一种帕拉米韦起始物料及杂质的分析方法与流程

1.本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种帕拉米韦起始物料及杂质的分析方法。


背景技术：

2.帕拉米韦是一种新型的抗流感病毒药物，属神经氨酸酶抑制剂，现有临床试验证明对甲型和乙型流感有效。根据世界卫生组织的通报，h7n9属于甲型流感病毒亚型，初步试验结果显示，神经氨酸酶抑制剂或许会对该病毒起作用。(3ar,4r,6s,6as)-4-[叔丁氧羰基氨基]-3-(1-乙基丙基)-3a,5,6,6a-四氢-4h-环戊并[d]异恶唑-6-羧酸甲酯为合成帕拉米韦的起始物料，其分子式为：c
18h30
n2o5，分子量为354.44，结构式为
[0003]
帕拉米韦起始物料中易存在以下杂质：杂质a：2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，分子式为c6h7no，分子量为109.13，结构式为杂质b：(1s,4r)-4-氨基环戊-2-烯烃-1-羧酸甲酯的l-酒石酸盐，分子式为c
11h14
no8，分子量为291.26，结构式为杂质c：(1s,4r)-4-氨基环戊-2-烯-1-羧酸，分子式为c6h9no2，分子量为127.14，结构式为杂质d：(1s,4r)-4-((叔丁氧羰基)氨基)环戊-2-烯-1-羧酸的l-酒石酸盐，分子式为c
15h23
no
10
，分子量为377.35，结构式为
[0004]
杂质a为合成帕拉米韦起始物料的一个原料；杂质b为杂质a与甲醇开环，后用l-酒石酸拆分所得；杂质c为杂质b未被甲酯化的杂质；杂质d为boc保护氨基后的脱甲基杂质。这四种杂质的极性较大，分离较为困难，现有技术中未见对上述起始物料及杂质进行检测分析的报道。因此，开发一种检测灵敏度高、专属性强，能有效分离帕拉米韦起始物料与杂质a、杂质b、杂质c、杂质d的分析方法显得尤为重要。


技术实现要素：

[0005]
为解决上述问题，本发明提供了一种帕拉米韦起始物料及杂质的分析方法，使用该分析方法能实现帕拉米韦起始物料与各杂质的有效检测分离，该分析方法高效准确、专属性强，检测灵敏度高、分离度好并且检测限及定量限低，为帕拉米韦起始物料的质量研究提供了方法，适合有关物质的控制和杂质研究。
[0006]
本发明提供如下技术方案：
[0007]
一种帕拉米韦起始物料及杂质的分析方法，其采用氰基色谱柱，以磷酸二氢钾溶液为流动相a，甲醇或乙腈为流动相b，流动相b的起始体积分数为15％～25％，进行梯度洗脱，对帕拉米韦起始物料及杂质进行高效液相色谱分析。
[0008]
在一些实施方案中，帕拉米韦起始物料为杂质为杂质a：杂质b：杂质c：杂质d：
[0009]
在一些实施方案中，流动相a磷酸二氢钾溶液的ph为3～7，流动相b为乙腈。优选地，流动相a磷酸二氢钾溶液的ph为4.5。
[0010]
在一些实施方案中，分析方法采用紫外检测器，柱温为30℃～40℃，检测波长为200nm～220nm。
[0011]
在一些优选实施方案中，柱温为35℃，检测波长为210nm。
[0012]
在一些实施方案中，流动相的流速为0.7～1.0ml/min。
[0013]
在一些实施方案中，梯度洗脱的程序为：
[0014]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)075～8515～25875～8515～25920～3070～801520～3070～80
[0015]
在一些实施方案中，梯度洗脱的程序为：
[0016]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)080208802092575152575
[0017]
在一些实施方案中，梯度洗脱的程序为：
[0018][0019][0020]
柱温为35℃，流动相的流速为0.8ml/min。
[0021]
在一些实施方案中，色谱柱规格为：内径4.0～5.0mm，长度100～250mm，填料粒径2～6μm；进样量为5～50μl，优选20μl。
[0022]
在一些实施方案中，分析方法包括供试品溶液配制：取帕拉米韦起始物料供试品，用稀释液溶解并稀释，作为供试品溶液，其中稀释液为乙腈水溶液。
[0023]
在一些实施方案中，该分析方法包括：分别取杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、帕拉米韦起始物料适量，加适量乙腈溶解，然后用乙腈:水＝10:90(v/v)稀释，得到各定位溶液；取杂质a、杂质b、杂质c、杂质d和帕拉米韦起始物料，用乙腈:水＝10:90(v/v)溶解并稀释，得到系统测试液；使用氰基色谱柱和紫外检测器，以磷酸二氢钾溶液为流动相a，乙腈为流动相b，分别取20μl空白溶液(诸如乙腈水溶液的稀释液)、各定位溶液和系统测试液，以梯度洗脱进行色谱分析；分别按照杂质外标法计算各杂质的含量。
[0024]
在一些实施方案中，所得系统测试液中帕拉米韦起始物料浓度为2mg/ml，杂质a浓度为3μg/ml，杂质b浓度为3μg/ml，杂质c浓度为3μg/ml，杂质d浓度为3μg/ml。
[0025]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明选择氰基色谱柱，该色谱柱对样品成分保留能力强，峰形好。本方法专属性强：空白溶液对检测无干扰；帕拉米韦起始物料与杂质蜂之间的分离度基本均远大于1.5。对帕拉米韦起始物料及杂质的检测限(信噪比3:
1)均低于0.08μg/ml；对帕拉米韦起始物料及杂质的定量限(信噪比10:1)均低于0.33μg/ml。本发明的方法空白无干扰、专属性好，可以较好的应用于帕拉米韦起始物料的杂质控制。该方法能有效地检测并分离上述帕拉米韦起始物料与杂质a、杂质b、杂质c、杂质d，灵敏度高；并且操作简便、分析时间较短，可实现帕拉米韦起始物料及杂质的检测分析。
附图说明
[0026]
图1为本发明实施例1中空白溶液的高效液相色谱图；
[0027]
图2为本发明实施例1中帕拉米韦起始物料系统测试液的高效液相色谱图，按出峰时间先后顺序依次为：杂质c、杂质a、杂质b、杂质d、帕拉米韦起始物料；
[0028]
图3为本发明实施例3中帕拉米韦起始物料供试品溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
[0029]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细描述。除非另有说明，否则以下实施例中所用的试剂、材料及仪器均可通过常规商业手段获得。且应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本技术的范围并不受这些实施方式的限定，乃以申请专利的范围为准。
[0030]
实施例1专属性试验
[0031]
仪器：高效液相色谱仪
[0032]
色谱柱：xb-cn(氰基色谱柱)，4.6
×
250mm，5μm
[0033]
柱温：35℃
[0034]
流动相a：0.005mol/l磷酸二氢钾(用磷酸调节至ph 4.5)，流动相b：乙腈，按表1进行梯度洗脱
[0035]
检测波长：210nm
[0036]
流速：0.8ml/min
[0037]
进样量：20μl
[0038]
表1梯度洗脱程序
[0039]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)08020880209257515257515.18020238020
[0040]
稀释液(空白溶液)：乙腈:水＝10:90(v/v)。
[0041]
定位溶液配制：取帕拉米韦起始物料适量、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d，先加适量乙腈溶解后，用乙腈:水＝10:90(v/v)稀释，得到帕拉米韦起始物料和杂质a、杂质b、杂质c、杂质d浓度为分别为2mg/ml和0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.02mg/ml的定位溶液。
[0042]
系统测试液配制：取帕拉米韦起始物料、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d适量，用乙腈:水＝10:90(v/v)溶解并稀释，得到帕拉米韦起始物料浓度为2mg/ml，杂质a浓度为3μg/ml，
杂质b浓度为3μg/ml，杂质c浓度为3μg/ml，杂质d浓度为3μg/ml的帕拉米韦起始物料系统测试液。
[0043]
上述配制过程使用的乙腈:水＝10:90(v/v)为稀释液，可以替换为其他适合的溶剂，如低体积分数的甲醇水溶液或其他低体积分数的乙腈水溶液。
[0044]
样品测定：分别量取空白溶液、定位溶液及系统测试液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。空白溶液色谱图见图1，帕拉米韦起始物料系统测试液色谱图见图2。各化合物保留时间及分离度见表2。
[0045]
表2帕拉米韦起始物料及杂质专属性试验结果
[0046][0047]
结论：空白溶液对检测无干扰；该色谱条件下，帕拉米韦起始物料与杂质a、杂质b、杂质c、杂质d可较好分离，分离度基本都远大于1.5，符合药典标准，因而该方法专属性强。
[0048]
实施例2检测限与定量限试验
[0049]
取各杂质对照品适量，精密称定，用乙腈:水＝10:90(v/v)溶解并逐级稀释。按实施例1的色谱条件，分别进样，信噪比3:1时的样品浓度为检测限浓度。结果如下：杂质a的检测限为0.03μg/ml、杂质b的检测限为0.08μg/ml、杂质c的检测限为0.06μg/ml、杂质d的检测限为0.05μg/ml。
[0050]
取各杂质对照品适量，精密称定，用乙腈:水＝10:90(v/v)溶解并逐级稀释。按实施例1的色谱条件，分别进样，信噪比10:1时的样品浓度为定量限浓度。结果如下：杂质a的定量限为0.12μg/ml、杂质b的定量限为0.33μg/ml、杂质c的定量限为0.23μg/ml、杂质d的定量限为0.19μg/ml。
[0051]
结论：在低于0.08μg/ml的检测限及低于0.33μg/ml的定量限下，能够很好地检测出各帕拉米韦起始物料相关杂质，有助于后续产品的质量控制和收率提高。
[0052]
在对色谱条件分别进行上述微小改变，如流动相b的起始体积分数为15％～25％；柱温为33℃-37℃，甚至是30℃-40℃；检测波长为205nm-215nm，甚至是200nm-220nm；流速为0.7ml/min-1.0ml/min时，分离度均远大于1.5，符合要求，因而该方法耐用性良好。
[0053]
实施例3实际样品检测
[0054]
供试品溶液配制：取帕拉米韦起始物料供试品适量，精密称定，先加乙腈溶解，再用乙腈:水＝10:90(v/v)溶解并稀释，配制成浓度为2mg/ml的供试品溶液。如上所述，配制6
个不同批次的供试品溶液作为样品溶液；每批样品平行配制2份，取平均值报告。
[0055]
杂质对照溶液配制：取杂质a、杂质b、杂质c、杂质d适量，用乙腈:水＝10:90(v/v)溶解并稀释，得到杂质a浓度为3μg/ml、杂质b浓度为3μg/ml、杂质c浓度为3μg/ml、杂质d浓度为3μg/ml的杂质对照溶液。
[0056]
精密量取供试品溶液、杂质对照溶液各20μl，注入色谱仪，按实施例1的色谱条件，对供试品溶液进行色谱分析。按照杂质外标法计算帕拉米韦起始物料中各杂质。结果见表3及见图3。
[0057]
表3供试品溶液检测结果
[0058]
样品名称杂质a(％)杂质c(％)杂质b(％)杂质d(％)样品溶液1未检出未检出未检出未检出样品溶液2未检出未检出未检出未检出样品溶液3未检出未检出未检出未检出样品溶液4未检出未检出未检出未检出样品溶液5未检出未检出0.02未检出样品溶液6未检出未检出未检出未检出
[0059]
结论：所配制的6个不同批次的帕拉米韦起始物料供试品溶液中，只有样品溶液5中检测出了微量的杂质b，其他均不含有上述杂质。本发明的方法空白无干扰、专属性好，可以较好的应用于帕拉米韦起始物料的杂质控制。
[0060]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节；而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。