一种双重交联胶原蛋白填充剂的组成和制备方法及应用
1.技术领域
1.本发明提供了一种双重交联胶原蛋白填充剂的组成、制备方法和使用方法。其组成为通过还原性单糖和碳二亚胺双重交联的胶原纤维，制备方法包括胶原纤维形成和逐级交联，使用方法包括修复和填充人体组织缺陷。本发明属于医学生物材料技术领域。
2.
背景技术：
2.人体软组织通过胶原蛋白、弹性蛋白和细胞外基质(包括糖胺聚糖)等结构蛋白质保持其结构完整性。由创伤、先天性畸形或疾病引起的软组织缺损可以通过注射生物组织、移植自体组织或向软组织缺损部位注射合成聚合物等方法增强或修复。根据作用机理，皮肤填充剂分为三类：第一类的功能是直接扩增或填充软组织体积，这类填料以透明质酸为主要成分；第二类的功能是在给定的时间段内引起异物反应并且直接填充组织缺陷，从而长时间或永久性地诱导内源性胶原形成，并且直接填充组织缺陷，这类填料包括聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚己内酯(pcl)和聚乳酸(plla)。第三类的功能是在直接填充组织缺陷的同时为细胞长入提供骨架诱导天然组织再生，这类材料主要是以胶原蛋白为主要成分。
3.胶原是人体组织中主要的结构蛋白。一个成年人的身体内约有2.5公斤胶原蛋白，主要分布于人体皮肤、骨骼、血管、牙齿、筋腱。迄今为止，已发现29种类型胶原蛋白，它们的共同特点是至少含有一段三股螺旋结构。高纯度天然胶原蛋白有非常好的生物相容性，因而被广泛应用于医学生物材料领域。应用于生物材料的胶原蛋白主要含有属于形成纤维的胶原蛋白的i型和iii型胶原。i型和iii型胶原分子都是由三条α链组成的三聚体蛋白，它们的分子量大约为300kd。i型胶原是含有2条α1(i)链和1条α2(i)链的异聚体，而iii型胶原是含有3条相同α1(iii)链的同聚体。每条α链含有大约1000个氨基酸残基，它们都具有典型的重复的gly-x-y序列，脯氨酸通常占据x位置，而羟脯氨酸则占据y位置。由于含有高含量的脯氨酸和羟脯氨酸，每个α链会形成左旋螺旋结构，α链进一步折叠，相互缠绕形成三股螺旋结构。棒状的i型和iii型胶原分子长度约为300nm，直径约为1.5nm。
4.由于胶原蛋白是动物组织的天然成分，高纯度天然胶原蛋白具有非常好的生物相容性，被用来作为组织填充剂。最早应用于临床除皱的填充剂是胶原美容注射胶，包括没有交联的胶原纤维注射胶。胶原纤维注射胶collagen implants(collagen corporation，美国)的除皱效果仅在3-6个月。利用戊二醛交联的胶原纤维注射胶collagen implants(collagen corporation，美国)的除皱效果可以达到9个月左右。后来由以色列的colbarlifescienceltd.公司开发出的经过还原性单糖交联的胶原注射胶porcine collagen dermal filler的除皱效果为12个月左右。
5.透明质酸(ha)是人体细胞外基质和细胞间质的主要成分之一，是细胞之间的填充物，对皮肤的形态、结构及功能起着重要的作用。透明质酸是1934年哥伦比亚大学眼科教授meyer和palmer从牛眼玻璃体中分类出的大分子多糖，是由(β-1，4)-d-葡糖醛酸-(β-1，3)-n-乙酰-d-氨基葡糖的双糖单位重复连接组成的高分子链状聚合物。常见于某些细菌的荚膜、病毒的蛋白成分或脊椎动物体中，是一种易于吸收降解的生物材料，现广泛应用于医疗
器械和化妆品领域中。在医美行业中主要用于额眉间皱纹、法令纹及嘴角凹纹的填补，修整鼻尖鼻梁、丰唇、修下巴、青春痘与水痘凹疤修正等。
6.透明质酸广泛应用于医美行业，该类产品国外有(galderma s.a，瑞士)及(allergan aesthetics，美国)，国内主要有润百颜注射用修饰透明质酸钠凝胶(华熙生物)以及爱芙莱(爱美客技术)等产品。上述产品通过对透明质酸交联，可减缓其在体内降解的速度，除皱效果可保持到9个月左右。但透明质酸产品也不乏在应用中会引起红斑、肿胀和淤青等不良反应，出现皮肤凹凸不平、皮肤坏死、肿胀、疼痛和皮肤发红等反应(参阅殷悦等人《中国美容医学》2020，29(01)；吴艳《临床皮肤科杂志》2019，48(08)；戴霞等人《中国美容整形外科杂志》2018，29-02)。
7.综上所述，以透明质酸和胶原为原料的美容注射胶，其除皱效果保持时间比较短，一般在3至12个月之内。新一代的天然生物材料美容除皱注射胶产品，需要考虑并具备提高其稳定性和延长除皱效果保持时间的性能，减少注射治疗周期，提高受用者的应用效果。
3.
技术实现要素：
8.3.1定义
9.当在本文中使用时，以下术语具有下列含义：
[0010]“胶原”指本领域技术人员已知的任何胶原。
[0011]“形成纤维的胶原蛋白”是指可以形成胶原纤维的胶原类型，包括i、ii、iii、v和xi型胶原。
[0012]“i型胶原”包括i型胶原分子和它的多聚体，i型胶原分子是异三聚分子，含有两条α1(i)链和一条α2(i)链。
[0013]“iii型胶原”包括iii型胶原分子和它的多聚体，iii型胶原分子是同三聚胶原，含有三条相同的α1(iii)链。
[0014]“生物相容性”指本领域技术人员已知的在动物活体组织中不产生毒性、损伤、免疫反应或排斥从而具有生物可相容的性质。
[0015]
胶原纤维“交联”指利用化学交联剂在胶原纤维内的胶原分子和胶原纤维之间的胶原分子形成交联共价键聚合，改进胶原纤维的稳定性。
[0016]
3.2发明的实施方式
[0017]
本发明提供了一种双重交联胶原蛋白填充剂的组成、制备和应用方法。其组成为通过还原性单糖和碳二亚胺双重交联的胶原纤维注射胶，制备方法包括胶原纤维形成和逐级交联，使用方法包括修复和填充人体组织缺陷。
[0018]
3.2.1双重交联胶原蛋白填充剂的组成
[0019]
在一个实施方式中，本发明提供了一种双重交联胶原蛋白填充剂的组成。其组成为通过还原性单糖和碳二亚胺双重交联的胶原纤维。在本发明的双重交联胶原蛋白填充剂的组成中的胶原蛋白属于可以形成纤维的胶原类型，包括i、ii、iii、v和xi型胶原。在另一个实施方式中，所述可以形成纤维的胶原类型是皮肤细胞外基质中常见的包括i和iii型胶原蛋白及其混合物。在一个实施方式中，所述的i和iii型胶原蛋白是由牛的组织提取纯化精制而得的胶原蛋白，也可以是人或其它动物组织提取纯化精制而得的i和iii型胶原蛋白，也可以是利用基因重组制备的胶原蛋白。
[0020]
在一个实施方式中，本发明提供了一种双重交联胶原蛋白填充剂的组成，其组成为通过还原性单糖和碳二亚胺双重交联的胶原纤维注射胶。还原性单糖作为化学交联剂在胶原纤维内的胶原分子和胶原纤维之间的胶原分子形成交联共价键聚合，改进胶原纤维的稳定性。还原性单糖包括葡萄糖、果糖和核糖等单糖。浓度比例为0.5％-10％之间。
[0021]
在另一个实施方式中，利用水溶性碳二亚胺，交联已经过还原性单糖交联过的胶原纤维，碳二亚胺交联会在胶原分子之间形成共价酰胺键，进一步促进胶原纤维的稳定性。
[0022]
在一个实施方式中，本发明提供的双重交联胶原蛋白填充剂，其组成中胶原含量在25-75mg/ml之间，优选为35-65mg/ml之间。
[0023]
3.2.2双重交联胶原蛋白填充剂的制备方法
[0024]
在一个实施方式中，本发明提供了一种双重交联胶原蛋白填充剂的制备方法。以提纯精制的可以形成纤维的胶原蛋白为原料，通过还原性单糖和碳二亚胺逐级交联制备双重交联胶原蛋白填充剂。
[0025]
在本发明的制备方法中使用的胶原蛋白属于可以形成纤维的胶原类型，包括i、ii、iii、v和xi型胶原。在另一个实施方式中，所述可以形成纤维的胶原类型是皮肤细胞外基质中常见的包括i和iii型胶原蛋白及其混合物。在一个实施方式中，本发明的制备方法中使用的胶原蛋白是由动物组织提取纯化精制的胶原蛋白，也可以使用重组胶原蛋白。
[0026]
在一个实施方式中，利用还原性单糖和碳二亚胺逐级双重交联胶原纤维制备方法是先利用还原性单糖交联胶原纤维，将胶原纤维悬浮于含有还原性单糖的溶液中密封育温，所述还原性单糖溶液的单糖为葡萄糖、果糖或核糖，其浓度在0.5％-10％之间，ph值在6.0-8.0之间。育温温度为20-37℃，育温时间在7-21天之间。可以根据本领域技术人员已知的常用方法，利用包括离心技术或过滤技术收集所述还原性单糖交联后的胶原纤维。
[0027]
本发明首次发现还原性单糖交联后的胶原纤维可以通过碳二亚胺再次交联，双重交联后的胶原纤维提高了其结构稳定性。在一个实施例中，将还原性单糖交联后胶原纤维置于室温下的碳二亚胺溶液中处理，所诉碳二亚胺为水溶性碳二亚胺，包括1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)。碳二亚胺的浓度在0.1mg/ml-5mg/ml之间，所述碳二亚胺交联反应ph值在5.0-7.5之间。碳二亚胺交联剂可以和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或n-羟基硫代琥珀酰亚胺联合使用。碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或n-羟基硫代琥珀酰亚胺比例在1∶5至5∶1之间。在另一个实施例中，交联反应混合物中含有50-70％乙醇或异丙醇以降低胶原纤维悬浮增加胶原纤维之间交联。
[0028]
根据本领域技术人员已知的常用方法，利用包括离心或过滤挤压收集所述的双重交联胶原纤维，用磷酸缓冲液或生理食盐水清洗后，调节胶原浓度，匀浆制备双重交联胶原蛋白填充剂，其胶原浓度在25-75mg/ml之间。
[0029]
3.2.3双重交联胶原蛋白填充剂的使用方法
[0030]
本发明所述的双重交联胶原蛋白填充剂，可单独使用或联合使用，用于修复和填充人体组织缺陷。双重交联胶原蛋白填充剂可以注射于皮内或皮下，用于组织填充和去除皱纹。
[0031]
双重交联胶原蛋白填充剂可以进一步和生物活性物质结合，如细胞、小分子、生物大分子和组织碎片，用于皮肤除皱和组织再生。这些生物活性大分子和制剂包括异源或自体生长因子、蛋白质(包括基质蛋白)、肽、抗体、酶、血小板、血小板丰富的血浆、糖蛋白、激
素、细胞因子、糖胺多糖、核酸、病毒、病毒颗粒及其组合。可进一步包括以下一种或多种生物大分子及制剂：上皮细胞生长因子(egf)、肝细胞生长因子(hgf)、血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(如bfgf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、胰岛素衍生生长因子(如igf-1、igf-ii)和转化生长因子(如tgf-β)、透明质酸、硫酸软骨素、dna质粒和mrna。
[0032]
这些用途和应用是利用本发明的双重交联胶原蛋白填充剂的特性，不应被解释为它的用途仅局限于此。
4.具体实施方式
[0033]
实施例1：胶原蛋白纤维的双重交联
[0034]
取一定体积的胶原溶液purecol(牛源，advanced biomatrix，美国)，用10mm hcl稀释至2mg/ml。加入1/10倍体积的0.2mna2hpo4(ph 11.2)溶液，混匀后室温下(20-25℃)放置过夜，离心收集胶原纤维沉淀。在纤维沉淀中加入0.3倍体积的3％d-核糖-磷酸盐缓冲液(pbs)溶液，调整溶液为ph7.0，震动悬浮，30℃下密封育温7天。离心收集沉淀，即得核糖交联胶原纤维。然后在核糖交联胶原纤维中加0.3倍体积5mg/ml n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)-50mm吗啉乙磺酸缓冲液(mes)及0.03倍体积5％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)-50mm吗啉乙磺酸缓冲液(mes)，溶液ph 5.5，震动悬浮，室温放置过夜。离心收集胶原纤维沉淀，即得双重交联胶原纤维，密封，4℃保存。
[0035]
实施例2：双重交联胶原蛋白纤维热稳定性测定
[0036]
利用差示扫描量热仪(dsc)方法测定实施例1制备的双重交联胶原纤维的热稳定性。对照组为没有进行任何交联的胶原纤维，核糖交联组为仅利用核糖交联处理过的胶原纤维。将实施例1中离心收集的胶原纤维、核糖交联胶原纤维和双重交联胶原纤维样品分别转入dsc测试铝坩埚中，然后封置于差示扫描量热仪(耐驰科学仪器商贸有限公司，型号：dsc 214)中，氮气气氛下，2℃/min升温温度，流速60ml/min，在升温范围4℃至75℃条件下进行扫描测定。
[0037]
检测数据见表1，结果显示双重交联组的热稳定性明显好于核糖交联组和对照组。
[0038]
表1：温度变化对各种胶原纤维稳定性的影响
[0039]
组别熔点 单位：℃对照组(未交联胶原纤维)49.2℃核糖交联组57.0℃核糖和edc双重交联组66.6℃
[0040]
实施例3：胶原蛋白纤维在乙醇溶液中双重交联
[0041]
取一定体积的胶原溶液purecol(牛源，advanced biomatrix，美国)，用10mm hcl稀释至2mg/ml。加入1/10倍体积的0.2mna2hpo4(ph 11.2)溶液，混匀后室温下(20-25℃)放置过夜，离心收集胶原纤维沉淀。在纤维沉淀中加入0.3倍体积的3％d-核糖-磷酸盐缓冲液(pbs)溶液，调整溶液为ph7.0，震动悬浮，30℃下密封育温7天，离心收集沉淀，得核糖交联胶原纤维。然后在前述沉淀中加入0.15倍的无水乙醇混匀，再加入0.02倍的10mg/ml n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)生理盐水溶液及0.02倍的10mg/ml 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)生理盐水溶液，混匀，室温放置过夜。离心收集沉淀，即得双重交联胶原纤维沉淀，密封，4℃保存。
[0042]
实施例4：双重交联胶原蛋白填充剂制备
[0043]
将实施例3制备的双重交联胶原蛋白纤维样品，装入低温球磨仪(上海净信，冷冻研磨仪，型号jxfstprp-cl)样品研磨罐中，在液氮冷冻的条件下，设定频率为60hz，启动运行冷冻球磨机3分钟，然后取出研磨罐，加入生理盐水将胶原蛋白纤维浓度调节为35mg/ml，再将调节好浓度的溶液分装于1毫升规格的针管中，密封，4℃保存。
[0044]
上面结合具体实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍为本发明的保护范围。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更，但是依据本发明的技术实质对本发明所作的任何修改、等同变化与改型，仍属于本发明的保护范围。
1.技术领域
1.本发明提供了一种双重交联胶原蛋白填充剂的组成、制备方法和使用方法。其组成为通过还原性单糖和碳二亚胺双重交联的胶原纤维，制备方法包括胶原纤维形成和逐级交联，使用方法包括修复和填充人体组织缺陷。本发明属于医学生物材料技术领域。
2.
背景技术：
2.人体软组织通过胶原蛋白、弹性蛋白和细胞外基质(包括糖胺聚糖)等结构蛋白质保持其结构完整性。由创伤、先天性畸形或疾病引起的软组织缺损可以通过注射生物组织、移植自体组织或向软组织缺损部位注射合成聚合物等方法增强或修复。根据作用机理，皮肤填充剂分为三类：第一类的功能是直接扩增或填充软组织体积，这类填料以透明质酸为主要成分；第二类的功能是在给定的时间段内引起异物反应并且直接填充组织缺陷，从而长时间或永久性地诱导内源性胶原形成，并且直接填充组织缺陷，这类填料包括聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚己内酯(pcl)和聚乳酸(plla)。第三类的功能是在直接填充组织缺陷的同时为细胞长入提供骨架诱导天然组织再生，这类材料主要是以胶原蛋白为主要成分。
3.胶原是人体组织中主要的结构蛋白。一个成年人的身体内约有2.5公斤胶原蛋白，主要分布于人体皮肤、骨骼、血管、牙齿、筋腱。迄今为止，已发现29种类型胶原蛋白，它们的共同特点是至少含有一段三股螺旋结构。高纯度天然胶原蛋白有非常好的生物相容性，因而被广泛应用于医学生物材料领域。应用于生物材料的胶原蛋白主要含有属于形成纤维的胶原蛋白的i型和iii型胶原。i型和iii型胶原分子都是由三条α链组成的三聚体蛋白，它们的分子量大约为300kd。i型胶原是含有2条α1(i)链和1条α2(i)链的异聚体，而iii型胶原是含有3条相同α1(iii)链的同聚体。每条α链含有大约1000个氨基酸残基，它们都具有典型的重复的gly-x-y序列，脯氨酸通常占据x位置，而羟脯氨酸则占据y位置。由于含有高含量的脯氨酸和羟脯氨酸，每个α链会形成左旋螺旋结构，α链进一步折叠，相互缠绕形成三股螺旋结构。棒状的i型和iii型胶原分子长度约为300nm，直径约为1.5nm。
4.由于胶原蛋白是动物组织的天然成分，高纯度天然胶原蛋白具有非常好的生物相容性，被用来作为组织填充剂。最早应用于临床除皱的填充剂是胶原美容注射胶，包括没有交联的胶原纤维注射胶。胶原纤维注射胶collagen implants(collagen corporation，美国)的除皱效果仅在3-6个月。利用戊二醛交联的胶原纤维注射胶collagen implants(collagen corporation，美国)的除皱效果可以达到9个月左右。后来由以色列的colbarlifescienceltd.公司开发出的经过还原性单糖交联的胶原注射胶porcine collagen dermal filler的除皱效果为12个月左右。
5.透明质酸(ha)是人体细胞外基质和细胞间质的主要成分之一，是细胞之间的填充物，对皮肤的形态、结构及功能起着重要的作用。透明质酸是1934年哥伦比亚大学眼科教授meyer和palmer从牛眼玻璃体中分类出的大分子多糖，是由(β-1，4)-d-葡糖醛酸-(β-1，3)-n-乙酰-d-氨基葡糖的双糖单位重复连接组成的高分子链状聚合物。常见于某些细菌的荚膜、病毒的蛋白成分或脊椎动物体中，是一种易于吸收降解的生物材料，现广泛应用于医疗
器械和化妆品领域中。在医美行业中主要用于额眉间皱纹、法令纹及嘴角凹纹的填补，修整鼻尖鼻梁、丰唇、修下巴、青春痘与水痘凹疤修正等。
6.透明质酸广泛应用于医美行业，该类产品国外有(galderma s.a，瑞士)及(allergan aesthetics，美国)，国内主要有润百颜注射用修饰透明质酸钠凝胶(华熙生物)以及爱芙莱(爱美客技术)等产品。上述产品通过对透明质酸交联，可减缓其在体内降解的速度，除皱效果可保持到9个月左右。但透明质酸产品也不乏在应用中会引起红斑、肿胀和淤青等不良反应，出现皮肤凹凸不平、皮肤坏死、肿胀、疼痛和皮肤发红等反应(参阅殷悦等人《中国美容医学》2020，29(01)；吴艳《临床皮肤科杂志》2019，48(08)；戴霞等人《中国美容整形外科杂志》2018，29-02)。
7.综上所述，以透明质酸和胶原为原料的美容注射胶，其除皱效果保持时间比较短，一般在3至12个月之内。新一代的天然生物材料美容除皱注射胶产品，需要考虑并具备提高其稳定性和延长除皱效果保持时间的性能，减少注射治疗周期，提高受用者的应用效果。
3.
技术实现要素：
8.3.1定义
9.当在本文中使用时，以下术语具有下列含义：
[0010]“胶原”指本领域技术人员已知的任何胶原。
[0011]“形成纤维的胶原蛋白”是指可以形成胶原纤维的胶原类型，包括i、ii、iii、v和xi型胶原。
[0012]“i型胶原”包括i型胶原分子和它的多聚体，i型胶原分子是异三聚分子，含有两条α1(i)链和一条α2(i)链。
[0013]“iii型胶原”包括iii型胶原分子和它的多聚体，iii型胶原分子是同三聚胶原，含有三条相同的α1(iii)链。
[0014]“生物相容性”指本领域技术人员已知的在动物活体组织中不产生毒性、损伤、免疫反应或排斥从而具有生物可相容的性质。
[0015]
胶原纤维“交联”指利用化学交联剂在胶原纤维内的胶原分子和胶原纤维之间的胶原分子形成交联共价键聚合，改进胶原纤维的稳定性。
[0016]
3.2发明的实施方式
[0017]
本发明提供了一种双重交联胶原蛋白填充剂的组成、制备和应用方法。其组成为通过还原性单糖和碳二亚胺双重交联的胶原纤维注射胶，制备方法包括胶原纤维形成和逐级交联，使用方法包括修复和填充人体组织缺陷。
[0018]
3.2.1双重交联胶原蛋白填充剂的组成
[0019]
在一个实施方式中，本发明提供了一种双重交联胶原蛋白填充剂的组成。其组成为通过还原性单糖和碳二亚胺双重交联的胶原纤维。在本发明的双重交联胶原蛋白填充剂的组成中的胶原蛋白属于可以形成纤维的胶原类型，包括i、ii、iii、v和xi型胶原。在另一个实施方式中，所述可以形成纤维的胶原类型是皮肤细胞外基质中常见的包括i和iii型胶原蛋白及其混合物。在一个实施方式中，所述的i和iii型胶原蛋白是由牛的组织提取纯化精制而得的胶原蛋白，也可以是人或其它动物组织提取纯化精制而得的i和iii型胶原蛋白，也可以是利用基因重组制备的胶原蛋白。
[0020]
在一个实施方式中，本发明提供了一种双重交联胶原蛋白填充剂的组成，其组成为通过还原性单糖和碳二亚胺双重交联的胶原纤维注射胶。还原性单糖作为化学交联剂在胶原纤维内的胶原分子和胶原纤维之间的胶原分子形成交联共价键聚合，改进胶原纤维的稳定性。还原性单糖包括葡萄糖、果糖和核糖等单糖。浓度比例为0.5％-10％之间。
[0021]
在另一个实施方式中，利用水溶性碳二亚胺，交联已经过还原性单糖交联过的胶原纤维，碳二亚胺交联会在胶原分子之间形成共价酰胺键，进一步促进胶原纤维的稳定性。
[0022]
在一个实施方式中，本发明提供的双重交联胶原蛋白填充剂，其组成中胶原含量在25-75mg/ml之间，优选为35-65mg/ml之间。
[0023]
3.2.2双重交联胶原蛋白填充剂的制备方法
[0024]
在一个实施方式中，本发明提供了一种双重交联胶原蛋白填充剂的制备方法。以提纯精制的可以形成纤维的胶原蛋白为原料，通过还原性单糖和碳二亚胺逐级交联制备双重交联胶原蛋白填充剂。
[0025]
在本发明的制备方法中使用的胶原蛋白属于可以形成纤维的胶原类型，包括i、ii、iii、v和xi型胶原。在另一个实施方式中，所述可以形成纤维的胶原类型是皮肤细胞外基质中常见的包括i和iii型胶原蛋白及其混合物。在一个实施方式中，本发明的制备方法中使用的胶原蛋白是由动物组织提取纯化精制的胶原蛋白，也可以使用重组胶原蛋白。
[0026]
在一个实施方式中，利用还原性单糖和碳二亚胺逐级双重交联胶原纤维制备方法是先利用还原性单糖交联胶原纤维，将胶原纤维悬浮于含有还原性单糖的溶液中密封育温，所述还原性单糖溶液的单糖为葡萄糖、果糖或核糖，其浓度在0.5％-10％之间，ph值在6.0-8.0之间。育温温度为20-37℃，育温时间在7-21天之间。可以根据本领域技术人员已知的常用方法，利用包括离心技术或过滤技术收集所述还原性单糖交联后的胶原纤维。
[0027]
本发明首次发现还原性单糖交联后的胶原纤维可以通过碳二亚胺再次交联，双重交联后的胶原纤维提高了其结构稳定性。在一个实施例中，将还原性单糖交联后胶原纤维置于室温下的碳二亚胺溶液中处理，所诉碳二亚胺为水溶性碳二亚胺，包括1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)。碳二亚胺的浓度在0.1mg/ml-5mg/ml之间，所述碳二亚胺交联反应ph值在5.0-7.5之间。碳二亚胺交联剂可以和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或n-羟基硫代琥珀酰亚胺联合使用。碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)或n-羟基硫代琥珀酰亚胺比例在1∶5至5∶1之间。在另一个实施例中，交联反应混合物中含有50-70％乙醇或异丙醇以降低胶原纤维悬浮增加胶原纤维之间交联。
[0028]
根据本领域技术人员已知的常用方法，利用包括离心或过滤挤压收集所述的双重交联胶原纤维，用磷酸缓冲液或生理食盐水清洗后，调节胶原浓度，匀浆制备双重交联胶原蛋白填充剂，其胶原浓度在25-75mg/ml之间。
[0029]
3.2.3双重交联胶原蛋白填充剂的使用方法
[0030]
本发明所述的双重交联胶原蛋白填充剂，可单独使用或联合使用，用于修复和填充人体组织缺陷。双重交联胶原蛋白填充剂可以注射于皮内或皮下，用于组织填充和去除皱纹。
[0031]
双重交联胶原蛋白填充剂可以进一步和生物活性物质结合，如细胞、小分子、生物大分子和组织碎片，用于皮肤除皱和组织再生。这些生物活性大分子和制剂包括异源或自体生长因子、蛋白质(包括基质蛋白)、肽、抗体、酶、血小板、血小板丰富的血浆、糖蛋白、激
素、细胞因子、糖胺多糖、核酸、病毒、病毒颗粒及其组合。可进一步包括以下一种或多种生物大分子及制剂：上皮细胞生长因子(egf)、肝细胞生长因子(hgf)、血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(如bfgf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、胰岛素衍生生长因子(如igf-1、igf-ii)和转化生长因子(如tgf-β)、透明质酸、硫酸软骨素、dna质粒和mrna。
[0032]
这些用途和应用是利用本发明的双重交联胶原蛋白填充剂的特性，不应被解释为它的用途仅局限于此。
4.具体实施方式
[0033]
实施例1：胶原蛋白纤维的双重交联
[0034]
取一定体积的胶原溶液purecol(牛源，advanced biomatrix，美国)，用10mm hcl稀释至2mg/ml。加入1/10倍体积的0.2mna2hpo4(ph 11.2)溶液，混匀后室温下(20-25℃)放置过夜，离心收集胶原纤维沉淀。在纤维沉淀中加入0.3倍体积的3％d-核糖-磷酸盐缓冲液(pbs)溶液，调整溶液为ph7.0，震动悬浮，30℃下密封育温7天。离心收集沉淀，即得核糖交联胶原纤维。然后在核糖交联胶原纤维中加0.3倍体积5mg/ml n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)-50mm吗啉乙磺酸缓冲液(mes)及0.03倍体积5％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)-50mm吗啉乙磺酸缓冲液(mes)，溶液ph 5.5，震动悬浮，室温放置过夜。离心收集胶原纤维沉淀，即得双重交联胶原纤维，密封，4℃保存。
[0035]
实施例2：双重交联胶原蛋白纤维热稳定性测定
[0036]
利用差示扫描量热仪(dsc)方法测定实施例1制备的双重交联胶原纤维的热稳定性。对照组为没有进行任何交联的胶原纤维，核糖交联组为仅利用核糖交联处理过的胶原纤维。将实施例1中离心收集的胶原纤维、核糖交联胶原纤维和双重交联胶原纤维样品分别转入dsc测试铝坩埚中，然后封置于差示扫描量热仪(耐驰科学仪器商贸有限公司，型号：dsc 214)中，氮气气氛下，2℃/min升温温度，流速60ml/min，在升温范围4℃至75℃条件下进行扫描测定。
[0037]
检测数据见表1，结果显示双重交联组的热稳定性明显好于核糖交联组和对照组。
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表1：温度变化对各种胶原纤维稳定性的影响
[0039]
组别熔点 单位：℃对照组(未交联胶原纤维)49.2℃核糖交联组57.0℃核糖和edc双重交联组66.6℃
[0040]
实施例3：胶原蛋白纤维在乙醇溶液中双重交联
[0041]
取一定体积的胶原溶液purecol(牛源，advanced biomatrix，美国)，用10mm hcl稀释至2mg/ml。加入1/10倍体积的0.2mna2hpo4(ph 11.2)溶液，混匀后室温下(20-25℃)放置过夜，离心收集胶原纤维沉淀。在纤维沉淀中加入0.3倍体积的3％d-核糖-磷酸盐缓冲液(pbs)溶液，调整溶液为ph7.0，震动悬浮，30℃下密封育温7天，离心收集沉淀，得核糖交联胶原纤维。然后在前述沉淀中加入0.15倍的无水乙醇混匀，再加入0.02倍的10mg/ml n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)生理盐水溶液及0.02倍的10mg/ml 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)生理盐水溶液，混匀，室温放置过夜。离心收集沉淀，即得双重交联胶原纤维沉淀，密封，4℃保存。
[0042]
实施例4：双重交联胶原蛋白填充剂制备
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将实施例3制备的双重交联胶原蛋白纤维样品，装入低温球磨仪(上海净信，冷冻研磨仪，型号jxfstprp-cl)样品研磨罐中，在液氮冷冻的条件下，设定频率为60hz，启动运行冷冻球磨机3分钟，然后取出研磨罐，加入生理盐水将胶原蛋白纤维浓度调节为35mg/ml，再将调节好浓度的溶液分装于1毫升规格的针管中，密封，4℃保存。
[0044]
上面结合具体实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式。属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则仍为本发明的保护范围。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更，但是依据本发明的技术实质对本发明所作的任何修改、等同变化与改型，仍属于本发明的保护范围。
再多了解一些
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