)。在bd lsr
ꢀⅱ
(bd biosciences；san jose,ca)上进行流式细胞术，并用flowjo(flowjo llc；ashland,oregon)分析。
[0311]
tcr克隆型追踪：通过qiamp blood dna mini kit(qiagen；hilden，gr)从pbmc或
骨髓单核细胞中提取dna。通过immunoseq试验(adaptive biotechnologies；seattle,wa)采用tcr vβcdr3测序监测克隆型。
[0312]
结果
[0313]
临床评估
[0314]
2010年，一名63岁的非裔美国女性被诊断患上具有高危细胞遗传学(1q21扩增)的igaλ多发性骨髓瘤(mm)。她接受了8种治疗路线，包括来那度胺(lenalidomide)、硼替佐米(bortezomib)、波马度胺(pomalidomide)、卡非佐米(carfilzomib)、达拉单抗和自体干细胞移植的联合，每次都有进展。最近，她的疾病对用地塞米松，环磷酰胺，依托泊苷(etoposide)和顺铂(dcep)的治疗无效。她加入了一项bcma靶向car-t细胞治疗的临床试验，包括4-1bb共刺激结构域(smith等，mol ther.(2018jun 6)；26(6):1447-1456)(nct03070327)。她的临床病程在图1a-1f中示出。基线结果表明广泛病变，包括2.26g/dl的单克隆副蛋白(m峰)，基线骨髓活检显示了95％血浆细胞浸润，以及pet/ct扫描显示了广泛的骨基和骨外mm病变，包括广泛的软组织和胸膜肿块(见图1a)。
[0315]
患者接受了环磷酰胺/氟达拉滨的淋巴耗尽化疗，然后单独输注car-t细胞。此后不久，她表现出下肢无力和混乱的迹象。患者保持清醒和警觉，但是精神状态发生了改变，除了精神混乱外还表现出间歇性失语症、短期记忆能力下降(可以回忆起0/3对象)以及注意力/计算能力的下降(不会倒着拼world))。为了评估这些神经系统检测结果，获取了脊柱和大脑的mri，其显示出脊髓压迫和多发性硬膜外肿块导致大脑中线位移(图2a)。在car-t细胞后第5天，m峰从基线增加到2.83g/dl。虽然她的神经系统症状通过这一点解决了，但是，考虑到影像学显示病变压迫她的胸段脊髓以及mm血清学标志物增加，脊髓压迫的进展值得关注。因此，患者接受了高剂量类固醇(地塞米松从每12小时10毫克开始逐渐减量，共13天)和姑息性xrt至胸椎(t1至t8)，然后是全脑至c2；在car-t细胞后的6-20天递送(2000cgy分五次至每个位点，连续地)。她在4周时的mri显示在放射治疗部位的疾病几乎痊愈(见图2a)。
[0316]
除了在放射治疗部位的这种反应之外，随后观察到良好的全身性反应。car-t细胞后七周，她的m峰探测不到(图1b)。car t细胞后8周的pet/ct显示疾病的放射学完全消退，包括辐射场外的无数位点(图1c)。患者的临床反应持续到治疗后9个月。
[0317]
炎症反应
[0318]
前瞻性监测血清炎症标志物crp、铁蛋白和d-二聚体以及细胞因子il-6，il-10，tnfα和il-1β的变化。与car-t细胞活性相关的炎症标志物(davila等，sci transl med(2014)；6:224ra25)在放射治疗结束后不久增加。这些包括car-t细胞介导的细胞因子释放综合征(crs)(17)的特征标志物：il-6(从32pg/ml到333pg/ml)(见图1d)和crp(从6.43mg/dl到22.11mg/dl)(见图1d)，以及crs中通常升高的常见的炎症标志物：铁蛋白(从2,921ng/ml到13,197ng/ml(见图3a)和d-二聚体(从《150ng/ml到915ng/ml)(见图3b)。血清il-10具有双模峰。第一个峰出现在施用car-t细胞后的早期，与其他报道(kochenderfer等，j clin oncol(2017)；35：1803-13)的car-t细胞后血清il-10浓度峰值的时间以及本研究中其他患者出现crs的时间相对应(mailankody等,american society of hematology(2018)；132:959-959)。随后的第二个峰出现在放射治疗期间(见图3c)。在整个临床过程中，tnfα和il-1β保持稳定并在正常范围内(见图3c)。放射治疗结束前后，患者发烧至》39℃，没有感染的临
床或实验室证据(见图1e)。此时，她心跳过速到每分钟110次(从最近的60次/分钟基线开始)，并且sbp减少到90mmhg(从最近的110-130mmhg基线开始)；hr和bp在心跳过速和相对低血压的3天后回到基线。她不需要血管加压或补充氧气，因此这被认为是1级crs。延迟的crs样反应仅在该患者身上见过，在试验中的其他患者身上则没有(n＝13)。尽管使用了13天的全身性类固醇，但car-t细胞仍然扩增并持续存在(见图4)，在炎症反应前后，通过流式细胞术检测，car-t细胞占血液中cd3

细胞的9.3％(见图5)。鉴于放射治疗后这些crs样结果的时间关系，使用储存的样品研究了她的t细胞受体(tcr)库的变化的时间。
[0319]
tcr克隆型连续分析
[0320]
由于放射后的结果提示临床和实验室的结果通常与细胞因子释放综合征(crs)相关，因此使用存储的样本研究了患者t细胞受体(tcr)变化的时间。结果发现，患者的基线外周血tcr多样性反应了她的基线骨髓的tcr多样性(见图6；通过morisita重叠指数比较的tcr多样性；cd＝0.97)。鉴于外周血和骨髓之间的这种高度重叠，我们认为外周血可能是一个合适的替代品，可以用于研究这个患者骨内和骨外mm的tcr多样性随时间的变化。对患者的外周血tcr库的连续分析表明tcr多样性在car-t细胞输注后第一周的四个时间点稳定。在此期间，与基线相比，cd值为0.89-0.97(见图7)。在放射治疗结束后的第8天，在初始评估时注意到新的tcr克隆扩增的峰(cd＝0.56-0.69，car-t细胞治疗后4-19周vs基线)。这些新扩增的克隆在4周时占t细胞库的》30％。根据评估的最近时间点，许多人在car-t细胞输注后至少持续了19周(见图1f)。在基线高度表达的任何克隆中没有看到tcr克隆扩增(见图8)。
[0321]
讨论
[0322]
本实施例报告了一位接受car-t细胞治疗的难治性mm患者，几天后接受了紧急大剂量类固醇和姑息性xrt至全脑和胸椎。该结果说明了bcma靶向car-t细胞治疗如何可以促进消除大量mm负担(包括大量骨外疾病)，尽管早期和持续施用高剂量类固醇。此外，crs样临床症状和炎症标志物的时间与放射治疗后新的tcr克隆的扩增相吻合，支持xrt和car-t细胞疗法之间的协同效应。患者的临床病程表明，局部xrt联合car-t细胞治疗可以增强全身的抗肿瘤效果。
[0323]
对于tcr克隆性的频繁、连续地评估，依赖外周血单个核细胞。尽管mm是一种基于骨髓的恶性肿瘤，且骨髓是可获取的，但骨髓不能像外周血一样频繁地取样。结果发现，当在同一时间点评估时，患者的骨髓单核细胞和pbmc在tcr库中有高度重叠(cd＝0.97)。因此，得出的结论是，外周血中的tcr克隆性与该患者广泛存在的mm相关。
[0324]
tcr库的连续分析显示了新的tcr克隆的扩增符合crs的临床和实验室体征。在这位先前接受过car t细胞治疗的患者接受放射治疗后不久，这些事件的汇合支持了放射治疗和car t细胞治疗之间协同作用的可能性。
[0325]
本研究的一个局限性是，存储的材料数量不够，无法确定驱动特异性tcr克隆扩增的抗原靶点。然而，在xrt后新扩增的tcr克隆占t细胞群的》30％，而car

t细胞组成了cd3细胞的～10％，这表明至少有一些t细胞的扩增是由非car修饰的t细胞驱动的。
[0326]
单独的放射治疗或联合检查点阻断，是已知可以“塑造(shape)”扩增克隆的tcr库(sridharan br j cancer(2016)；115:252-60；twyman-saint等,nature(2015)；520:373-7)。然而，鉴于car导致hla非依赖性的t细胞激活，局部放射治疗可以像激活检查点阻断一
样激活car-t细胞的全身反应，即通过远端效应增加新抗原暴露，但这并不一定是直观的(postow等,n engl j med.(2012)；366:925-31)。
[0327]
car-t细胞和放射治疗的协同作用可能通过若干可能的机制发生：(1)协同作用可以通过car-t细胞分泌的细胞因子来解释，增加了内源性t细胞的类远端效应。(2)如临床前所示，放射治疗可能会增强car-t细胞的效应器功能和迁移(weiss等,clin cancer res(2018)；24:882-95；deselm等,mol ther(2018)；26:254-52)。(3)通过car-t细胞的tcr增强的信号传导可能增强克隆性car-t细胞的扩增。这些机制或未知机制的组合也是可能的解释。
[0328]
类似的现象可能在接受car t细胞治疗的cns淋巴瘤患者复发后起作用，肿块活检促进了临床缓解(abramson等,n engl j med(2017)；377:783-4)。这些观察结果支持car-t细胞治疗联合放射治疗的进一步研究。
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本公开的主题的实施例
[0330]
从上述描述中，显而易见的是，可以对本公开的主题进行变化和修改以将其应用于各种用法和条件。这些实施例也在权利要求的范围内。
[0331]
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[0332]
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