Dencichine在制备治疗肝损伤的生物药物制剂中的应用

inflammation，门静脉炎症评分。
16.图2为本发明dencichine改善小鼠lps肝损伤的各生化指标示意图；(a，b)elisa检测肝组织中的肝损伤指标ast和alt。(c，d)elisa检测肝组织中的抗氧化因子gsh和sod。(e，f)elisa检测肝组织中的氧化状态，即o-2
和no的水平；
17.其中，
*
p《0.05与normal placebo比，
#
p《0.05与lps placebo；normal，不加lps刺激的分组；placebo，为dencichine的阴性对照；lps，lipoplysaccharide；u/l，每升里还有的酶单位数；u/mgprotein，每毫克蛋白含有的酶单位数；nm/ml，每毫升还有的纳摩尔数；u/min/mg protein，每毫克蛋白每分钟含有的活性氧单位数；ast，谷草转氨酶；alt，谷丙转氨酶；gsh，谷胱甘肽；sod，超氧化物歧化酶；o-2
，活性氧的一种；no，一氧化氮。
18.图3为本发明dencichine抑制小鼠的lps肝损伤所涉及的信号通路(cyp2e/nrf2/ros和pi3k/akt通路)；(a)dencichine对cyp2e/nrf2/ros蛋白水平的影响；(b)dencichine对pi3k/akt蛋白水平的影响；
19.其中，
*
p《0.05与normal placebo比，
#
p《0.05与lps placebo；normal，不加lps刺激的分组；placebo，为dencichine的阴性对照；lps，lipoplysaccharide；sod，超氧化物歧化酶；nrf2，核转录因子；cyp2e，细胞色素p450变体2e1；ros，ros激酶；gapdh，内在蛋白表达的参照物；pi3k，磷酸肌醇-3-激酶；akt，一般是指蛋白激酶b；akt，磷酸化的蛋白激酶b。
具体实施方式
20.下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.参照图1-图3，dencichine在制备治疗肝损伤的生物药物制剂中的应用。
22.其中，dencichine的结构式为：
[0023][0024]
其中，dencichine在制备治疗肝损伤的生物药物制剂包括注射剂、输液剂或含有dencichine的药物制剂；此外，dencichine用作cyp2e/nrf2/ros和pi3k/akt通路的抑制剂。
[0025]
本发明dencichine，购自于mce(medchemexpress)。
[0026]
本发明dencichine用于制备lps肝损伤治疗的产品，甚至用于制备保护肝脏的其他制剂，给药方式为注射剂、输液或口服。此外，dencichine制备cyp2e/nrf2/ros和pi3k/akt通路的抑制剂。
[0027]
本发明首次以dencichine防治lps肝损伤。实验指出，dencichine可以显著地抑制lps肝损伤。因此，开发应用dencichine有望开发作为治疗lps肝损伤的药物制剂。
[0028]
实施例1：dencichine抑制lps肝损伤。
[0029]
1.1实验方法
[0030]
实施方案1：dencichine抑制lps肝损伤
[0031]
1.1.1建立lps诱导的肝损伤小鼠模型
[0032]
从常州卡文斯购买8周龄的c57 bl/小鼠，约22.1g/只。将小鼠饲养于标准的spf级别动物房。在建模过程中，先将小鼠饥饿16小时，随机分成三组，每组10只：normal placebo、lps placebo、lps dencichine，其中dencichine的给药量100mg/kg体重/天，而lps的用量是5mg/kg体重/天。连续lps和dencichine同步给药24天。
[0033]
1.1.2h&e染色检测小鼠肝脏的损伤情况
[0034]
小鼠的肝脏组织经过4％多聚甲醛固定24h后，石蜡包埋并切片。(1)二甲苯(i)15分钟、二甲苯(ii)15分钟、二甲苯(iii)5分钟。(2)100％乙醇5分钟、95％乙醇5分钟、80％乙醇5分钟，蒸馏水冲洗1分钟。(3)苏木素染色15分钟，流水冲洗1分钟。(4)盐酸乙醇分化1～5秒，自来水冲洗1分钟。(5)0.2％氨水返蓝20秒，自来水冲洗1分钟。(6)伊红染色90秒。(7)进行脱水和透明，即80％乙醇2～5秒、95％乙醇2～5秒、100％乙醇(i)3分钟、100％乙醇(ii)3分钟、二甲苯10分钟。最后，中性树脂封片。染色之后，对切片结果进行门静脉炎症评分。
[0035]
1.2实验结果：
[0036]
1)本实施例的研究结果表明，dencichine可以明显改善lps引起的小鼠肝损伤。
[0037]
2)h&e染色之后的门静脉炎症评分显示，dencichine可以显著地抑制lps诱导的肝损伤。
[0038]
实施例2：dencichine改善小鼠lps肝损伤的各生化指标
[0039]
2.1实验方法：
[0040]
2.1.1建立lps诱导的小鼠肝损伤模型
[0041]
从常州卡文斯购买8周龄的c57 bl/小鼠，约22.1g/只。将小鼠饲养于标准的spf级别动物房。在建模过程中，先将小鼠饥饿16小时，随机分成三组，每组10只：normal placebo、lps placebo、lps dencichine，其中dencichine的给药量100mg/kg体重/天，而lps的用量是5mg/kg体重/天。连续lps和dencichine同步给药24天。
[0042]
2.1.2elisa检测小鼠肝脏中的肝损伤、抗氧化、氧化因子
[0043]
当按照2.1.1中建立小鼠肝损伤模型，应用dencichine治疗该lps肝损伤。在lps和dencichine同步持续给药24天之后，处理小鼠，取肝脏组织进行研磨、匀浆，再离心15min
×
20000g，取上清用于后续的elisa分析。各elisa试剂盒(ast、alt、gsh、sod、o-2
、no的elisa试剂盒是abcam货号ab263882、ab282882、ab19534，碧云天货号s0101s、s0033s、s0021s)，详细操作过程请参照试剂盒说明书。
[0044]
2.1.3westernblot检测
[0045]
称一定重量的小鼠肝组织，加入ripa裂解液(radio immunoprecipitationassay)在冰上研磨组织。离心15min
×
20000g，取上清，加蛋白上样缓冲液；于100℃煮样8min；再离心3min
×
20000g，上样30μg，使用8％的page-sds胶电泳；转膜至pvdf膜，包被一抗、二抗；显影、拍照获得目的蛋白条带：sod1、nrf2、cyp2e、ros、gapdh、pi3k、p-akt、akt，而gapdh作为内参。对各蛋白条带使用image j进行灰度分析，统计分析各灰度值。
[0046]
2.2实验结果：
[0047]
在小鼠体内的实验表明，dencichine可以显著地降低肝损伤指标ast和alt水平(图2a、2b)；dencichine可以显著地提高小鼠肝脏的抗氧化因子gsh和sod的水平(图2c、2d)；dencichine可以显著地降低小鼠肝脏的氧化水平(图2e、2f)。
[0048]
western blot实验结果显示，dencichine可以显著地恢复lps小鼠肝组织中sod1、nrf2、cyp2e、ros、pi3k、p-akt、akt(图3a、3b)。
[0049]
综上所述，dencichine可以显著改善小鼠lps肝损伤的肝组织形态，以及各指标ast、alt、gsh、sod、o-2
、no。由此可见，dencichine有望开发成为治疗lps肝损伤的药物制剂通过抑制cyp2e/nrf2/ros和pi3k/akt通路。
[0050]
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。