一种TA-siRNA纳米凝胶及其制备方法和应用

一种ta-sirna纳米凝胶及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种ta-sirna纳米凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.基因治疗通过以特定序列靶向致病基因，对各种危及生命的疾病进行更精确和个性化的治疗，可以下调、增强或纠正基因表达，是一种很有前景的治疗平台。其治病的原理是通过干扰rna与蛋白结合形成干扰复合体(risc),复合体risc靶向目标基因(如信使rna)，使其降解，敲除该基因的下游蛋白表达，实现疾病治疗。小干扰(sirna)是由双链rna被核酸内切酶切割后形成的，进入细胞后在解旋酶的作用下形成正义链和反义链，反义链与多蛋白组分形成risc，risc具有核酸酶的活性，能将靶基因mrna降解，抑制其表达。
3.利用sirna的早期临床前治疗多数因疗效不佳或大量脱靶效应而被终止。干扰基因治疗的主要问题之一是无法实现高效、安全地将sirna递送至所需组织和细胞，致使活性、稳定性、特异性和降低潜在脱靶方面的性能效果一直不高。
4.当前，通常通过递送载体来解决上述易脱靶问题，目前大量用到的载体包括基于脂质体的纳米粒子、阳离子树枝状聚合物、环糊精聚合物、聚乙烯亚胺、介孔二氧化硅纳米粒子、基于蛋白质或肽的纳米粒子、核酸基于适配体的纳米颗粒和基于噬菌体包装rna的纳米颗粒。sirna载体在到达目标组织和细胞的途中会遇到比如清除网状内皮系统、蛋白质污染和特定组织结构限制等障碍。
5.提供一种可针对性解决上述障碍的运载工具，是当前基因药物的研究重点。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种ta-sirna纳米凝胶及其制备方法和应用，该方法利用单宁酸和sirna的氢键作用得到纳米凝胶，利用单宁酸中的的酚羟基与细胞膜表面蛋白结合，实现粘附细胞，促进细胞内化，具有凝胶结构稳定，生物安全性高的特点。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种ta-sirna纳米凝胶的制备方法，其特征在于，包括：将ta溶液滴加到sirna溶液中，0℃～40℃温度条件下搅拌5min～120min，得到ta-sirna纳米凝胶；所述ta溶液为单宁酸和pbs缓冲液的混合溶液。
8.上述的一种ta-sirna纳米凝胶的制备方法，其特征在于，所述sirna溶液为sirna和pbs缓冲液的混合溶液，所述sirna溶液中sirna的浓度为0.1od/ml～4od/ml；所述ta溶液中单宁酸的质量百分含量为0.1％～4％。
9.上述的一种ta-sirna纳米凝胶的制备方法，其特征在于，具体包括：
10.步骤一、将sirna溶解于pbs缓冲液中，得到sirna溶液；
11.步骤二、将单宁酸溶解于pbs缓冲液中，得到ta溶液；
12.步骤三、0℃～40℃搅拌条件下，将步骤二所述ta溶液滴加至步骤一所述sirna溶
液中，继续搅拌5min～120min；
13.步骤四、将步骤三继续搅拌后体系纯化；
14.步骤五、向步骤四纯化后体系中加入pbs缓冲溶液，得到ta-sirna纳米凝胶。
15.上述的一种ta-sirna纳米凝胶的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述pbs缓冲液为无rna酶的pbs缓冲液。
16.上述的一种ta-sirna纳米凝胶的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述搅拌的速率均为50rpm～500rpm，所述ta溶液的体积为sirna溶液体积的1/3倍～3倍。
17.上述的一种ta-sirna纳米凝胶的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述sirna溶液中sirna的浓度为0.2od/ml；步骤二中，所述ta溶液中单宁酸的质量百分含量为0.2％；步骤三中，搅拌温度为0℃，继续搅拌的时间为20min，所述ta溶液的体积与sirna溶液体积相等。
18.上述的一种ta-sirna纳米凝胶的制备方法，其特征在于，步骤四中，所述纯化为通过100kda分子量截流离心过滤装置进行纯化。
19.此外，本发明还提供一种采用上述ta-sirna纳米凝胶的制备方法制备得到的ta-sirna纳米凝胶。
20.进一步的，本发明还提供一种应用上述ta-sirna纳米凝胶制备促进细胞内化用凝胶的方法。
21.本发明与现有技术相比具有以下优点：
22.1、本发明提供一种ta-sirna纳米凝胶的制备方法，该方法通过利用单宁酸和sirna的氢键作用得到纳米凝胶，利用单宁酸中的的酚羟基与细胞膜表面蛋白结合，从而粘附细胞，促进细胞内吞，实现细胞内化。
23.2、本发明的ta-sirna纳米凝胶的制备方法中，原料包括单宁酸和sirna，单宁酸结构中存在酯键、儿茶酚/邻苯三酚基团，可通过氢键与sirna的磷酸盐骨架相互作用，实现自组装形成纳米凝胶，相较于宏观水凝胶，本发明的纳米级别的凝胶产物结构稳定，更有利于实现递送和细胞内化。
24.3、本发明的ta-sirna纳米凝胶的制备方法中，原料单宁酸作为天然植物多酚，具有安全无毒、可降解的特点，以此为原料制备得到的纳米凝胶具有很好的生物安全性。
25.4、优选的，本发明包括以浓度为0.2od/ml的sirna溶液和质量百分含量为0.2％的ta溶液为原料且ta溶液的体积与sirna溶液体积相等，在0℃继续搅拌20min来制备得到ta-sirna纳米凝胶，具有尺寸分布更均匀的特点。
26.5、采用本发明的方法制备得到的ta-sirna纳米凝胶携带负电荷，可在电场作用下发生定向移动，促进纳米凝胶与细胞膜的接触几率，实现可控的细胞内化。
27.6、本发明的上述制备纳米凝胶的方法，原理可靠，制备方法简单，利于推广应用。
28.下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
29.说明书附图
30.图1为实施例1的ta-sirna纳米凝胶的100nm标尺下tem照片。
31.图2为实施例1的ta-sirna纳米凝胶的50nm标尺下tem照片。
32.图3为实施例1的ta-sirna纳米凝胶的sem形貌图。
33.图4为实施例1～6的ta-sirna纳米凝胶的粒度分布图。
34.图5为本发明的ta-sirna纳米凝胶促进细胞内化的机理示意图。
35.图6为实施例1的ta-sirna纳米凝胶的细胞实验结果图。
36.图7为实施例1的ta-sirna纳米凝胶的基因沉默效率。
37.图8为电场作用下实施例1的ta-sirna纳米凝胶的细胞内化效果。
具体实施方式
38.以下实施例中，sirna为21个氨基酸，购买自上海吉玛制药技术有限公司；单宁酸购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分子量为1701.2。
39.实施例1
40.本实施例提供一种ta-sirna纳米凝胶的制备方法，包括：
41.步骤一、将sirna溶解于pbs缓冲液中，得到0.2od/ml的sirna溶液；所述pbs缓冲液为无rna酶的pbs缓冲液；所述无rna酶的pbs缓冲液比如可以为ph7.4的磷酸盐缓冲液，每1000ml所述磷酸盐缓冲液中含1.44gna2hpo4、0.24gkh2po4、8.0gnacl和0.2gkcl；
42.步骤二、将单宁酸(ta)溶解于pbs缓冲液中，得到质量百分含量为0.2％的ta溶液；所述pbs缓冲液与步骤一的pbs缓冲液相同；
43.步骤三、将1ml步骤一所述sirna溶液在0℃温度条件下搅拌10min，滴入1ml步骤二所述ta溶液，继续搅拌20min；所述搅拌为在磁力搅拌器中进行搅拌，所述搅拌的速率为200rpm；滴加ta溶液的速率为1ml/min；
44.步骤四、将步骤三继续搅拌后体系纯化；所述纯化为通过100kda分子量截流离心过滤装置进行纯化，目的为除去未反应试剂；
45.步骤五、向步骤四纯化后体系中加入pbs缓冲溶液，得到ta-sirna纳米凝胶；可将所述ta-sirna纳米凝胶于4℃温度条件下静置保存，所述pbs缓冲溶液的质量为纯化后体系质量的2倍，所述pbs缓冲液与步骤一的pbs缓冲液相同。
46.实施例2
47.本实施例与实施例1相同，其中不同之处在于，步骤一中，sirna溶液的浓度为4od/ml。
48.实施例3
49.本实施例与实施例1相同，其中不同之处在于，步骤二中，ta溶液的质量百分含量为1％。
50.实施例4
51.本实施例与实施例1相同，其中不同之处在于，步骤二中，ta溶液的质量百分含量为4％。
52.实施例5
53.本实施例提供一种ta-sirna纳米凝胶的制备方法，包括：
54.步骤一、将sirna溶解于pbs缓冲液中，得到0.2od/ml的sirna溶液；所述pbs缓冲液为无rna酶的pbs缓冲液；所述无rna酶的pbs缓冲液比如可以为ph7.4的磷酸盐缓冲液，每1000ml所述磷酸盐缓冲液中含1.44gna2hpo4、0.24gkh2po4、8.0gnacl和0.2gkcl；
55.步骤二、将单宁酸(ta)溶解于pbs缓冲液中，得到质量百分含量为0.2％的ta溶液；所述pbs缓冲液与步骤一的pbs缓冲液相同；
56.步骤三、将1ml步骤一所述sirna溶液在20℃温度条件下搅拌10min，滴入1/3ml步骤二所述ta溶液，继续搅拌120min；所述搅拌为在磁力搅拌器中进行搅拌，所述搅拌的速率为50rpm；滴加ta溶液的速率为1ml/min；
57.步骤四、将步骤三继续搅拌后体系纯化；所述纯化为通过100kda分子量截流离心过滤装置进行纯化，目的为除去未反应试剂；
58.步骤五、向步骤四纯化后体系中加入pbs缓冲溶液，得到ta-sirna纳米凝胶；可将所述ta-sirna纳米凝胶于4℃温度条件下静置保存，所述pbs缓冲溶液的质量为纯化后体系质量的2倍，所述pbs缓冲液与步骤一的pbs缓冲液相同。
59.实施例6
60.本实施例提供一种ta-sirna纳米凝胶的制备方法，包括：
61.步骤一、将sirna溶解于pbs缓冲液中，得到0.1od/ml的sirna溶液；所述pbs缓冲液为无rna酶的pbs缓冲液；所述无rna酶的pbs缓冲液比如可以为ph7.4的磷酸盐缓冲液，每1000ml所述磷酸盐缓冲液中含1.44gna2hpo4、0.24gkh2po4、8.0gnacl和0.2gkcl；
62.步骤二、将单宁酸(ta)溶解于pbs缓冲液中，得到质量百分含量为0.1％的ta溶液；所述pbs缓冲液与步骤一的pbs缓冲液相同；
63.步骤三、将1ml步骤一所述sirna溶液在40℃温度条件下搅拌10min，滴入3ml步骤二所述ta溶液，继续搅拌5min；所述搅拌为在磁力搅拌器中进行搅拌，所述搅拌的速率为500rpm；滴加ta溶液的速率为1ml/min；
64.步骤四、将步骤三继续搅拌后体系纯化；所述纯化为通过100kda分子量截流离心过滤装置进行纯化，目的为除去未反应试剂；
65.步骤五、向步骤四纯化后体系中加入pbs缓冲溶液，得到ta-sirna纳米凝胶；可将所述ta-sirna纳米凝胶于4℃温度条件下静置保存，所述pbs缓冲溶液的质量为纯化后体系质量的2倍，所述pbs缓冲液与步骤一的pbs缓冲液相同。
66.性能评价
67.图1为实施例1的ta-sirna纳米凝胶的100nm标尺下tem照片，图2为实施例1的ta-sirna纳米凝胶的50nm标尺下tem照片，图3为实施例1的ta-sirna纳米凝胶的sem形貌图，根据图1～3可见，该凝胶形貌不规则，并且内部分子的聚集程度要高于外围。
68.图4为实施例1～6的ta-sirna纳米凝胶的粒度分布图，粒度分布测试方法基于动态光散射分析。由图4可见，实施例1的ta-sirna纳米凝胶的凝胶尺寸分布在100nm附近，并且凝胶尺寸相对均一，具有尺寸粒度在10-200nm之间且尺寸分布均匀的特点。与实施例1相比，实施例2的ta-sirna纳米凝胶尺寸变得较大并且分布不均，表明当ta浓度确定时，随着sirna浓度由0.2od/ml增加至4od/ml，凝胶尺寸变大。实施例3中凝胶尺寸在200nm附近，凝胶尺寸相对均一，实施例4中凝胶尺寸在500nm附近。对比实施例1、3和4可知，当sirna浓度一定时，随着ta浓度增加(从0.2％增大到实施例3的1％和实施例4的4％)，凝胶尺寸随之增大。实施例5中凝胶尺寸散分于100nm～1000nm之间，尺寸相对较大，实施例6中凝胶尺寸散分于10nm～2000nm之间，凝胶尺寸更为分散，尺寸分布不均匀性增大。
69.图5显示本发明的ta-sirna纳米凝胶促进细胞内化的机理示意图。ta外侧所暴露的酚羟基可与细胞膜上的特定基团发生相互作用，促进细胞的粘附，从而促进细胞的内化。
70.图6为实施例1的ta-sirna纳米凝胶的细胞实验结果图。根据图6可见，亮白色为荧
光蛋白标记的sirna，单一的sirna的细胞内化效果不好，细胞周围只有很少的绿色荧光，相对于单一的sirna，实施例1的ta-sirna纳米凝胶的细胞摄取非常显著，sirna穿过细胞膜进入细胞内部。这表明，实施例1的ta-sirna纳米凝胶可以有效促进sirna的细胞内化。所述细胞实验操作步骤包括：在dmem培养液中培养巨噬细胞raw264.7，将细胞按照2
×
105cell/孔的数量接种在6孔板中，加入2ml新鲜培养液，等待6h左右至细胞贴壁，向孔中分别加入sirna溶液和实施例1的ta-sirna纳米凝胶，得到sirna组和ta-sirna纳米凝胶组，其中每孔加入的对应sirna和实施例1的ta-sirna纳米凝胶均为100μl/孔，sirna组为浓度为1od/ml sirna溶液，ta-sirna纳米凝胶为无菌条件下制备得到的纳米凝胶，无菌控制方法为本领域常用控制方法，比如可以为通过采用高压蒸汽灭菌或辐照灭菌后的设备器械且在超净工作台中进行制备过程来实现无菌控制，sirna为荧光标记的5'fam-sirna。将sirna组和ta-sirna纳米凝胶组放置于co2培养箱中，6h后吸取培养液，用pbs清洗，用dapi溶液染色，向盖玻片上滴一滴抗荧光猝灭封片剂，将载玻片倒置放在盖玻片上后在共聚焦显微镜下观察拍照。
71.图7为实施例1的ta-sirna纳米凝胶的基因沉默效率。lps诱导巨噬细胞可形成促炎表型从而分泌mmp-9，在control组无mmp-9，表明模型建立成功。其中，sirna(n.c.)为不会沉默任何基因的sirna，为对照组，ta-sirna(n.c.)为ta与sirna(n.c.)形成的纳米凝胶，sirna(mmp-9)为可沉默mmp-9基因的sirna，为试验组，ta-sirna(mmp-9)为ta与sirna(mmp-9)形成的纳米凝胶，sirna(n.c.)和sirna(mmp-9)序列如表1所示。通过对比，相较于sirna，ta-sirna纳米凝胶的细胞内化效果明显，ta-sirna(mmp-9)对应mmp-9含量比ta-sirna(n.c.)对应mmp-9含量降低幅度明显，表明ta-sirna(mmp-9)自组装纳米凝胶可以促进细胞内化，充分发挥sirna(mmp-9)的基因沉默效率。
72.表1 sirna(n.c.)和sirna(mmp-9)序列
[0073][0074]
图8为电场作用下实施例1的ta-sirna纳米凝胶的细胞内化效果。电刺激过程会使组织间形成电场，对带电粒子的运动产生影响，电刺激过程中，电位zate值为-35.563
±
2.635mv。在没有电场作用下，ta-sirna纳米凝胶会因为ta的细胞黏附作用与细胞膜表面的蛋白产生相互作用，从而促进细胞内化，图中箭头指向ta-sirna纳米凝胶，可以看到细胞膜表面的ta-sirna纳米凝胶，会通过细胞膜产生的内吞小泡包载进入到细胞膜内。在电场作用下，细胞膜表面有更多ta-sirna纳米凝胶聚集，表明电场可以促进细胞内吞。其原因可能是，带电的ta-sirna纳米凝胶可以在电场作用下发生定向移动，接触到细胞膜，从而锚定细胞膜上的蛋白。表明电刺激可以促进实施例1的ta-sirna纳米凝胶的细胞内吞，本发明的ta-sirna纳米凝胶在外加电场条件下可获得更大效率的细胞内化，同时表明可通过外加电场调控纳米凝胶促细胞内化效果。
[0075]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术
方案的保护范围内。