宝藿苷I在制备治疗类风湿关节炎以及骨质疏松药物中的应用及药物

宝藿苷i在制备治疗类风湿关节炎以及骨质疏松药物中的应用及药物
技术领域
1.本发明涉及中药技术领域，具体涉及宝藿苷i在制备治疗类风湿关节炎以及骨质疏松药物中的应用及药物。


背景技术：

2.骨质疏松症(osteoporosis,op)是最常见的骨骼疾病,是一种以骨量低、骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病。随着人口老龄化日趋严重，骨质疏松症已成为我国面临的重要公共健康问题。我国50岁以上人群骨质疏松症患病率女性为20.7％，男性为14.4％。据估算2006年我国骨质疏松症患者近7000万，骨量减少者已超过2亿人，抑制骨吸收和促进骨形成是临床上用来预防和治疗骨质疏松症的主要治疗措施。
3.类风湿关节炎(ra)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，严重的患者还会出现关节结构的破坏与变形，甚至引起其他脏器的损伤。目前类风湿关节炎治疗的主要目的在于减轻关节炎症反应，治疗药物包括非甾体抗炎药、抗风湿药以及糖皮质激素等。
4.宝藿苷i aucubin，cas号：113558-15-9，分子式：c
27h30o10
，分子量：514.52。宝藿苷i是从朝鲜淫羊藿中得到的黄酮类化合物，具有诱导凋亡，抗肿瘤活性的功能，但其在治疗类风湿关节炎以及骨质疏松相关药物中的应用却少有报道。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了宝藿苷i在制备治疗类风湿关节炎以及骨质疏松药物中的应用及药物，本发明所述的宝藿苷i通过抑制nf-kb信号通路以及调节自噬体系抑制破骨分化，用以治疗类风湿关节炎以及骨质疏松。
6.第一方面，本发明提供了宝藿苷i在制备治疗类风湿关节炎以及骨质疏松药物中的应用。
7.本发明所述的宝藿苷i在制备治疗类风湿关节炎以及骨质疏松药物中的应用的机理具体为通过抑制nf-kb信号通路以及调节自噬体系抑制破骨分化，破骨分化过度激活在骨质疏松和类风湿性关节炎的发病过程中均起着重要的作用，选用宝藿苷i可以通过自噬调控关节炎性反应从而抑制破骨分化，治疗骨质疏松。
8.第二方面，本发明提供了一种治疗类风湿关节炎以及骨质疏松的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括宝藿苷i，所述宝藿苷i在所述药物中的浓度为0.5～5μm，所述宝藿苷i在0.5～5μm浓度范围内有抑制破骨分化的作用。
9.优选的，所述宝藿苷i在所述药物中的浓度为5μm。
10.进一步的，所述药物还包括药学上可接受的辅料；优选的，所述辅料包括稀释剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、防腐剂、增溶剂、矫味剂以及润滑剂中的一种或多种。
11.进一步优选的，所述稀释剂包括淀粉、蔗糖、糊精、乳糖、无机盐类、微晶纤维素、甘
露醇中的一种或者多种；
12.所述润湿剂包括水、乙醇中的一种或者多种；
13.所述粘合剂包括淀粉浆、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚维酮、明胶、羟丙基纤维素、甲基纤维素中的一种或者多种；
14.所述崩解剂包括干淀粉、交联聚维酮、柠檬酸、低取代羟丙基纤维素中的一种或者多种；
15.所述防腐剂包括苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、苯扎溴铵、甘油中的一种或者多种；
16.所述增溶剂包括聚山梨酯类、聚氧乙烯脂肪酸酯类中的一种或者多种；
17.所述矫味剂包括蔗糖、单糖浆、橙皮糖浆、桂皮糖浆、糖精钠、甘露醇、山梨醇中的一种或者多种；
18.所述润滑剂包括滑石粉、氢化植物油、微粉硅胶、硬脂酸镁、聚乙二醇类中的一种或者多种。
19.进一步的，所述药物的剂型为液体制剂，所述液体制剂是由如下配方的原料药制成的：宝霍苷i 20份，山梨醇300份，山梨酸钾800份以及20份灭菌水。
20.进一步的，所述药物的剂型为片剂，所述片剂是由如下配方的原料药制成的：宝霍苷i 20份，淀粉3份，蔗糖2份，糊精2份以及甘露醇500份。
21.进一步的，所述药物的剂型为注射剂，所述注射剂是由如下配方的原料药制成的：宝霍苷i 20份，乳酸5份，乳糖8份，甘氨酸5.5份，甘露醇5份以及灭菌注射用生理盐水50份。
22.与现有技术相比，本发明有以下优点：
23.本发明淫羊藿提取物宝藿苷i，具有显著抑制raw264.7细胞向破骨细胞分化从而抑制骨吸收、治疗骨质疏松的作用，细胞实验上，通过鬼笔环肽、trap染色和qpcr检测验证其功能；动物实验上通过组织染色和micro-ct检查验证其功能。同时，本发明淫羊藿提取物宝藿苷i，具有显著抗炎作用、抑制破骨细胞分化，可改善类风湿性关节炎导致的骨吸收，有治疗类风湿关节炎的功能。作为中药单体，本发明为宝藿苷i制剂开发了新的用途，而作为一个有效的类风湿关节炎以及骨质疏松治疗方案，本发明对治疗类风湿关节炎以及骨质疏松具有重要意义，为促进骨形成、抑制关节炎症的临床治疗提供了新思路。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为cck-8法检测宝藿苷i对raw264.7细胞的细胞毒性结果图；
26.图2为鬼笔环肽和trap染色染色法检测宝藿苷i抑制破骨分化能力的结果图；
27.图3为qpcr验证宝藿苷i调控骨吸收相关基因的结果图，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001；
28.图4为荧光素酶实验验证宝霍苷i对nf-kb信号通路的影响；
29.图5为western blotting验证宝霍苷i对破骨分化过程中自噬相关蛋白表达量的
影响；
30.图6为小鼠卵巢去势模型腹腔注射宝霍苷i后通过micro-ct观察骨量变化情况结果图。
具体实施方式
31.下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。
32.实验材料：宝霍苷i购于上海源叶生物科技有限公司；胎牛血清(fbs)、dmem、α-mem培养基购自gibco，二甲基亚砜(dmso)购自sigma，cck-8购自碧云天；rankl购于r&d；4％中性甲醛、0.25％磷酸蛋白酶购于北京索莱宝科技有限公司；trap染色试剂盒购于cosmo bio；罗丹明标记鬼笔环肽购于biorigin；trizol购自索莱宝公司、primescript
tm
rt master mix、premix ex taq
tm
ii和无rna酶水购自大连takara公司；ripa细胞裂解液、蛋白酶磷酸酶抑制剂、pmsf购于碧云天；bca试剂盒购于赛默飞公司；5
×
sds蛋白上样缓冲液购于索莱宝；抗体购于cst；ecl发光液购于新赛美；电泳、转膜设备、配胶试剂盒为bio-rad。
33.荧光素酶检测试剂盒制备包含活性成分的所述药物，所述药用辅料包括药学上可接受的无毒稀释剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、防腐剂、增溶剂、矫味剂或润滑剂，所述药物的活性成分包括宝霍苷i。下面将结合具体实施例描述具体步骤。
34.实施例1
35.一种治疗类风湿关节炎以及骨质疏松的液体制剂，其具体步骤如下：
36.按如下配方称取液体制剂组分：宝霍苷i 20mg，山梨醇300mg，山梨酸钾800mg，20ml灭菌水。按常规工艺进行所述液体制剂的制备。
37.实施例2
38.一种治疗类风湿关节炎以及骨质疏松的片剂，其具体步骤如下：
39.按如下配方称取片剂组分：宝霍苷i 20mg，淀粉3g，蔗糖2g，糊精2g，甘露醇500mg。按常规工艺进行所述片剂的制备。
40.实施例3
41.一种治疗类风湿关节炎以及骨质疏松的注射剂，其具体步骤如下：
42.按如下配方称取注射剂组分：宝霍苷i 20mg，乳酸5mg，乳糖8mg，甘氨酸5.5mg，甘露醇5mg，灭菌注射用生理盐水50ml。按常规工艺进行所述注射剂的制备。
43.实施例4
44.本实施例为宝霍苷i对raw264.7细胞增殖能力的影响：
45.用含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素及10％胎牛血清(gibco)的dmem(gibco)培养基培养raw264.7细胞，置于37℃、5％co2的温箱中孵育，换液周期为2天/次，待细胞扩增后种于96孔版中，每孔10000个细胞。将溶解于dmso中的宝霍苷i配成不同工作浓度加入培养基中以此验证不同浓度的宝霍苷i对raw264.7细胞增殖的影响。种板24小时后，每组加入0～120μm宝霍苷i，每组3个复孔。待宝霍苷i分别处理24、48、72小时后，每孔加入10μl cck-8溶液孵育4小时用酶标仪检测od值。实验设有空白组。随即按照下列公式计算细胞存活率：
细胞存活率＝[(od实验孔-od空白孔)/(od对照孔-od空白孔)]
×
100％。如图1所示，结果表明，在所述浓度范围内，宝霍苷i既无明显促进raw264.7细胞增殖的能力也无明显抑制raw264.7细胞增殖的能力。
[0046]
实施例5
[0047]
本实施例为研究宝霍苷i对raw264.7细胞破骨分化能力的影响：
[0048]
用含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素及10％胎牛血清(gibco)的dmem(gibco)培养基培养raw264.7细胞，置于37℃、5％co2的温箱中孵育，换液周期为2天/次，待细胞扩增后种于6孔版中，每孔50000个细胞。将溶解于dmso中的宝霍苷i配成不同工作浓度加入破骨诱导培养基中以此验证不同浓度的宝霍苷i对raw264.7细胞分化的影响。破骨诱导培养基为含有50ng/mlrankl、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素及10％胎牛血清(gibco)的α-mem(gibco)培养基。实验设有对照组。在诱导分化的第5天，去除培养基，予pbs洗涤3次，4％中性甲醛固定，按trap染色试剂盒说明书染色，细胞核大于3即为阳性细胞。在诱导分化的第5天，去除培养基，予pbs洗涤3次，4％中性甲醛固定，按罗丹明标记鬼笔环肽说明书对破骨细胞肌动蛋白环进行染色。实验结果分别如图2a和图2b所示，阳性细胞在给药组的个数显著减少，其中5μm最为明显；破骨细胞的肌动蛋白环随着给药浓度增加周长显著减少，其中5μm最为明显。结果表明，宝霍苷i可明显抑制raw264.7细胞破骨分化。
[0049]
实施例6
[0050]
本实施例为通过rt-qpcr检测宝霍苷i对骨吸收相关基因表达水平的影响：
[0051]
以每孔50000个细胞的密度种于6孔板中，待细胞贴壁后予含有不同浓度宝霍苷i的破骨培养基持续处理，换液周期为2天/次。破骨诱导培养基为含有50ng/mlrankl、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素及10％胎牛血清(gibco)的α-mem(gibco)培养基。培养3天后每孔pbs洗涤2次，加入1mltrizol提取rna并转移至1.5mlep管中，冰上静置10min后每管加入200μl氯仿，涡旋震荡后静置10min。4℃，12000g，离心15min，于新的ep管中加入500μl异丙醇，小心将离心后上清液转移至异丙醇中，上下颠倒混匀后室温静置10min。4℃，12000g，离心10min，弃上清，管底沉淀即为所提rna，加入1ml 75％乙醇，轻轻上下颠倒，4℃，7500g，离心5min，弃上清，4℃，7500g，离心5min。室温晾干样品，加入适量rnase-free water溶解沉淀的rna，取1μlrna样本测定浓度后按3000ng，60μl配制逆转录反应体系，混匀并瞬时离心，放入pcr机，按takara逆转录说明书设置反应程序，最后生成cdna。按照takara说明书配制qpcr反应体系，通过qpcr仪得到ct值，根据2
‑△△
ct法计算各成骨吸收相关基因trap、mafb、kdm6a、annexina2以及ezh2的相对表达量。计量资料用均数
±
标准差表示，采用spss16.0软件行anova方差分析并以lsd-t检验进行组间比较，p《0.05可认为具有统计学意义。实验结果如图3所示，宝霍苷i组相比对照组，骨吸收相关基因trap、mafb、kdm6a、annexina2以及ezh2的表达水平显著升高。
[0052]
实施例7
[0053]
本实施例为通过western blotting检测宝霍苷i对自噬相关蛋白表达水平的影响：
[0054]
以每孔50000个细胞的密度种于6孔板中，待细胞贴壁后予含有不同浓度宝霍苷i的破骨培养基持续处理，换液周期为2天/次。破骨诱导培养基为含有50ng/mlrankl、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素及10％胎牛血清(gibco)的α-mem(gibco)培养基。给药4天后每孔
pbs洗涤2次，用细胞刮子将细胞刮下，加入200μl含pmsf和蛋白酶磷酸酶抑制剂的ripa细胞裂解液冰上裂解细胞10min，转移至1.5mlep管中，4℃12000g，离心30min后取上清为蛋白。按bca试剂盒说明书检测所提蛋白浓度，加入适量含pmsf和蛋白酶磷酸酶抑制剂的ripa平衡各样本蛋白浓度，加入适量5
×
sds蛋白上样缓冲液，100℃煮5min。根据配胶试剂盒说明书配制电泳所需的凝胶，用上样器将蛋白转移至孔中，固定好胶板于电泳槽中，加入电泳液，100伏电压下电泳，待样本跑至合适位置后取出胶板，用三明治夹板将pvdf膜和凝胶固定于转膜槽中，加入电转液200ma转膜2小时后取出pvdf膜。用脱脂牛奶配制5％封闭液，封闭pvdf膜1小时。以一抗稀释液1：1000稀释一抗后于4℃孵育pvdf膜过夜。tbst洗3次，每次10min，4℃二抗孵育1小时，tbst洗3次，每次10min。按1：1体积配制发光液，用bio-rad显影仪进行显影，并用image j定量计算。计量资料用均数
±
标准差表示，采用spss16.0软件行anova方差分析并以lsd-t检验进行组间比较，p《0.05可认为具有统计学意义。实验结果如图5所示，破骨分化过程中，自噬水平受到抑制。
[0055]
实施例8
[0056]
本实施例为验证宝霍苷i对c57bl/6卵巢去势小鼠骨量变化情况的影响：
[0057]
c57bl/6小鼠卵巢去势模型制作：取12周成年健康雌性c57bl/6小鼠，体重25g左右，适应性饲养7d后随机分组法分为4组：假手术组、阴性对照组、阳性对照组以及给药组，每组5只，作卵巢去势模型。在造模12周后各组分别予以等体积生理盐水、阿伦磷酸钠(100μg/kg)、宝霍苷i(0.54mg/kg)进行腹腔注射，2天/次，注射12周后分别处死各组c57bl/6小鼠，取股骨予micro-ct检测，松质骨三维重建图以及骨微结构相关数值结果如图6所示，宝霍苷i组对比对照组，bmd、tb.th、tb.n显著上升，tb.sp显著下降，结果有统计学意义。计量资料用均数
±
标准差表示，采用spss16.0软件行anova方差分析并以lsd-t检验进行组间比较，p《0.05可认为具有统计学意义。结果表明，宝霍苷i能促进抑制骨吸收，从而治疗骨质疏松。
[0058]
本发明中宝藿苷i治疗骨质疏松的机理主要为所述药物抑制nf-kb信号通路(图4)、调节自噬体系抑制破骨分化(图5)，治疗骨质疏松。其中，自噬的发生分为如下四个阶段：自噬的起始
→
隔离膜和自噬体的形成
→
自噬体与溶酶体融合
→
自噬体的裂解。本发明具体为检测自噬相关蛋白mtor、lc3b、beclin1和p62的表达量。其中，mtor为自噬的起始相关蛋白；lc3b为贯穿整个自噬过程的自噬标志物；beclin1参与自噬体形成；p62作为一种自噬特异性底物用于检测自噬的下游。
[0059]
而且，本发明所述的宝藿苷i在所述浓度范围内(0.5～5μm)，对骨质疏松的治疗有影响。在0.5～5μm浓度范围内有抑制破骨分化的作用，破骨相关染色如图2所示，破骨分化相关基因表达量如图3所示，最佳浓度为5μm。如图6所示，以最佳浓度换算至动物剂量，对小鼠制作卵巢去势动物模型，在所述浓度范围内宝霍苷i有治疗骨质疏松作用。如图2、图3所示，宝霍苷i低浓度(0.5μm)时，对破骨分化的作用不明显；如图1所示，宝霍苷高浓度抑制细胞活性(40μm)。
[0060]
本发明所述中药单体淫羊藿提取物宝藿苷i具有的有益效果为：显著抑制raw264.7细胞向破骨细胞分化、抑制骨吸收、治疗骨质疏松。同时，本发明淫羊藿提取物宝藿苷i，具有显著抗炎作用、有治疗类风湿关节炎的功能。以宝藿苷i为活性成分制备的抑制骨吸收、骨关节炎症的药物，不仅为宝藿苷i开发了新的用途，同时也为类风湿关节炎以及
骨质疏松患者提供了新的治疗药物，具有非常好的开发应用前景。
[0061]
以上借助具体实施例对本发明做了进一步描述，但是应该理解的是，这里具体的描述，不应理解为对本发明的实质和范围的限定，本领域内的普通技术人员在阅读本说明书后对上述实施例做出的各种修改，都属于本发明所保护的范围。