功能化纳米硒在制备抗创伤感染药物中的应用

1.本发明涉及功能化纳米硒在制备抗创伤感染药物中的应用。


背景技术：

2.大量研究表明，创伤感染的主要病原菌包括革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、铜绿假单胞菌等，以及革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌等，且这些细菌均对广谱抗生素产生了耐药性。多重耐药的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)感染已成为全球性治疗难题，而临床常用来评价抗菌药物抗菌活性的指标是最低抑菌浓度。
3.目前，针对耐药菌创伤感染的防治措施主要包括抗菌药物联用、新型抗菌药物(纳米银等抗菌剂)研发等。然而，这些策略都有其局限性，例如联合用药虽然可有效提高抗菌效果，但同时也大大增加了细菌产生多重耐药的风险；纳米银虽然显示出较好的抗菌活性，但其潜在的安全性问题难以解决，大大限制了其在临床上的广泛使用。
4.严重创伤也会诱发机体免疫系统功能障碍等问题。近年来免疫治疗在严重创伤治疗中显示出良好的应用前景。其主要利用免疫激活剂或细胞因子，如γ-干扰素(ifn-γ)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)等，重塑机体免疫系统，使得免疫细胞有效杀伤病原菌，从而大大降低创伤感染的风险。然而，免疫细胞长时间释放较高水平的促炎细胞因子不利于伤口的愈合。因此，开发安全、有效、广谱的新型抗生素或抗菌药物一直是该领域亟待解决的关键问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供功能化纳米硒在制备抗创伤感染药物中的应用，功能化纳米硒既具有直接抗菌作用，又具有免疫调控功能。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：
7.功能化纳米硒在制备抗创伤感染药物中的应用；
8.所述的功能化纳米硒为壳聚糖纳米硒(cs-senps)、聚乙烯吡咯烷酮纳米硒(pvp-senps)、香菇多糖纳米硒(lnt-senps)、平菇多糖纳米硒(ptr-senps)、吐温80纳米硒(tw80-senps)、聚乙二醇纳米硒(peg-senps)或聚丙烯胺纳米硒(pah-senps)中的一种以上；所述的功能化纳米硒具有一定的免疫刺激功能，而且呈现浓度依赖效应，对病原菌具有直接杀伤或抑制作用。
9.所述的壳聚糖纳米硒(cs-senps)及其制备方法，现有技术已有所公开，比如中国专利申请cn112870348 a、中国专利申请cn109588235 a、中国发明专利cn106692181 b；
10.优选地，所述的壳聚糖纳米硒由以下步骤制得：
11.将壳聚糖溶液与亚硒酸钠(na2seo3)溶液混合均匀，滴加还原剂溶液，室温下反应过夜，反应溶液透析除去未反应完的聚合物，制得壳聚糖纳米硒；
12.所述的壳聚糖溶液的浓度为0.1～20mg/ml；优选为5mg/ml。
13.所述的亚硒酸钠溶液的浓度为0.5～200mm；优选为100mm。
14.所述还原剂溶液的浓度为2～800mm；优选为400mm。
15.所述的聚乙烯吡咯烷酮纳米硒(pvp-senps)及其制备方法在中国发明专利cn106692181 b已经公开；
16.优选地，所述的聚乙烯吡咯烷酮纳米硒由以下步骤制得：
17.将聚乙烯吡咯烷酮溶液与亚硒酸钠(na2seo3)溶液混合均匀，滴加还原剂溶液，室温下反应过夜，反应溶液透析除去未反应完的聚合物，制得聚乙烯吡咯烷酮纳米硒；
18.所述的聚乙烯吡咯烷酮溶液的浓度为0.1～20mg/ml；优选为10mg/ml。
19.所述的亚硒酸钠溶液的浓度为0.5～200mm；优选为100mm。
20.所述还原剂溶液的浓度为2～800mm；优选为400mm。
21.所述的香菇多糖纳米硒(let-senps)及其制备方法在中国发明专利申请cn109588235 a和cn112999241 a已经公开；
22.优选地，所述的香菇多糖纳米硒由以下步骤制得：
23.将香菇多糖溶液与亚硒酸钠(na2seo3)溶液混合均匀，滴加还原剂溶液，室温下反应过夜，反应溶液透析除去未反应完的聚合物，制得香菇多糖纳米硒；
24.所述的香菇多糖溶液的浓度为0.1～20mg/ml；优选为10mg/ml。
25.所述的亚硒酸钠溶液的浓度为0.5～200mm；优选为100mm。
26.所述还原剂溶液的浓度为2～800mm；优选为400mm。
27.所述的亚硒酸钠和还原剂的摩尔比为1:1～1:8；优选为1:4。
28.所述的还原剂为维生素c(vc)、水合肼或柠檬酸。
29.所述的透析，优选使用10000-100000kda的透析袋透析12-24h。
30.所述的平菇多糖纳米硒(ptr-senps)、吐温80纳米硒(tw80-senps)、聚乙二醇纳米硒(peg-senps)或聚丙烯胺纳米硒(pah-senps)及其制备方法，现有技术已有所公开，比如liu t,xu l,he l,zhao j,zhang z,chen q,chen t.2020.selenium nanoparticles regulates selenoprotein to boost cytokine-induced killer cells-based cancer immunotherapy.nano today 35.
31.yang y,zhang z,chen q,you y,li x,chen t.2021.functionalized selenium nanoparticles synergizes with metformin to treat breast cancer cells through regulation of selenoproteins.front bioeng biotechnol 9:758482.
32.zeng d,zhao j,luk kh,cheung st,wong kh,chen t.2019.potentiation of in vivo anticancer efficacy of selenium nanoparticles by mushroom polysaccharides surface decoration.j agric food chem 67:2865-2876.
33.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
34.本发明合成不同电荷修饰物纳米硒，既可实现对病原菌的直接杀伤作用，又可通过调控机体免疫系统，使得免疫细胞有效清除病原菌感染。功能化纳米硒对创伤部位的免疫细胞出积极有效的调控作用，免疫激活能力好，促进dc细胞、nk细胞成熟与分化，促进巨噬细胞对细菌的吞噬，激活免疫应答，快速杀菌，从而加快创伤的修复。
附图说明
35.图1是不同浓度功能化纳米硒对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌平板的抑菌效果。
36.图2是功能化纳米硒对树突状细胞成熟度的影响。
37.图3是功能化纳米硒对树突状细胞成熟度影响的量化。
38.图4功能化纳米硒对巨噬细胞吞噬细菌的影响。
39.图5是功能化纳米硒对自然杀伤细胞表面nkg2d受体表达情况影响的量化。
具体实施方式
40.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
41.实施例1
42.功能化纳米硒的合成
43.(1)取100mg的cs(壳聚糖，麦克林)，lnt(香菇多糖，陕西森弗生物技术有限公司)，pvp(聚乙烯吡咯烷酮，麦克林)分别溶于10ml的去离子水中，配成浓度为10mg/ml的储备液；取173mg的na2seo3(亚硒酸钠，阿法埃莎)和176mg的vc(抗坏血酸，麦克林)分别溶于10ml的去离子水中，配成浓度为100mm的储备液；
44.(2)取2ml cs溶液，加入0.5ml na2seo3溶液，加入去离子水至8ml后，在磁力搅拌器上搅拌5min使得聚合物与na2seo3充分混匀，形成混合溶液，随后将2ml vc溶液逐滴滴加入混合溶液中至vc滴加完毕后，室温下搅拌过夜。将反应完的溶液置于100000kda的透析袋中，透析24h，用于除去未反应完的聚合物，得到壳聚糖纳米硒；
45.聚乙烯吡咯烷酮纳米硒、香菇多糖纳米硒的制法与壳聚糖纳米硒相同，包括原料用量和比例。
46.实施例2
47.功能化纳米硒的抑菌实验
48.实验选取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(atcc43300)，接种于lb培养基中，在37℃下的恒温摇床上培养过夜。然后将细菌用lb培养基稀释至浓度为107cfu ml-1
。向每个ep管中加入被稀释后的细菌(5μl，107cfu ml-1
)。然后将pbs缓冲液(0.01mmol/l，ph＝7.4，作为空白对照)，壳聚糖纳米硒(cs-senps)、聚乙烯吡咯烷酮纳米硒(pvp-senps)、香菇多糖纳米硒(lnt-senps)分别加入ep管稀释到500μl并在37℃下在振荡摇床上培养过夜。稀释一定倍数，通过平板涂板实验说明抗菌效果。
49.结果如图1和表1所示，对mrsa，lnt-senps展现出较强的抗菌效果，最小抑菌浓度(mic)为8ug/ml，最小杀菌浓度(mbc)为64ug/ml；pvp-senps也有一定的抗菌效果，最小抑菌浓度(mic)为8ug/ml，最小杀菌浓度(mbc)为128ug/ml；cs-senps由于在细菌lb培养基中不稳定，所以展现出较差的抗菌活性，猜想是cs-senps受外界ph影响大，易聚沉。
50.表1
51.单位：μg/mlcs-se npspvp-se npslet-se npsmic6488mbc12812864
52.实施例3
53.功能化纳米硒的免疫激活效果实验
54.(1)功能化纳米硒对树突状细胞成熟的影响
55.dc细胞有一个重要的生物学特性，即dc细胞的成熟。dc细胞首先受到病原体或其他抗原的刺激，然后摄取抗原并对其进行加工处理，逐渐分化为成熟细胞。接下来，dc细胞从外周组织转移到淋巴结、脾脏等部位，向t细胞递呈抗原，从而启动免疫应答，起到杀菌效果。
56.本实验利用雌性c57bl/6小鼠，将其处死后，无菌采集小鼠股骨与胫骨的骨髓，裂解红细胞后，获得单细胞悬液；之后，将其置于含gm-csf细胞因子的培养基中，于二氧化碳细胞培养箱中继续培养6-8天，即可获得骨髓源的树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,bmdc)。之后，将不同功能化纳米硒(硒浓度为1.5μg/ml)分别与bmdc细胞共同孵育过夜，脂多糖(lps)为阳性对照组；最后，收集细胞并利用多种荧光标记的抗体如fitc-cd11c、pe-cd80和apc-cd86利用流式细胞仪检测bmdc细胞成熟度。图2和3所示，经阳性对照脂多糖(lps)处理的dc细胞成熟度为94.93％，空白对照组dc细胞成熟度为36.29％。裸硒(senps)处理的dc细胞成熟度有所提高，达到51.60％，而经功能化纳米硒pvp-senps、cs-senp和lnt-senps处理细胞后，均使其成熟度超过了60％。因此，纳米硒对dc激活有一定效果，其中，用pvp、cs和lnt修饰后的纳米硒刺激效果明显增强。
57.(2)功能化纳米硒对巨噬细胞吞噬细菌的影响
58.巨噬细胞是机体固有免疫的重要组成，也是主要的效应细胞，可通过抗原递呈启动特异性免疫应答，识别、吞噬细胞及消化病原体，也可以通过胞饮作用和受体介导的内吞作用摄入胞外物质。内吞能力的增强有助于促进巨噬细胞免疫效能的提升，功能化纳米硒对巨噬细胞内吞作用的影响目前尚未见报道。
59.1ml耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(1
×
108cfu/ml)用终浓度为10μm 5(6)-羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯(cfda-se，100μg/ml)黑暗染色30min。随后，将染色的菌液离心，去掉cfda-se，并用pbs漂洗。用不同功能化纳米硒(硒浓度为1μg/ml)孵育巨噬细胞(2
×
105/ml)24小时，后刮取细胞，与1
×
108cfu/ml的100μl染色的mrsa混合90min(每30min轻轻冲洗一次)。然后，对细胞进行离心，去除上清液中的非吞噬细菌，并用pbs冲洗细胞后使用流式细胞仪上机分析。
60.结果图4所示，pvp-senps、cs-senp和lnt-senps和裸硒对增加巨噬细胞的吞噬细菌功能都有一定效果，从42％提升到60％以上，其中，不同纳米硒刺激效果差异不大。
61.(3)功能化纳米硒对自然杀伤细胞活化的影响
62.近些年来，自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)nk细胞抗感染免疫相关研究取得了重大进展。越来越多的证据表明nk细胞在病毒、细菌、真菌和原虫等多种病原体感染中均发挥重要作用。nk细胞表面有nkg2d受体，其配体为nkg2dl，是nk细胞活化的标志。
63.将nk细胞在培养皿培养24h后，使用含1.5μg/ml senps、pvp-senps、cs-senps和lnt-senps的培养基孵育24h。
64.以pbs稀释细胞至约10万/ml。向每个离心管中加100μl上述细胞悬液，加入10μg/ml的fitc-anti-nkg2d，4℃孵育30min。细胞以pbs洗涤两次，每次以1000rpm/min速度离心5min。加入以pbs将细胞重悬，使用流式细胞仪上机分析。
65.结果图5所示，pvp-senps、cs-senps和lnt-senps和没有聚合物、多糖修饰的senps对激活nk细胞都有显著效果，其中，用pvp、cs和lnt修饰后的纳米硒激活效果明显增强，lnt-senps激活效果最强。
66.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。