一种与棉籽蛋白复合饲用替代鱼粉的海带多糖的复合酶解制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及一种复合酶解制备海带多糖的提取方法，具体是涉及一种褐藻胶裂解酶与甘露聚糖酶复合酶解海带，并制备具有促进营养吸收和水产生长的海带多糖的方法。


背景技术：

2.鱼粉作为水产养殖饲料配方中的主要蛋白源具有举足轻重的地位。但是由于海洋环境污染日趋严重、海洋渔业资源过度捕捞，导致鱼粉资源急剧减少及其价格的不断攀升，饲料成本大大增加。鱼粉的资源性限制将严重制约水产词料工业的增长，进而影响海水鱼类养殖业的可持续发展。
3.但是在配合饲料中降低鱼粉用量后，养殖水产会出现生长缓慢、抗病力低下等问题。因此，寻求在低鱼粉条件下可提高水产的生长和提高成活率存活率成为近年来水产营养研究的热点。目前在水产养殖中常见的是使用植物源蛋白质替代部分鱼粉。然而植物蛋白饲料多存在抗营养因子或不易消化吸收的组分，其在饲料中含量的增加会导致水产的饵料系数上升，同时一定程度影响水产的生产。因此，需要寻找一种有效的策略，使得植物源蛋白可以更好的应用在水产养殖中。
4.海带多糖是作为海带中天然存在的生物大分子类物质，具有促进排铅、调节血脂、增强免疫、促进生长、提高营养吸收等特殊作用，且无毒副作用。也即，海带多糖可以在水产养殖中发挥保护机体，促进营养吸收等作用。因此，有必要对海带多糖与植物蛋白在水产养殖中的应用进行研究。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种复合酶解生产海带多糖的方法，及其复合棉籽蛋白在对虾养殖中的应用方法。本发明提供的复合酶解生产海带多糖的方法制得的海带多糖与棉籽蛋白复合使用，能够代替常规水产养殖中的鱼粉，且提高对虾的存活率和生长性能。
6.本发明解决其技术问题所采用的的技术方案是：一种复合酶解制备海带多糖的提取方法，包括以下步骤：
7.步骤1：海带粉粉碎：将海带粉投入粉碎机内进行粉碎，粉碎后的海带粉过 100目筛；
8.步骤2：海带粉固态发酵：将过筛海带粉投入均质机，加入海带粉质量10％的玉米淀粉，随后按照料液比1:1加水，混合搅拌均匀，将发酵菌接种到物料中，发酵48h，每12h翻拌一次；
9.其中，所述发酵菌株为黑曲霉；
10.步骤3：酶解液均质：将发酵好的海带粉投入溶解罐内，以固形物含量为基准，按料液比1:10加入水，打开搅拌桨，均质均匀，升温至50℃；
11.步骤4：褐藻胶裂解酶酶解：使用褐藻胶裂解酶进行酶解，酶活力 25000-30000u/
g，酶添加量为250-300u/g海带底物，酶解温度45-60℃，氢氧化钠调节ph至7.0，作用时间3h；
12.步骤5：甘露聚糖酶酶解：用盐酸调节步骤4酶解结束后酶解液ph至4.5，随即使用甘露聚糖酶进行酶解，酶活力40000-50000u/g，酶添加量为200-250u/g 海带底物，酶解温度45-60℃，作用时间2h；
13.步骤6：灭酶：酶解液升温至95℃保持15min进行灭酶；
14.步骤7：离心：按酶解液体积的10％-12％向步骤3制备的酶解液中加入无水乙醇，使大分子糖类物质沉降，随后离心去除酶解残渣；
15.步骤8：酶解液使用滤膜过滤除杂除菌，其中滤膜孔径规格为0.45-0.95μm；
16.步骤9：喷雾干燥：离心除杂上清液悬蒸浓缩至固形物含量≥25％后，按固形物含量的20-25％添加麦芽糊精，进行喷雾干燥，完成制备。作为优选的，所述步骤9喷雾干燥进口温度170-190℃，出风温度90-110℃，流速8-12ml/min，得到海带多糖干粉。
17.所述复合酶解制备的海带多糖应用方法，其特征在于：此种与棉籽浓缩蛋白复合饲用替代鱼粉的海带多糖的应用方法包括如下：
18.方法1：按1％-2％的比例将海带多糖添加进饲料内，混合均匀，按照需要的饲料形态进行加工制备，直接饲喂即可；
19.方法2：按1％-2％的比例将海带多糖溶解进动物日常饮用水中进行使用。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
21.(1)本发明通过固态发酵手段预处理海带原料，再使用褐藻胶裂解酶与甘露聚糖酶复合酶解，可以显著降低海带底物粘度，同时极大的提高酶解速率，用环保、高效的的工艺手段生产分子量低，可溶性好的具有促进生长功效的海带多糖。具有反应条件温和，操作简单，成本低的优点。
22.(2)本发明获得的海带多糖，与棉籽蛋白复合使用饲喂对虾，可以起到替代常规饲料中鱼粉的作用，同时提高了对虾的存活率，且具有优良的促生长效果。
附图说明
23.图1：海带多糖与棉籽蛋白联用代替鱼粉饲喂凡纳滨对虾增重率的影响
24.图2：海带多糖与棉籽蛋白联用代替鱼粉饲喂凡纳滨对虾特定增长率的影响
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.步骤1：海带粉粉碎：将海带粉投入粉碎机内进行粉碎，粉碎后的海带粉过 100目筛。
27.步骤2：海带粉固态发酵：将过筛海带粉投入均质机，加入海带粉质量10％的玉米淀粉，随后按照料液比1:1加水，混合搅拌均匀，将发酵菌接种到物料中，发酵48h，每12h翻拌一次。
20％添加麦芽糊精，溶解均匀后进行喷雾干燥即得海带多糖。其中喷雾干燥进风温度170-180℃，出风温度80-90℃，流速8-10ml/min，海带多糖得率在83％左右。
52.实施例2
53.1)将干海带投入粉碎机进行粉碎，粉碎结束后海带粉使用振动过筛机过100目筛。
54.2)称取7.5kg过筛海带粉投入均质机，加入0.75kg的玉米淀粉，随后加入8.5l 水，将发酵菌接种到物料中，混合均质均匀后转移至大号发酵袋内，28℃发酵 48h，每12h翻拌一次。
55.其中发酵菌为黑曲霉。
56.3)将发酵好的海带粉转移至酶解罐内，加入约80l水并均质均匀，酶解罐夹套通入蒸汽，使酶解液升温至50℃。
57.4)用氢氧化钠将酶解液ph调节至7.0，按300u/g海带粉底物的量加入褐藻胶裂解酶，进行酶解，反应釜搅拌转速50r/min，50℃酶解3h。
58.5)用盐酸调节4)酶解结束后的反应液ph至4.5，按200u/g海带粉底物的量加入甘露聚糖酶，进行酶解，反应釜搅拌转速50r/min，50℃酶解2h。
59.5)酶解罐夹套层通入蒸汽使酶解液升温至95℃保持15min进行灭酶。
60.6)待酶解液冷却后加入10l无水乙醇，静置15min，碟式离心机6000rpm/min 离心去除不溶性残渣。
61.7)离心后的酶解液使用0.45μm滤膜过滤。
62.8)将上清旋蒸浓缩至40l，测定浓缩液中固形物含量，按照固形物含量的20％添加麦芽糊精，溶解均匀后进行喷雾干燥即得海带多糖。其中喷雾干燥进风温度 170-180℃，出风温度80-90℃，流速8-10ml/min，海带多糖得率在85％左右。
63.实施例3
64.本发明技术制备海带多糖与棉籽蛋白复配使用替代部分鱼粉对提高对虾生长情况的影响。按照实施实例2制备本发明技术海带多糖。称取30kg过筛海带粉投入均质机，加入3kg的玉米淀粉，随后加入33l水，将黑曲霉接种到物料中，混合均质均匀，置于震荡式固态发酵罐内发酵48h。发酵结束后，将物料转移至酶解罐内，加入330l水并均质均匀，溶解罐内夹套通入蒸汽，使物料升温至50℃，用氢氧化钠将反应液ph调节至7.0，按300u/g海带粉底物的量加入褐藻胶裂解酶，进行酶解，搅拌桨转速50r/min，50℃酶解3h。褐藻胶裂解酶酶解结束后，再使用盐酸调节反应液ph至4.5，按200u/g海带粉底物的量加入甘露聚糖酶，进行酶解，搅拌桨转速50r/min，50℃酶解2h。酶解结束后，酶解液升温至95℃保持15min进行灭酶。待酶解液冷却后加入40l无水乙醇，静置15min，然后用碟式离心机6000rpm/min离心去除不溶性残渣。离心后的酶解液使用 0.45μm孔径滤膜过滤除菌。将上清旋蒸浓缩至约150l，测定浓缩液中固形物含量，按照固形物含量的20％添加麦芽糊精，溶解均匀后进行喷雾干燥即得海带多糖。其中喷雾干燥进风温度170-180℃，出风温度80-90℃，流速8-10ml/min，产品得率在85％以上。海带多糖产品成分分析如表1所示。
65.根据实验要求，以对虾基础日粮作为主要饲料成分，红鱼粉、棉籽蛋白作为主要蛋白源。其中，阳性对照组使用饲料为：对虾基础日粮 红鱼粉，饲料中鱼粉含量为25％。阴性对照组使用饲料为：对虾基础日粮 红鱼粉 棉籽蛋白，使用棉籽蛋白替代饲料中30％的鱼粉蛋白。试验组使用的饲料在阴性对照组的基础上，使用不同含量的海带多糖替代对虾基
础日粮。试验组1：对虾基础日粮 红鱼粉 棉籽蛋白，海带多糖替代1％的对虾基础日粮；试验组2：对虾基础日粮 红鱼粉 棉籽蛋白，海带多糖替代2％的对虾基础日粮；试验组3：对虾基础日粮 红鱼粉 棉籽蛋白，海带多糖替代3％的对虾基础日粮；试验组4：对虾基础日粮 红鱼粉 棉籽蛋白，海带多糖替代4％的对虾基础日粮。所有原料充分混匀后，挤压制成直径1.0mm的硬颗粒饲料，室温风干水分至20％左右，储存于-20℃以备用。实验饲料的原料及营养组成见表2。
66.挑选大小均匀、体格健康、初重为0.74士0.01g的凡纳滨对虾幼虾720尾，随机分成6组，每组设3个重复，每个重复40尾虾，以重复为单位饲养于容积为0.3立方米的玻璃纤维桶中，养殖试验持续56d。饲料按照体重的8％～20％进行投喂，分别于07:00、11:00、17:00、21:00各投喂1次；投喂1h后观察摄食情况，根据天气、水质等情况适当调整投喂量。试验初期隔天换水，养殖试验结束前2周每天换水，换水量为总水量的1/3～1/2。养殖试验结束后禁食24h，以重复为单位计数并称重。计算对虾生长指标:存活率(sr)、增重率(wg)、特定生长率(sgr)和饲料系数(fcr)公式如下:
67.存活率(survival rate，sr,％)＝100x终末尾数/初始尾数；
68.增重率(weight gain rate，wg，％)＝100x(终末均重-初始均重)/初始均重；
69.特定生长率(special growth，sgr，％1d)＝100x(1n终末均重-ln初始均重)/饲喂天数:
70.饲料系数(feed conversion rate，fcr)＝摄食饲料干重/(终末体重-初始体重)。
71.由表3可知，阴性对照组与阳性对照组相比，对虾的存活率下降了2.8％，而试验组1，试验组2，试验组3，试验组4对虾均无死亡。此外阴性对照组与阳性对照组相比，饲料系数上升了9.8％，添加海带多糖的试验组饲料系数与阳性对照组无明显差异，试验组4的饲料系数下降了2％。对虾增重率如图1所示，对虾特定生长率如图2所示，增重率wg和特定增长率sgr在试验组2均达到显著性最大值(p《0.05)，其他各处理组数值较阳性对照组虽无显著性差异，但仍有轻微的提高。这表明，使用棉籽蛋白替代部分对虾饲料中的鱼粉会降低对虾的存活率，且会提高对虾养殖的饲料系数。而在使用棉籽蛋白替代鱼粉的同时，添加海带多糖，可以维持并提高对虾的存活率，且不影响饲料的利用率，同时可以提高对虾的生产性能。尤其时2％海带多糖与棉籽蛋白复配，可以显著提高对虾的生长性能。即本发明可以消除棉籽蛋白饲喂对对虾的不良影响，维持并提高对虾的存活率，通过提高肠道对营养物质的消化吸收能力，起到良好的促生长效果，达到海带多糖与棉籽蛋白等植物蛋白复合使用代替鱼粉的效果，降低饲养成本。
72.表1海带多糖产品成分分析(％)
[0073][0074]
表2基础饲料组成及营养水平(％)
[0075][0076][0077]
表3海带多糖与棉籽蛋白联用代替鱼粉对凡纳滨对虾存活率和饲料利用的影响
[0078][0079]
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。