减毒猪流行性腹泻病毒的制作方法

减毒猪流行性腹泻病毒
1.背景
2.猪流行性腹泻(epidemic diarrhea，ed)具有高度传染性，其特征是猪(尤其是哺乳仔猪)脱水、腹泻和高死亡率。其致病因子，猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)，是属于冠状病毒科(coronaviridae)α冠状病毒属的单链正义rna病毒。pedv的总基因组大小约为28kb，包含7个开放阅读框。pedv病毒感染的症状通常与传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，tgev) 和猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus，pdcov)引起的症状相似，这两种病毒也都是冠状病毒科的成员。应该注意的是，通常没有观察到pedv病毒与tgev之间的交叉保护作用，总体病毒核苷酸序列的相似度至多约60％。
3.可能大约在1970年在欧洲首次观察到ped病毒，随后对致病病毒进行了表征(例如，参见m.pensaert等人arch.virol，第58卷，第243-247页，1978和d.chasey等人，res.vet sci，第25卷，第 255-256页，1978)。pedv直到2013年才在北美被发现，当时爆发了大范围的疫情，给养猪业带来了严重的经济损失。该病毒在几天内出现在多个广泛分布的母猪群中，并已传播到至少32个州。生产者可以预计初生仔猪的损失高达100％。目前对感染管理的建议包括实施严格的生物安全和/或有意将整个畜群暴露于pedv以实现免疫。
4.在1970年代和1980年代，pedv在几个欧洲国家引起了广泛的流行病；但自1990年代以来，ped在欧洲变得罕见，偶尔爆发。这种经典的pedv病毒株随后传播到诸如日本、中国、韩国等亚洲国家。自2010年以来，中国报告了严重的ped动物流行病爆发，从这些爆发中恢复的pedv与经典的pedv毒株在遗传上有所不同。美国猪最初的ped爆发与在中国观察到的爆发有相似的临床表现。序列分析显示，最初的美国pedv(以下称为美国pedv原型毒株)与2011-2102 年间在中国流行的一些pedv在遗传上最为相似。2014年1月，在美国猪群中鉴定了一种pedv变异株，与美国pedv原型毒株相比，该变异毒株在刺突蛋白(spike)基因中有插入和缺失(indel)。这种变异毒株被命名为美国pedv s-indel变异毒株。在美国ped疫情爆发后，加拿大、墨西哥、中国台湾、韩国和日本都报告检测到了类似美国原型的pedv病毒；据报道，在韩国、日本、德国、比利时、法国和葡萄牙都发现了类似美国的s-indel变异型的pedv。目前，pedv仍然是全球养猪业的一大威胁。仍然非常需要抗pedv病毒的减毒活疫苗，特别是口服有效的疫苗。


技术实现要素：

5.一方面，本发明提供了猪流行性腹泻病毒(pedv)的c末端截短的刺突蛋白，其缺乏seq id no:1(yevfekvhvq)或包含seq idno:1的序列，并且包含与seq id no:2或其c末端截短的变体具有至少90％同一性的氨基酸序列，条件是所述pedv的c末端截短的刺突蛋白的长度至少为1200个氨基酸。
6.根据该方面的不同实施方案，pedv的c末端截短的刺突蛋白的长度可为至少1250个氨基酸，或至少1300个氨基酸，或至少1370 个氨基酸。
7.根据该方面的不同实施方案，pedv的c末端截短的刺突蛋白可与seq id no:2具有
至少95％同一性，或与seq id no:2具有至少96％，或至少97％，或至少98％，或至少99％，或100％同一性。在某些实施方案中，seq id no:2和与其具有至少90％(即，至少 95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列之间不同的氨基酸是保守取代。
8.在第二方面，公开了核酸序列，所述核酸序列包含编码根据本发明第一方面的任何实施方案的pedv的c末端截短的刺突蛋白的多核苷酸序列。
9.在第三方面，本公开提供了病毒，其包含根据本发明第一方面的任何实施方案的pedv的c末端截短的刺突蛋白，或者该病毒包含根据本发明第二方面的任何实施方案的核酸序列。
10.第四方面，本发明提供了包含seq id no:5的氨基酸序列。
11.在第五方面，本发明提供了包含根据本发明的第四方面的氨基酸序列的pedv。
12.在第六方面，本发明提供了pedv的c末端截短的刺突蛋白，其中所述c末端截短的刺突蛋白与seq id no:3具有至少90％同一性，条件是所述pedv的c末端截短的刺突蛋白包含seq id no:4。在该第五方面的不同实施方案中，pedv的c末端截短的刺突蛋白可与 seq id no:3具有至少95％同一性，或与seq id no:3具有至少96％或至少97％或至少98％或至少99％或100％同一性。在某些实施方案中，seq id no:2和与其具有至少90％(即，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％)同一性的序列之间不同的氨基酸是保守取代。
13.在第七方面，本发明提供了包含orf-2和orf-3的pedv，条件是该病毒包含所述orf2/orf3中的第一缺失，其中所述第一缺失是seq id no:6的缺失或包含seq id no:6的核酸序列的缺失，条件是所述病毒表达包含seq id no:3的氨基酸序列或与其具有至少 90％同一性的序列，进一步的条件是所述seq id no:3的c末端氨基酸是qplal(seq id no:4)。
14.根据该第七方面的某些实施方案，本发明的pedv还包含所述 orf-3中的第二缺失，其中所述第二缺失是seq id no:7的缺失或包含seq id no:7的核酸序列的缺失。在某些实施方案中，所述第一缺失与所述第二缺失不同。
15.在某些实施方案中，pedv包含编码e、m和n蛋白的野生型 orf。在某些实施方案中，本发明的pedv缺乏由orf-3表达的功能性蛋白。
16.在某些实施方案中，病毒具有根据seq id no:10的基因组或与其具有至少90％同一性的序列。
17.在一些实施方案中，所述病毒源自pedv毒株dj。
18.在第八方面，本发明提供了疫苗，其中所述疫苗包含根据本发明第三、第五和/或第七方面的任何实施方案的病毒。
19.在第八方面的某些实施方案中，病毒是减毒病毒。
20.在第九方面，本发明提供了防止猪动物感染pedv病毒的方法，其包括给所述猪施用根据本发明第八方面的任何实施方案的疫苗。
21.在某些实施方案中，口服施用所述疫苗。
22.在某些实施方案中，所述猪动物是母猪，其中所述疫苗在母猪分娩前约28-42天施用，并且其中进一步所述疫苗在母猪分娩前约17-21 天施用。在某些实施方案中，第一次和/或第二次疫苗接种是口服施用的。
23.在第十方面，本发明提供了保护仔猪免受pedv感染的方法，其包括给所述仔猪施用来自用根据本发明第八方面的任何实施方案的疫苗接种的母猪的初乳，其中所述母猪在分娩前约28-42天(例如35天) 接种，并且其中进一步在分娩前约7-21天(例如14天)施用所述疫苗。在某些实施方案中，所述第一次和/或所述第二次疫苗接种是口服施用的。
24.在某些实施方案中，所述仔猪的年龄为至少3天。在其它实施方案中，仔猪年龄为至少5天。
附图说明
25.图1是连续传代病毒的核酸的电泳图谱。
26.图2是5种连续传代病毒的核酸的电泳图谱。
27.图3是分娩时被接种母猪体内的抗pedv抗体水平的图解说明。
28.图4显示了用经接种母猪的初乳喂养的3至5日龄仔猪的抗 pedv抗体水平的图解。
具体实施方式
29.为了更好地理解本发明，提供了以下定义:
30.用于参考数字的术语“约”是指所述值的参考数字加或减10。
31.术语“佐剂”是指增强疫苗效力的化合物，其可被添加到包含免疫剂的制剂中。即使只施用一剂疫苗，佐剂也能提供增强的免疫反应。佐剂可包括例如胞壁酰二肽、吡啶、氢氧化铝、二甲基双十八溴化铵 (dda)、油、水包油乳液、皂苷、细胞因子和本领域已知的其它物质。合适的佐剂的实例描述于美国专利申请公开号us2004/0213817a1 中。“佐剂”是指掺入或与佐剂结合的组合物。
32.本文所用的“减毒”pedv指能够在易感宿主中感染和/或复制，但对易感宿主无致病性或致病性较低的pedv。例如，与相关的野外分离的毒株相比，所述减毒病毒可能不引起可观察/可检测的临床表现，或较少的临床表现，或不太严重的临床表现，或表现出病毒复制效率和/或传染性的降低。pedv感染的临床表现可以包括但不限于临床腹泻、呕吐、嗜睡、病情恶化(loss of condition)和脱水。
33.术语“保守取代”是指一个氨基酸被另一个具有相似性质的氨基酸取代。本领域技术人员将进一步认识到，核酸序列中导致其编码的蛋白质的氨基酸序列修饰的改变对所述蛋白质的最终三维结构几乎没有 (如果有的话)影响。例如，丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较低的残基(诸如甘氨酸)或疏水性较高的残基(诸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基取代另一个带负电荷的残基(例如天冬氨酸取代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基取代另一个带正电荷的残基(诸如赖氨酸取代精氨酸)的变化也可预期产生具有基本相同功能活性的蛋白质。
34.以下六组各自含有彼此为典型保守取代的氨基酸：[1]丙氨酸(a)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；[2]天冬氨酸(d)，谷氨酸(e)；[3]天冬酰胺(n)，谷氨酰胺(q)；[4]精氨酸(r)、赖氨酸(k)、组氨酸(h)；[5]异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；以及[6]苯丙氨酸(f)、酪氨酸 (y)、色氨酸(w)(参见例如美国专利公开20100291549)。
[0035]“表位”是在一旦被施予宿主，其就能够引起体液(b细胞)和/或细胞类型(t细胞)的免疫反应的意义上具有免疫活性的抗原决定簇。这些是分子上具有抗原性的特殊化学基
团或肽序列。抗体特异性结合多肽上的特定抗原表位。在动物中，大多数抗原会同时呈现几个或甚至许多个抗原决定簇。这种多肽也可以是免疫原性多肽，并且可以如进一步描述的那样鉴定表位。
[0036]
如本文中所用，术语“免疫原性片段”是指多肽或多肽片段，或编码它们的核苷酸序列，其包含等位基因特异性基序、表位或其它序列，使得所述多肽或片段将结合mhc分子，并诱导细胞毒性t淋巴细胞 (“ctl”)反应，和/或b细胞反应(例如，抗体产生)，和/或t辅助淋巴细胞反应，和/或针对所述免疫原性多肽或免疫原性片段所源自的抗原的迟发型超敏反应(dth)反应。dth反应是一种免疫反应，其中依赖于t细胞的巨噬细胞活化和炎症导致组织损伤。对皮下注射抗原的 dth反应通常被用作细胞介导的免疫力的测定。
[0037]
术语“免疫保护性反应的诱导”是指减轻或消除疾病的一个或多个症状(即受感染的受试者相较于健康对照的临床体征、损伤、细菌排泄和细菌在组织中的复制)的(体液和/或细胞)免疫反应。优选地，当与对照相比时，所述症状的减轻在统计学上是显著的。
[0038]“药学上可接受的载体”是指疫苗生产和施用领域中使用的任何常规药学上可接受的载体、媒介物或赋形剂。药学上可接受的载体通常是无毒的、惰性的、固体或液体载体。
[0039]
术语“猪(porcine)”和“猪(swine)”在本文中可互换使用，是指属于猪科的任何动物，例如猪(pig)。
[0040]
如本文中所用，“易感”宿主是指可被pedv感染的细胞或动物。当引入到易感动物时，减毒pedv病毒也可诱导针对pedv或其抗原的免疫反应，从而使动物对pedv感染产生免疫力。
[0041]“治疗有效量”是指可在接受所述抗原或疫苗的受试者中诱导免疫反应的抗原或疫苗的量，其足以预防或减少疾病的体征或症状，包括由病原体诸如病毒或细菌感染引起的不利健康影响或其并发症。可诱导体液免疫或细胞介导的免疫或体液免疫和细胞介导的免疫二者。可以例如通过抗体滴度的测量、淋巴细胞增殖测定间接评估，或通过监测野生型毒株攻击后的体征和症状直接评估动物对疫苗的免疫原性反应。疫苗所赋予的保护性免疫力可通过测量例如临床体征(诸如死亡率、发病率、受试者的体温、总体身体状况以及总体健康和表现)的减少来评估。治疗上有效的疫苗的量可以根据所用的特定佐剂、所用的特定抗原或受试者的状况而变化，并且可由本领域技术人员确定。
[0042]“治疗”是指预防该术语适用的病症、疾患或疾病，或者预防或减轻这种病症、疾患或疾病的一种或多种症状。
[0043]
术语“疫苗”是指用于对疾病产生免疫力，以预防或改善感染的影响的抗原制剂。疫苗通常使用免疫有效量的免疫原与有效增强被接种受试者针对所述免疫原的免疫反应的佐剂一起的组合来制备。
[0044]
pedv是一种包膜病毒，其具有约28kb的正义单链rna基因组，具有5’帽和3’多聚腺苷酸化尾。(pensaert和de bouck p.1978)。该基因组包含5’非翻译区(utr)、3’utr和至少7个开放阅读框(orf)，所述开放阅读框编码4种结构蛋白(刺突蛋白(s)、包膜(e)、膜(m)和核衣壳(n))和3种非结构蛋白(复制酶1a和1b以及orf3)；这些开放阅读框以5
’-
复制酶(1a/1b)-orf2(也称为s)-orf3-e-m-n-3'的顺序排列在基因组上(oldham j.1972；和bridgen等人1993)。表征的前三个新出现的北美pedv基因组序列，minnesota mn(genbank: kf468752.1)、iowa ia1(genbank:kf468753.1)和iowa ia2 (genbank:kf468754.1)，具有
相同大小的28,038个核苷酸(nt)(不包括多聚腺苷尾)，并与原型pedv cv777毒株(genbank:af353511.1) 共有基因组组织。这三个北美pedv序列共有99.8％至99.9％的核苷酸同一性。特别是，毒株mn和ia2在整个基因组中只有11个核苷酸差异。
[0045]
为了应用的目的，序列以dna形式提供。本领域普通技术人员将不难将这些序列翻译成包含病毒基因组的rna序列。
[0046]
本发明人令人惊奇地发现，在orf-2/orf-3的区域中具有第一缺失的pedv导致减毒的且具有免疫原性(即产生针对野生型pedv 的保护性反应)的病毒。在某些实施方案中，第一缺失包括seq id no: 6。该序列起始于orf-2，跨越orf3的近端部分(包括orf-3起始密码子)。第一缺失不只限于seq id no:6，还可包括seq id no:6上游或下游的序列。然而，值得注意的是，由于orf2编码的刺突蛋白是pedv的主要免疫原，因此第一缺失可能不会延伸到seq id no:6 的特别上游而危及刺突蛋白。
[0047]
因此，本发明提供了刺突蛋白的片段。所述刺突蛋白的片段缺少 seq id no:1。可将该片段在c末端进一步截短，但其长度通常应该至少有1200个氨基酸，优选至少有1300个氨基酸，更优选至少有1370 个氨基酸。在某些实施方案中，刺突蛋白的片段包括seq id no:2，或与其具有至少90％(或至少95％、96％、97％、98％)同一性的序列。优选的是，与seq id no:2具有至少90％同一性的序列与seq idno:2本身之间的氨基酸差异是保守取代。
[0048]
本领域普通技术人员可以理解，第一缺失导致orf-2的移码，从而改变野生型刺突蛋白的c末端氨基酸序列。根据本发明的刺突蛋白片段缺少seq id no:1。相反，在最优选的实施方案中，刺突蛋白片段以qplal(seq id no:4)结束。
[0049]
在最优选的一组实施方案中，本文所述的刺突蛋白片段包括seqid no:3或与其具有至少90％同一性的序列，条件是seq id no:4 存在于所述刺突蛋白片段的c末端或与seq id no:3具有至少90％同一性的序列。序列同一性可以更大(例如，至少95％、96％、97％、 98％或99％)，并且不同的氨基酸是保守取代。
[0050]
获得根据本发明的多肽的技术在本领域是公知的。例如，可以使用基因工程技术和重组dna表达系统。
[0051]
另一方面，本发明提供了编码根据上述任一实施方案的刺突蛋白片段的核酸序列。还可将编码根据本发明的第一方面的任何实施方案的氨基酸序列的核酸分子插入载体(例如，重组载体)，诸如一种或多种非病毒和/或病毒载体。非病毒载体可包括例如质粒载体(例如，与细菌、昆虫和/或哺乳动物宿主细胞相容的)。示例性的载体可包括，例如，pcr-ii、pcr3和pcdna3.1(invitrogen,san diego,calif.)、pbsii (stratagene,la jolla,calif.)、pet15(novagen,madison,wis.)、pgex (pharmacia biotech,piscataway,n.j.)、pegfp-n2(clontech,palo alto,calif.)、pet1(bluebacii,invitrogen)、pdsr-alpha(pct公开号 wo 90/14363)和pfastbacdual(gibco-brl,grand island,ny)以及bluescript质粒衍生物(一种高拷贝数的基于cole1的噬菌粒， stratagene cloning systems,la jolla,calif.)、为克隆taq扩增的 pcr产物而设计的pcr克隆性质粒(例如，topo
tm ta试剂盒、质粒衍生物,invitrogen,carlsbad,calif.)。还可使用细菌载体，包括例如志贺氏菌属(shigella)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、乳杆菌属(lactobacillus)、卡介苗(bacille calmette guerin，bcg)和链球菌属(streptococcus)(参见例如wo 88/6626；wo 90/0594；wo 91/13157；wo 92/1796；和wo 92/21376)。可使用本
领域技术人员可广泛获得的标准重组技术来构建载体。许多其它非病毒质粒表达载体和系统在本领域中是已知的，并且可以使用。
[0052]
在第三方面，本发明提供了包含根据本发明第二方面的核酸序列的载体。已成功用于将核酸引入宿主的各种病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、疱疹病毒和痘病毒等等。病毒载体可使用本领域技术人员可广泛获得的标准重组技术来构建。参见，例如， molecular cloning:a laboratory manual(sambrook&russell:2000, cold spring harbor laboratory press；isbn:0879695773)，和： current protocols in molecular biology(ausubel等人，1988 updates, greene publishing assoc.,new york；isbn:0471625949)。
[0053]
在某些实施方案中，所述载体是病毒载体，所述病毒是pedv病毒。
[0054]
因此，本发明提供了包含上述第一缺失和/或刺突蛋白片段的 pedv。可以理解，第一缺失包括orf-3上的起始密码子，从而消除了所述orf。因此，本发明的pedv缺乏由野生型orf-3表达的功能性蛋白。
[0055]
然而，由于所述缺失，产生了新的orf，称为“新orf”或“新创建的orf”等。通过orf finder软件(可从ncbi网站上公开获得)对该新orf(seq id no:9)的概念翻译表明，seq id no:5是该新orf表达的产物。因此，在另一方面，本发明提供了pedv，其表达 seq id no:5的氨基酸序列，并且在某些实施方案中，包含seq idno:9的orf。
[0056]
上述蛋白质和/或核酸序列同一性的方法适用于本文所述的所有蛋白质和/或核酸。用于评估序列同一性和/或相似性的多序列比较算法和程序在本领域中是已知的。对于序列比较，通常一个序列充当参考序列(例如，本文公开的序列)，将测试序列与该参考序列进行比较。然后，序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
[0057]
两个氨基酸或两个核酸序列的同一性百分比可以通过例如使用计算机程序gap，即genetics computer group(gcg；madison,wi) wisconsin包10.0版程序，gap(devereux等人(1984),nucleic acidsres.12:387-95)比较序列信息来确定。在计算同一性百分比时，被比较的序列通常以给出序列间最大匹配的方式进行比对。gap程序的优选默认参数包括：(1)核苷酸的一元比较矩阵的gcg执行(对于同一性包含值1，对于非同一性包含值0)，以及如atlas of polypeptidesequence and structure,schwartz和dayhoff，编辑，nationalbiomedical research foundation，第353-358页(1979)中所述的 gribskov和burgess的加权氨基酸比较矩阵((1986)nucleic acidsres.14:6745)，或其它可比的比较矩阵；(2)对于氨基酸序列，每个缺口的罚分为8，每个缺口中每个符号的另外罚分为2，或者对于核苷酸序列，每个缺口的罚分为50，每个缺口中每个符号的另外罚分为3； (3)对于末端缺口，没有罚分；以及(4)对于长缺口没有最大罚分。
[0058]
序列同一性和/或相似性也可通过使用smith和waterman(1981, adv.appl.math.2:482)的局部序列同一性算法、needleman和wunsch (1970,j.mol.biol.48:443)的序列同一性比对算法、nearson和 lipman(1988,proc.nat.acad.sci.u.s.a.85:2444)的相似性搜索方法、这些算法的计算机化执行(genetics软件包中的bestfit、fasta 和tfasta，genetics computer group,575science drive,madison, wis)来测定。
[0059]
另一个有用算法的实例是pileup。pileup使用渐进式配对比对，从一组相关序列中建立多序列比对。其还可以绘制树，显示用于创建比对的聚类关系。pileup采用了feng&doolittle,1987,j.mol. evol.35:351-360的渐近比对法的简化形式；该方法类似于higgins和 sharp,1989,cabios 5:151-153描述的方法。有用的pileup参数包括默认缺口权重为3.00、默认缺口长度权重为0.10和加权的末端缺口。
[0060]
另一个有用算法的实例是blast算法，描述于：altschul等人， 1990,j.mol.biol.215:403-410；altschul等人，1997,nucleic acids res. 25:3389-3402；和karin等人，1993,proc.natl.acad.sci.u.s.a. 90:5873-5787中。一个特别有用的blast程序是wu-blast-2程序，其获自altschul等人，1996,methods in enzymology 266:460-480。 wu-blast-2使用几个搜索参数，其中大部分被设置为默认值。可调参数设置如下值：重叠跨度(overlap span)＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(word threshold)(t)＝ii。hsp s和hsp s2参数是动态值，由程序本身根据特定序列的组成和正在针对其搜索目标序列的特定数据库的组成来建立；然而，可以调整这些值以增加灵敏度。
[0061]
另一个有用的算法是由altschul等人，1993,nucl.acids res. 25:3389-3402报道的缺口blast。缺口blast(gapped blast)使用 blosum-62替代分数(substitution scores)；阈值t参数设置为9；触发无缺口延伸的两次命中法(two-hit method)，对缺口长度k罚分 10 k；将xu设置为16，以及将xg设置为40(对于数据库搜索阶段) 和67(对于算法的输出阶段)。带缺口的比对(gapped alignment)由对应于约22bits的分数触发。
[0062]
在某些实施方案中，根据本发明的病毒还在作为野生型orf 3的一部分的序列中包含第二缺失。优选地，该第二缺失包括seq id no: 7(或由其组成)。
[0063]
在某些优选实施方案中，提供了pedv，其中所述病毒包含由seqid no:6组成的第一缺失和由seq id no:7组成的第二缺失。在一组更优选的实施方案中，所述病毒的基因组序列包含seq id no:10 或与其具有90％(例如，95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)同一性的序列。优选地，其中不同的核苷酸不会导致表达的氨基酸序列发生显著(或任何)变化，而是密码子优化的结果。与可能属于基因型1或基因型2的野生型病毒相比，本发明的pedv的e、m和n 蛋白的氨基酸序列优选没有改变。pedv基因型1的一个非限制性实例是cv777(genbank登录号af353511)，基因型2的非限制性实例有dj毒株以及aj1102毒株(genbank登录号jx188454)。基因型2 毒株的其它非限制性实例包括毒株ch/zjcs03/2012、 ch/jxzs03/2014、ch/jxfx01/2014、ch/jxjj08/2015、 ch/jxgz04/2015、ch/jxja89/2015、ch/jxdx119/2016、 ch/jxjgs11/2016、ch/jxwn13/2016、ch/jxjj18/2017、 ch/jxnc38/2017、ch/jx/01、ch/jx-1/2013、ch/jx-2/2013、 ah2012、gd-b、bj-2011-1、ch/fjnd-3/2011、aj1102、gd-a、 ch/gdgz/2012、ch/zjcx-1/2012、ch/fjzz-9/2012。基因型2是在中国及周边国家从2010到2020年的野外优势基因型。根据本发明的病毒可通过培养传代或通过基因工程技术引入上述突变而衍生自这些和其它亲本毒株。
[0064]
本发明优选包括疫苗组合物，其包含本发明的活的减毒pedv变体和药学上可接受的载体。如本文中所用，表述“本发明的活的减毒的 pedv”包括任何活的、减毒的pedv毒株，其包括本文所述的一种或多种变化。药学上可接受的载体可以是例如水、稳定剂、防腐剂、培养基或缓冲剂。包含本发明的减毒pedv的疫苗制剂可以制备成悬浮液形式或冻干形式，或者冷冻形式。如果冷冻，可加入甘油或其它类似试剂，以在冷冻时增强稳定性。一般而言，
减毒活疫苗的有利方面包括以其天然形式向宿主免疫系统呈递感染性因子的所有相关免疫原性决定簇，并且由于该因子在被接种宿主中增殖的能力，需要相对少量的免疫因子。
[0065]
可以通过已知的方法完成病毒减毒以用于活疫苗，使得其致病性不足以对被接种的目标动物造成实质性伤害，所述方法优选包括连续传代。下列参考文献提供了冠状病毒减毒的各种通用方法，并适用于在本发明实践中有用的任何毒株的减毒或进一步减毒：b.neuman等人，journal of virology，第79卷，15期，第9665-9676页，2005；j. netland等人，virology,第399卷(1)，第120-128页，2010；y-p huang 等人，"sequence changes of infectious bronchitis virus isolates in the 3'7.3kb of the genome after attenuating passage in embryonated eggs, avian pathology，第36卷(1),(摘要),2007；和s.hingley等人， virology,第200卷(1)1994，第1-10页；参见美国专利第3,914,408 号；和ortego等人，virology，第308卷(1)，第13-22页，2003。
[0066]
本发明中理想的其它基因工程疫苗是通过本领域已知的技术生产的。此类技术包括但不限于重组dna的进一步操作、对重组蛋白氨基酸序列的修饰或取代等。
[0067]
通常，基于重组dna技术的基因工程疫苗是例如通过鉴定编码负责在猪中诱导更强免疫或保护性反应的蛋白质的病毒基因的替代部分(例如，源自m、gp2、gp3、gp4或gp5等的蛋白质)而制成的。可对病毒蛋白基因的各种亚型或分离物进行dna改组方法。所得的异质嵌合病毒蛋白可用于广泛的保护性亚单位疫苗。或者，可将此类嵌合病毒基因或免疫显性片段克隆到标准蛋白质表达载体诸如杆状病毒载体中，并用于感染合适的宿主细胞(例如，参见o’reilly等人， "baculovirus expression vectors:a lab manual,"freeman&co., 1992)。培养宿主细胞，从而表达所需的疫苗蛋白，可将其纯化至所需的程度，并配制成合适的疫苗产品。
[0068]
如果克隆保留了引起疾病的任何不期望的天然能力，也可以精确定位病毒基因组中负责任何残余毒力的核苷酸序列，并通过例如定点诱变对病毒进行基因工程改造而使其无毒。定点诱变能够添加、删除或改变一个或多个核苷酸(例如，参见zoller等人，dna 3:479-488, 1984)。合成含有所需突变的寡核苷酸，并使其退火至单链病毒dna 的一部分。将由该过程产生的杂交分子用于转化细菌。然后用分离出的含有所述适当突变的双链dna，通过连接到全长dna的限制性片段来产生后者，随后将其转染到合适的细胞培养物中。可通过本领域普通技术人员已知的任何标准技术将基因组连接到合适的载体中进行转移。可使用任何常规方法将载体转染到宿主细胞中以产生病毒子代，所述常规方法是诸如磷酸钙或deae-葡聚糖介导的转染、电穿孔、原生质体融合和其它公知的技术(例如，sambrook等人，"molecularcloning:a laboratory manual,"cold spring harbor laboratorypress,1989)。然后克隆的病毒表现出所需的突变。或者，可合成含有所述适当突变的两种寡核苷酸。可使这些寡核苷酸退火以形成双链 dna，所述双链dna可插入病毒dna中以产生全长dna。
[0069]
向需要保护免受病毒感染的猪施用免疫有效量的本发明疫苗。接种猪的免疫有效量或免疫原性量可以通过常规测试容易地确定或容易地滴定。有效量是其中获得对疫苗的足够免疫反应以保护暴露于 pedv的猪的量。优选地，猪被保护到其中所述病毒性疾病的一种至所有不利的生理症状或影响被显著减少、改善或完全防止的程度。
[0070]
本发明的疫苗可以按照公认的惯例进行配制，以包括动物可接受的载体，例如标
准缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，并且也可被配制成促进持续释放。稀释剂包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。等渗性添加剂包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。其它合适的疫苗媒介物和添加剂，包括那些在配制经修饰的活疫苗中特别有用的媒介物和添加剂，是本领域技术人员已知的或显而易见的。例如，参见，remington's pharmaceuticalscience，第18版，1990,mack publishing，其通过引用并入本文。
[0071]
根据本发明的疫苗可以以多种方式施用，包括但不限于口服、皮下、肌内、皮内、静脉内等方式。
[0072]
为粘膜施用(口服、鼻内、直肠)而配制的本发明疫苗可用粘膜粘附剂诸如壳聚糖配制。
[0073]
配制成通过注射或输注施用的本发明的疫苗还可包含一种或多种额外的免疫调节组分，例如佐剂或细胞因子等。可用于本发明的疫苗的佐剂的非限制性实例包括ribi佐剂系统(ribi inc.,hamilton, mont.)、明矾、矿物凝胶诸如氢氧化铝凝胶、水包油乳液、油包水乳液诸如弗氏完全和不完全佐剂，嵌段共聚物(cytrx,atlanta ga.)、 qs-21(cambridge biotech inc.,cambridge mass.)、saf-m(chiron, emeryville calif.)、佐剂、皂苷、quil a或其它皂苷级分、单磷酰脂质a、离子多糖和avridine脂胺佐剂。可用于本发明的疫苗的水包油乳液的非限制性实例包括改性62和1/2 制剂。改性62是一种其中含有5％(v/v)角鲨烯(sigma)、1％ (v/v)85去垢剂(ici表面活性剂)、0.7％(v/v)80去垢剂(ici表面活性剂)、2.5％(v/v)乙醇、200μg/ml quil a、100μg/ml 胆固醇和0.5％(v/v)卵磷脂的水包油乳液。改性seam 1/2是一种其中含有5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)85去垢剂、0.7％(v/v) 80去垢剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml quil a和50μg/ml 胆固醇的水包油乳液。可包含在疫苗中的其它免疫调节剂包括例如一种或多种白细胞介素、干扰素或其它已知的细胞因子。
[0074]
其它佐剂系统允许t辅助细胞和b细胞表位的组合，产生一种或多种类型的共价t-b表位连接结构(其可被额外脂质化)，诸如 wo2006/084319、wo2004/014957和wo2004/014956中描述的那些。
[0075]
在本发明的某些实施方案中，orfi
·
pedv蛋白或其它pedv蛋白或其片段用下文论述的5％配制。
[0076]
优选佐剂可以在缓冲溶液中以2ml剂量提供，所述缓冲溶液还包含约5％(v/v)(氢氧化铝凝胶)和约25％的最终 (v/v)的"20％(v/v)的"20％一般性描述于美国专利第5,084,269号中，并提供了溶解在轻质油中的脱油卵磷脂(优选大豆)，然后将其分散到抗原的水溶液或悬浮液中，形成水包油乳液。已经根据美国专利第6,814,971号的方案(参见其第8-9栏)对anpheng进行了改进，以提供用于本发明的最终佐剂化疫苗组合物中的所谓“20％ amphigen”组分。
pharmacy,2005,lippincott williams)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所述剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且可以包含缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如汞((o-羧基苯基)硫代)乙基钠盐十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；羟苯甲酸烷基酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3
-ꢀ
戊醇；和间甲酚)；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(peg)、或
[0082]
本发明的疫苗，无论是配制用于注射施用还是用于施加到粘膜表面(口服、鼻内、直肠等)，都可以任选配制用于持续释放本发明的病毒、传染性dna分子、质粒或病毒载体。此类持续释放制剂的实例包括病毒、传染性dna分子、质粒或病毒载体与生物相容性聚合物的复合物例如聚乳酸、聚乳酸-共-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolicacid))、甲基纤维素、透明质酸、胶原等的组合。可降解聚合物在药物递送载体中的结构、选择和使用已经在几个出版物，包括a.domb等人，1992,polymers for advanced technologies 3:279-292(其通过引用并入本文)中进行了综述。在药物制剂中选择和使用聚合物的另外指导可见于本领域已知的教科书，例如m.chasin和r.langer(编辑), 1990,"biodegradable polymers as drug delivery systems"in:drugsand the pharmaceutical sciences，第45卷，m.dekker,ny(其也通过引用并入本文)中。可选地或另外地，可将病毒、质粒或病毒载体微囊化以改善施用和功效。微囊化抗原的方法在本领域是公知的，包括例如美国专利第3,137,631号、美国专利第3,959,457号、美国专利第 4,205,060号、美国专利第4,606,940号、美国专利第4,744,933号、美国专利第5,132,117号以及国际专利公开wo 95/28227(其全部通过引用并入本文)中描述的技术。
[0083]
脂质体也可用于提供病毒、质粒、病毒蛋白或病毒载体的持续释放。关于如何制备和使用脂质体制剂的细节还可见于美国专利第 4,016,100号、美国专利第4,452,747号、美国专利第4,921,706号、美国专利第4,927,637号、美国专利第4,944,948号、美国专利第5,008,050 号和美国专利第5,009,956号等处，其全部通过引用并入本文中。
[0084]
任何上述疫苗的有效量可通过常规方法确定，从低剂量的病毒、病毒蛋白质粒或病毒载体开始，然后在监测效果的同时增加剂量。单次注射疫苗或多次注射疫苗后可获得有效量。在确定每只动物的最佳剂量时，可以考虑已知因素。这些因素包括动物的种类、尺寸、年龄和一般状况，动物体内其它药物的存在等。实际剂量优选在考虑其它动物研究的结果后选择。
[0085]
一种检测是否已获得足够免疫反应的方法是确定接种疫苗后动物中的血清转化和抗体滴度。接种疫苗的时间安排和加强剂的数量，如果有的话，最好由医生或兽医根据对所有相关因素的分析来决定，其中一些因素已在上面描述过。
[0086]
本发明的病毒、蛋白质、传染性核苷酸分子、质粒或病毒载体的有效剂量可在考虑
到可由本领域普通技术人员确定的因素，诸如待接种动物的重量的情况下，使用已知技术确定。本发明疫苗中的本发明病毒的剂量优选为约101至约109pfu(噬斑形成单位),更优选约102至约108pfu，最优选约103至约107pfu。本发明的疫苗中本发明质粒的剂量优选为约0.1μg至约100mg，更优选为约1μg至约10mg，甚至更优选为约10μg至约1mg。本发明的疫苗中本发明的感染性 dna分子的剂量优选为约0.1μg至约100mg，更优选为约1μg至约 10mg，甚至更优选为约10μg至约1mg。本发明的疫苗中本发明的病毒载体的剂量优选为约101pfu至约109pfu，更优选约102pfu至约 108pfu，甚至更优选约103至约107pfu。合适的剂量范围为约0.5ml 至约10ml，更优选约1ml至约5ml。
[0087]
根据本发明的实践，病毒蛋白或肽疫苗的合适剂量(例如，如上所述的刺突蛋白片段的剂量)通常为每剂量1至50微克，或更高的量，这可通过标准方法确定，其中佐剂的量通过关于每种这样的物质的公认方法来确定。在本发明关于猪的疫苗接种的一个优选实例中，动物的最佳年龄目标在约1至21天之间，该时期处于断奶前，也可对应于其它已安排的疫苗接种，诸如针对猪肺炎支原体的疫苗接种。另外，种母猪的一种优选疫苗接种计划将包括类似的剂量，以及每年的再接种计划。
[0088]
给药
[0089]
一种优选的临床适应症是在种母猪和仔母猪分娩前进行治疗、控制和预防，然后对仔猪进行疫苗接种。在一个代表性实例(适用于母猪和仔母猪)中，将使用两个2-ml剂量的疫苗，当然，剂量的实际体积是如何配制疫苗的函数，其中在还考虑到动物的尺寸的情况下，实际剂量范围为0.1至5ml。单剂量接种也是合适的。
[0090]
第一剂量可早在交配前至分娩前5周施用，第二剂量优选在分娩前约1-3周施用。疫苗剂量优选提供对应于在约106与108之间，更优选在约107与10
7.5
之间的tcid
50
(组织培养感染剂量)的病毒物质的量，并且可进一步变化，这在本领域中是已知的。可在任何后续分娩前2-4周给予加强剂量。肌内接种疫苗(所有剂量)是优选的，也可以皮下注射一个或多个剂量。口服施用也是优选的。接种疫苗在首次接触实验的动物中也可以是有效的，而非首次接触实验的动物通过计划或天然的感染实现。
[0091]
在另一个优选实例中，母猪或仔母猪在分娩前约8周和分娩前2 周进行肌内或口服接种。在这些条件下，可以在pedv阴性的接种母猪中证明保护性免疫反应，因为它们产生了具有中和活性的抗体(通过血清样品的荧光焦点中和滴度测量的)，并且这些抗体被动地转移到它们的仔猪身上。本发明的方案也适用于已经血清阳性的母猪和仔母猪，以及仔猪和公猪的治疗。还可进行加强疫苗接种，这些接种可以通过相同或不同的施用途径进行。尽管优选在任何后续分娩之前对母亲母猪重新接种疫苗，但本发明的疫苗组合物仍然可以通过抗体的持续被动转移为仔猪提供保护，即使母猪仅在与先前分娩相关的情况下接种疫苗。
[0092]
应该注意的是，仔猪可能早在出生后第一天就接种疫苗。例如，仔猪可以在第1天接种疫苗，在3周龄时可以使用或不使用加强剂量，特别是如果母亲母猪虽然在交配前接种过疫苗，但在分娩前没有接种。如果母亲母猪由于自然或计划的感染而先前不是首次接触实验的，那么仔猪疫苗接种也可能有效。当母亲既没有先前暴露于病毒，也没有在分娩前接种过疫苗时，给仔猪接种疫苗也可能有效。公猪(通常保留用于交配目的)应每6个月接种一次疫苗。剂量的变化完全在本领域的实践范围内。应该注意的是，本发明的疫苗用于怀孕动
物(所有三期) 和新生猪是安全的。使本发明的疫苗减毒至安全水平(即没有死亡，只有短暂的轻微临床体征或新生猪的正常体征)，该水平即使是最敏感的动物(再次包括新生猪)也是可以接受的。当然，从保护猪群免受pedv 流行病和持续低水平pedv发生的角度来看，持续的母猪接种计划是非常重要的。可以理解，用pedv
·
mlv免疫的母猪或仔母猪将被动地将免疫力转移给仔猪，包括pedv特异性iga，这将保护仔猪免于 pedv相关疾病和死亡。另外，一般来说，用pedv
·
mlv免疫的猪将在其粪便中排出pedv的数量和/或持续时间方面有降低，或者被保护而免于在它们的粪便中排出pedv，此外，用pedv
·
mlv免疫的猪将被保护而免于由于pedv而导致的体重减轻和体重增加失败，此外，pedv
·
mlv将有助于停止或控制pedv传播周期。
[0093]
还应当注意，用本发明的疫苗接种的动物对于人食用也是立即安全的，没有任何显著的屠宰残留(slaughter withhold)，诸如21天或更少。
[0094]
当治疗性提供时，在检测到实际感染的体征时，以有效量提供疫苗。用于治疗现有感染的合适剂量包括每剂量约106至约109tcid
50
或更高的病毒(疫苗释放的最小免疫剂量)。如果组合物的施用能够被接受者耐受，则称其为“药理学上可接受的”。如果施用的量具有生理学意义，则这种组合物被称为以“治疗或预防有效量”施用。
[0095]
本发明的至少一种疫苗或免疫原性组合物可以使用本文所述的药物组合物，通过实现预期目的的任何方式施用。例如，这种组合物的施用途径可以是胃肠外、口服、口鼻、鼻内、气管内、局部、皮下、肌内、经皮、皮内、腹膜内、眼内和静脉内施用。在本发明的一个实施方案中，组合物通过肌内施用。胃肠外施用可通过推注或随时间逐渐灌注的方式进行。可使用任何合适的装置来施用组合物，包括注射器、滴管(droppers)、无针注射装置、贴片等。选用的途径和装置将取决于佐剂、抗原和受试者的组成，这些是技术人员熟知的。口服或皮下施用是优选的。口服施用可以是直接的，通过水，或通过饲料(固体或液体饲料)。当以液体形式提供时，可将疫苗冻干并复溶，或者以糊剂提供，用于直接添加到饲料中(混合在其中或顶部敷料)，或者以其它方式添加到水或液体饲料中。
[0096]
在又一方面，本发明的蛋白质、核酸序列和病毒将允许本领域普通技术人员区分先前感染的动物和用上述疫苗接种的动物。例如，可以制备结合根据本发明的截短的s蛋白片段(例如，通过靶向seq idno:4)但不结合野生型s蛋白的抗体。还可以针对由新开放阅读框表达的氨基酸序列(seq id no:5)制备抗体。制备抗体的方法在本领域是公知的，本领域普通技术人员不必进行过度的实验来制备适用于本发明的多克隆或单克隆抗体。也可以制备根据本发明的分离的蛋白质。例如，seq id no:5与来自受试动物血样的抗体的反应表明该动物接种了疫苗。
[0097]
在其它实施方案中，可使用靶向第一或第二缺失的引物来检测受试动物的样品中根据本发明的病毒的存在。例如，如果引物被设计成扩增第一缺失内的区域，则pcr反应产物的不存在可以表明样品中存在根据本发明的病毒。
[0098]
本公开还提供了以下项:
[0099]
项1.一种猪流行性腹泻(ped)病毒的c末端截短的刺突蛋白，其缺乏seq id no:1(yevfekvhvq)或包含seq id no:1的序列，并且包含与seq id no:2或其c末端截短的变体具有至少90％同一性的氨基酸序列，条件是所述pedv的c末端截短的刺突蛋白的长度至少为1200个氨基酸。
[0100]
项2.根据项1的pedv的c末端截短的刺突蛋白，条件是所述 pedv的c末端截短的刺突蛋白的长度至少为1250个氨基酸。
[0101]
项3.根据项1的pedv的c末端截短的刺突蛋白，条件是所述pedv的c末端截短的刺突蛋白的长度至少为1300个氨基酸。
[0102]
项4.根据项1的pedv的c末端截短的刺突蛋白，条件是所述 pedv的c末端截短的刺突蛋白的长度至少为1370个氨基酸。
[0103]
项5.根据项1至项4中任一项所述的c末端截短的刺突蛋白，其包含与seq id no:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。
[0104]
项6.根据项1至项4中任一项所述的c末端截短的刺突蛋白，其包含与seq id no:2具有至少99％同一性的氨基酸序列。
[0105]
项7.根据项4至项6中任一项所述的c末端截短的刺突蛋白，其为seq id no:2的保守取代变体。
[0106]
项8.一种核酸，其编码根据项1至项7中任一项的c末端截短的刺突蛋白。
[0107]
项9.一种病毒，其包含权利要求1至7中任一项的c末端截短的刺突蛋白或项8的核酸序列。
[0108]
项10.一种包含seq id no:3的氨基酸序列或与其具有至少 90％同一性的序列，条件是所述seq id no:3的c末端氨基酸是qplal(seq id no:4)。
[0109]
项11.项10的氨基酸序列，其中所述序列与seq id no:3具有至少95％同一性。
[0110]
项12.项10的氨基酸序列，其中所述序列与seq id no:3具有至少99％同一性。
[0111]
项13.项10至12中任一项所述的氨基酸序列，其为seq id no: 3的保守取代变体。
[0112]
项14.一种编码根据项10至项13中任一项的氨基酸序列的核酸序列。
[0113]
项15.一种病毒，其基因组包含编码根据项10至项13中任一项的氨基酸序列的orf。
[0114]
项16.一种包含seq id no:5的氨基酸序列。
[0115]
项17.一种病毒，其基因组包含编码根据项16的氨基酸序列的开放阅读框。
[0116]
项18.根据项9、项15、项17中任一项所述的病毒，其为pedv。
[0117]
项19.一种包含orf-2和orf-3的pedv，条件是所述病毒在所述orf2/orf3中包含第一缺失，其中所述第一缺失是seq id no: 6的缺失或包含seq id no:6的核酸序列的缺失，条件是所述病毒表达包含seq id no:3或与其具有至少90％同一性的序列的氨基酸序列，进一步条件是所述seq id no:3的c-末端氨基酸是qplal (seq id no:4)。
[0118]
项20.项20的pedv，其还在所述orf-3中包含第二缺失，其中所述第二缺失是seq id no:7的缺失或包含seq id no:7的核酸序列的缺失。
[0119]
项21.项19或项20的pedv，其中所述病毒包含编码e、m和 n蛋白的野生型开放阅读框。
[0120]
项22.根据项19至项21中任一项所述的pedv，其中所述第一缺失和所述第二缺失不同。
[0121]
项23.根据项18至项22中任一项所述的pedv，其缺乏由orf-3 表达的功能性蛋白。
[0122]
项24.根据项18至项23中任一项所述的pedv，其具有根据seqid no:10或与其具有至少90％同一性的序列的基因组。
[0123]
项25.根据项18至项24中任一项所述的pedv，其源自pedv 毒株，所述毒株选自由以下组成的组：毒株dj、aj1102、 ch/zjcs03/2012、ch/jxzs03/2014、ch/jxfx01/2014、 ch/jxjj08/2015、ch/jxgz04/2015、ch/jxja89/2015、 ch/jxdx119/2016、ch/jxjgs11/2016、ch/jxwn13/2016、 ch/jxjj18/2017、ch/jxnc38/2017、ch/jx/01、ch/jx-1/2013、 ch/jx-2/2013、ah2012、gd-b、bj-2011-1、ch/fjnd-3/2011、aj1102、 gd-a、ch/gdgz/2012、ch/zjcx-1/2012、ch/fjzz-9/2012。
[0124]
项26.根据项18至项24所述的pedv，其源自pedv毒株dj。
[0125]
项27.一种疫苗，其包含根据项18至项26中任一项所述的 pedv。
[0126]
项28.根据项27所述的疫苗，其中所述pedv是减毒的。
[0127]
项29.一种防止猪动物感染pedv的方法，所述方法包括给所述猪施用根据项27所述的疫苗。
[0128]
项30.根据项29所述的方法，其中所述疫苗通过口服施用。
[0129]
项31.项29或项30所述的方法，其中所述猪动物是母猪，其中所述疫苗在分娩前约28-42天第一次施用，并且其中所述疫苗在分娩前约7-21天第二次施用。
[0130]
项32。一种保护仔猪免于pedv感染的方法，包括向所述仔猪施用来自用根据项27的疫苗接种的母猪的初乳。
[0131]
项33.根据项32所述的方法，其中所述第一次疫苗接种和/或所述第二次疫苗接种是口服的。
[0132]
项34.根据项31或项32所述的方法，其中所述仔猪至少3天大。
[0133]
项35.根据项34所述的方法，其中所述仔猪至少5天大。
[0134]
项36.根据项32至35中任一项所述的方法，其中所述母猪在分娩后约35天接种疫苗。
[0135]
项37.根据项32至项36中任一项所述的方法，其中所述母猪在分娩后约14天接种疫苗。
[0136]
以下实施例是作为说明性实施方案给出的，但不应被视为限制本发明的范围。对于本领域技术人员来说，本发明的许多改变、变化、修改和其它用途和应用将是显而易见的。
[0137]
实施例
[0138]
实施例1-pedv疫苗的安全性
[0139]
来自中国南方的一种强毒性大流行pedv毒株，属于g2a组的 pedv-dj，在vero细胞中连续繁殖达57代。对不同代数的病毒 orf2-orf3区进行测序，以监测毒力相关突变和遗传稳定性。测序中使用的引物为：
[0140]
orf3 24655-f:5
’-
tca tta cta gtg ttc tgc tgc att tc-3’(seq id no:11)；
[0141]
orf3 25541-r:5
’-
cac aga tta acc aat tgg acg aag gt-3’(seq id no:12)；
[0142]
连续传代的病毒的电泳图谱如图1所示。不同代数的细胞适应性 pedv毒株的orf2-orf3区域。在p49(箭头)鉴定出在orf2-orf3 区域中具有大片段缺失的突变体。
[0143]
为了验证疫苗株的安全性，用pedv疫苗株(107tcid
50
/猪)口服接种5-7日龄的哺乳仔猪。评估临床体症(总体行为、食欲)，特别是消化系统的临床表现。对粪便形态学评分，统计接种后死亡/存活仔猪数。
[0144]
两组仔猪都存活下来。用根据本发明的pedv疫苗接种的仔猪和未接种的仔猪的小肠没有显著的可见差异。相比之下，接种pedv强毒株的仔猪的小肠因黄色液体积聚而扩张，并且由于绒毛萎缩而具有薄的透明壁。
[0145]
根据以下标准评估粪便稠度分数：1-正常粪便(固体)；2-糊状；半固态；3-淡黄色水样。在未接种的仔猪与接种了本发明pedv株的仔猪的粪便稠度分数之间没有发现差异。
[0146]
实施例2-不恢复毒性
[0147]
给5-7日龄哺乳仔猪口服接种107tcid
50
的pedv疫苗株。评估临床症状(总体精神状态、食欲)，特别是消化系统的临床表现。对粪便形态学评分，统计死亡/存活动物数，以综合评价病毒株安全性。在接种后3天对受感染的仔猪实施安乐死。收集小肠和小肠内容物并用作抗原以接种下一轮仔猪。这种接种模式重复5次，以完成毒性恢复研究。将每轮接种的临床样品用于分离疫苗株，并对每轮接种的疫苗株的遗传标记区域进行测序。将两个标准，即仔猪的遗传稳定性和发病率，用来评估疫苗株的毒力。
[0148]
图2是5种连续传代病毒的核酸的电泳图谱，证明该病毒是遗传稳定的。实验结束时，所有仔猪都存活。
[0149]
这些动物研究表明，根据临床症状和每次传代的仔猪存活率，疫苗株的毒力已经显著降低，同时，在仔猪中5次传代后，orf2-orf3 区的遗传标记保持稳定。总之，pedv疫苗株在表型和基因型上都是稳定的。
[0150]
实施例3-免疫原性
[0151]
分别在分娩前60天和14天对6头首次接触实验的母猪进行口服免疫和增强。每剂疫苗含有1x10
5 tcid
50
/ml的根据实施例1的病毒。来自母猪的仔猪在5-7日龄时用102tcid
50
/ml的pedv tm毒株进行口服攻击，并且在攻击后观察临床症状和死亡/存活，持续10天。
[0152]
另外，收集母猪(第一次免疫接种日和分娩时)和哺乳仔猪(5-7日龄和攻击后10天时)的血清样品，并通过elisa(idexx pedv-igaelisa试剂盒)和sn测定(自行建立的测定，已验证)评估血清样品。
[0153]
来自被免疫母猪的仔猪的存活率为100％，而来自阴性对照的仔猪在攻击后无一存活。攻击后被免疫的母猪和仔猪干净、精力充沛，并主动哺乳，没有腹泻的临床体征。
[0154]
图3显示了在预免疫日和分娩日(第二次免疫后14天)母猪的 pedv抗体水平。由于免疫失败，sowc被排除在进一步分析之外， sowd是仅用pbs而不是pedv抗原口服免疫的对照母猪。在剩下的六头母猪中，抗体水平达到了保护性滴度。
[0155]
图4显示了3-5日龄哺乳仔猪的抗体水平。这些是随如上所述先前接种疫苗的母亲的初乳转移到仔猪体内的母体抗体。
[0156]
综上所述，这些数据表明，对分娩前母猪口服本发明的病毒足以将保护性免疫力转移至哺乳仔猪，以保护所述仔猪免受pedv毒株的攻击。
[0157]
说明书中引用的所有出版物，包括专利出版物和非专利出版物，都表明了本发明所属领域技术人员的技术水平。所有这些出版物通过引用完全并入本文，其程度如同每篇单独的出版物被具体和单独地指示作为参考并入一样。
[0158]
虽然已经参照特定实施方案描述了本发明，但是应当理解，这些实施方案仅仅是本发明的原理和应用的说明。因此，应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精
神和范围的情况下，可对说明性实方案进行许多修改，并且可以设计出其它安排。