一种用于棉花幼茎空间转录组学分析的冷冻切片技术

1.本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法。


背景技术：

2.棉花是天然棉纤维的来源，是我国重要的经济作物。由大丽轮枝菌(verticillium dahilae)和黑白轮枝菌(verticillium albo-atrum)引起的棉花黄萎病是是限制棉花产量的主要病害，主要是危害维管束和叶片，进而影响棉桃的发育。棉花黄萎病菌在导管中进行营养生长和生殖生长，产生大量的分生孢子随导管扩展到全株。因此，解析棉花对黄萎病菌侵染和增殖的基因应答，对于挖掘抗病基因和感病基因至关重要。棉花茎杆的空间基因表达模式分析有助于解析棉花感知病原菌、信号传递、抗性基因表达的鉴定。但由于从组织上原位获取单个细胞用于转录组分析的技术很难实现，限制了我们对三维空间上基因的表达模式调控病原菌入侵的机制的认知。激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection，lcm)、荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting,facs)和特定细胞类型的核标记分离(isolation of nuclei tagged in specific cell types，intact)是目前研究植物全组织单细胞分辨率的主要方法。lcm需要进行显微镜下标记后再进行切割，收集后用于rna-seq，在分析组织切片整体基因表达情况时，需要进行大面积切割，耗时耗力，并且存在主观选择的偏差。facs和intact需要解离单细胞，使细胞失去原有的位置信息。因此，利用空间转录组技术解析基因空间表达信息更为合适。
3.植物组织切片最初是用于观察组织结构，随后发现和其他技术的连用可用于检测细胞水平的转录、代谢等细胞活性。植物组织切片包括半薄切片、石蜡切片、冰冻切片等技术，相比其他方法，冰冻切片制片周期短、对样本的损伤较小，能最大程度保证细胞的真实状态，对于分析细胞水平的转录、代谢变化，具有较大优势。
4.空间转录组能从细胞水平上的呈现完整个体或者器官的基因表达的动态。组织系统由不同的细胞亚群组成，它们在特定组织中的空间位置与它们的功能紧密交织在一起。组织特异性基因表达定义了它们独特的生物学作用，而富集的表达基因通常在维持组织或细胞特异性功能方面发挥作用。识别细胞/组织中的转录组及其调控是破译基因的细胞/组织特异性功能的关键。
5.空间转录组在研究人类疾病中已经广泛应用，成功解析肿瘤、肌肉缩侧索硬化、关节炎、阿尔兹海默症等发病过程中，不同结构的空间基因表达模式的差异。但是在植物方面的应用较难，与哺乳动物组织相比，植物组织及细胞面临着许多特殊的挑战，包括植物细胞壁、液泡、叶绿体和次生代谢物，使得植物组织硬度、脆度增强、含水量增加，这些特性需要与哺乳动物组织相比有很大不同的操作程序，并且通常需要针对物种或组织进行特定的优化。在进行空间转录组学分析时，冷冻切片的制作是最重要，也是最基础的一环。组织切片的质量和完整性直接决定了空间转录组数据的准确性。
6.现有技术公开的组织冰冻切片方法经过液氮速冻后的棉花茎杆脆性增加，经包埋
后切片效果不理想，茎杆冰冻切片中局部出现细胞裂解，切片完整性丧失，细胞受损会造成内含物外流，rna含量受损。目前关于用于空间转录组学分析的植物组织冰冻切片的方法尚未完善，所以没有成熟的技术体系来制备用于棉花茎杆组织空间转录组学分析的冰冻切片制备方法。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于克服上述技术问题，提供一种细胞结构清晰完整的组织切片，避免了细胞结构的损害和成分的流失，且可用于空间转录组学分析的冰冻切片方法。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
9.一种用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法，所述的方法包括以下步骤：
10.s101样品处理和包埋：
11.取棉花茎杆，将其裁成片段，用去离子水洗净，吸干水分；
12.将冰上预冷后的oct包埋剂注入包埋盒；
13.确认组织切片方向，将棉花茎杆放入装有oct包埋剂的包埋盒中，再用oct包埋剂覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡；
14.立即将包埋盒放在干冰或-80℃冰箱中，至oct包埋剂完全冻结；
15.s102：冰冻切片机预冷：
16.冰冻切片机冷冻箱温度设置-20℃，速冻台温度设置-20℃；
17.s103冷冻切片：
18.在样品台上添加oct包埋剂打底，将包埋好的棉花茎杆放在样品托上，再将其转移至已经预冷到-20℃的速冻台上静置，样品固定到样品托持承器上固定切片。
19.s104制片：
20.将切片平展于速冻台上，调整切片的角度后切片，收集符合要求的切片。。
21.进一步的，步骤s101所述的棉花茎杆为生长两周的棉花茎杆。
22.进一步的，步骤s101所述的oct包埋剂为tissuetek o.c.t.compound，vwr，25608-930；
23.进一步的，步骤s101所述的oct包埋剂添加量≤包埋盒体积的1/3。
24.步骤s101所述的包埋剂完全冻结后，透过oct包埋剂有棉花茎杆组织裸露未完全包埋，则继续添加oct包埋剂，直至oct包埋剂完全包埋棉花茎杆组织。
25.进一步的，步骤s103所述的包埋好的棉花茎杆上样品托之前修剪，去除多余oct包埋剂。
26.进一步的，步骤s103所述静置时间为10
±
2min。
27.进一步的，步骤s104所述切片时，先将切片厚度设置为60μm，快速切除掉包埋块和多余的组织，在切面接近需收集样品时，将切片厚度设置为10μm切片，观察样本的切片轮廓，符合要求后收集样本切片。
28.进一步的，步骤s104所述切片后，将切片贴在组织优化玻片的捕获区内，将手指抵在玻片捕获区背面，使oct包埋剂快速融化，切片粘附于玻片上。
29.本发明还提供一种用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法的用途。
30.一种用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法，所得切片用于空间转录组学分
析。
31.本发明提供的一种用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法，取新鲜材料直接包埋后切片，得到细胞结构清晰完整的组织切片，避免了细胞结构的损害和成分的流失，是一种最为简便且效果良好的切片方式，适合作为用于空间转录组学分析中的棉花幼茎冰冻切片方法。
32.本发明提供的一种用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法，为棉花幼茎的组织空间转录组学分析提供技术基础。
33.与现有技术相比，本发明提供的一种用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法的优点：
34.(1)组织切片细胞结构清晰完整。
35.(2)为棉花幼茎的组织空间转录组学分析提供技术基础。
附图说明
36.图1是本发明实施1获得的棉花幼茎冰冻切片的he染色成像(其中，左图为棉花幼茎纵切面，右图为棉花幼茎横切面)。
37.图2是本发明实施2获得的棉花茎尖冰冻切片的he染色成像
38.图3是本发明实施3获得的棉花茎冰冻切片的成像。
具体实施方式
39.为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。
40.一种用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法，所述的方法包括以下步骤：
41.s101样品处理和包埋：
42.取棉花茎杆，将其裁成片段，用去离子水洗净，吸干水分；
43.将冰上预冷后的oct包埋剂注入包埋盒；
44.确认组织切片方向，将棉花茎杆放入装有oct包埋剂的包埋盒中，再用oct包埋剂覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡；
45.立即将包埋盒放在干冰或-80℃冰箱中，至oct包埋剂完全冻结；
46.s102：冰冻切片机预冷：
47.冰冻切片机冷冻箱温度设置-20℃，速冻台温度设施-20℃；
48.s103冷冻切片：
49.在样品台上添加oct包埋剂打底，将包埋好的棉花茎杆放在样品托上，再将其转移至已经预冷到-20℃的速冻台上静置，样品固定到样品托持承器上固定切片。
50.s104制片：
51.将切片平展于速冻台上，调整切片的角度后切片，收集符合要求的切片。。
52.进一步的，步骤s101所述的棉花茎杆为生长两周的棉花茎杆。
53.进一步的，步骤s101所述的oct包埋剂为tissuetek o.c.t.compound，vwr，25608-930；
54.进一步的，步骤s101所述的oct包埋剂添加量≤包埋盒体积的1/3。
55.步骤s101所述的包埋剂完全冻结后，透过oct包埋剂有棉花茎杆组织裸露未完全包埋，则继续添加oct包埋剂，直至oct包埋剂完全包埋棉花茎杆组织。
56.进一步的，步骤s103所述的包埋好的棉花茎杆上样品托之前修剪，去除多余oct包埋剂。
57.进一步的，步骤s103所述静置时间为10
±
2min。
58.进一步的，步骤s104所述切片时，先将切片厚度设置为60μm，快速切除掉包埋块和多余的组织，在切面接近需收集样品时，将切片厚度设置为10μm切片，观察样本的切片轮廓，符合要求后收集样本切片。
59.进一步的，步骤s104所述切片后，将切片贴在组织优化玻片的捕获区内，将手指抵在玻片捕获区背面，使oct包埋剂快速融化，切片粘附于玻片上。
60.本发明还提供一种用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法的用途。
61.一种用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法，所得切片用于空间转录组学分析。
62.实施例1
63.结合图1所示。
64.用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法
65.1.冰冻切片机预冷：
66.启动冰冻切片机(leica cm1950)，冷冻箱设定温度为-20℃，速冻台温度设定为-20℃，待仪器各部位达到设定温度后开始后续操作。
67.2.样品制备：
68.取生长两周的棉花茎杆，将其裁成6mm的片段，用清水清洗干净之后用无尘纸吸干水分，保证组织表面无液体残留，未粘附组织以外的杂质，用镊子置于培养皿中。在包埋盒上备注好样本名，将在冰上预冷后的oct注入包埋盒，加入量不超包埋盒1/3。确认组织切片方向，使用镊子将新鲜组织放入装有oct的包埋盒中，再用oct覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡。立即将含有组织和oct的包埋盒放在干冰上或-80冰箱中(若oct凝固后，发现透过oct仍能看见部分组织或有少部分组织裸露未完全包埋，则叠加oct，直至oct凝固后看不见组织本身，组织被完全包埋)。于干冰或-80冰箱中冷冻30min，等到oct完全冻结后便可以进行切片(若要缩短冷冻时间，包埋后可将干冰盒放入-80冰箱，促进oct冻结)。适当修剪包埋块的形状，去掉多余的oct，便于切片和黏连样品托。在样品托上添加oct包埋剂进行打底，随后将样品包埋块与样品拖上液态oct相黏连，然后将其转移至预冷到-20℃的速冻台上静止10约分钟，直至样品包埋块固定到样品托上，样品制备结束。
69.3.切片：
70.将样品托固定到样品托持承器上，调整好展片框和刀片的位置后进行切片。首先将切片厚度设置为60μm，快速切除掉包埋块和多余的组织，在切面接近需收集样品时，将切片厚度设置为10μm，切片同时用普通吸取切片，初步观察样本轮廓，判断是否开始收集样本。
71.4.制片：
72.将待收集的切片平展于速冻台上，调整切片的角度，将切片贴在组织优化玻片的捕获区内，将手指抵在玻片捕获区背面，使oct快速融化，以有利于切片粘附。
73.棉花茎杆切片的he染色成像如图1所示。由图1可以看出，取新鲜棉花茎杆材料直接包埋后切片，得到细胞结构清晰完整的组织切片，避免了细胞结构的损害和成分的流失，适合作为用于空间转录组学分析中的棉花幼茎冰冻切片方法。
74.实施例2
75.结合图2所示。
76.用于空间转录组分析棉花幼茎冷冻切片方法
77.1.冰冻切片机预冷：
78.启动冰冻切片机(leica cm1950)，冷冻箱设定温度为-20℃，速冻台温度设定为-20℃，待仪器各部位达到设定温度后开始后续操作。
79.2.样品制备：
80.取生长两周的棉花茎尖，将其裁成6mm的片段，用清水清洗干净之后用无尘纸吸干水分，保证组织表面无液体残留，未粘附组织以外的杂质，用镊子置于培养皿中。在包埋盒上备注好样本名，将在冰上预冷后的oct注入包埋盒，加入量不超包埋盒1/3。确认组织切片方向，使用镊子将新鲜组织放入装有oct的包埋盒中，再用oct覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡。立即将含有组织和oct的包埋盒放在干冰上或-80冰箱中(若oct凝固后，发现透过oct仍能看见部分组织或有少部分组织裸露未完全包埋，则叠加oct，直至oct凝固后看不见组织本身，组织被完全包埋)。于干冰或-80冰箱中冷冻30min，等到oct完全冻结后便可以进行切片(若要缩短冷冻时间，包埋后可将干冰盒放入-80冰箱，促进oct冻结)。适当修剪包埋块的形状，去掉多余的oct，便于切片和黏连样品托。在样品托上添加oct包埋剂进行打底，随后将样品包埋块与样品拖上液态oct相黏连，然后将其转移至预冷到-20℃的速冻台上静止10约分钟，直至样品包埋块固定到样品托上，样品制备结束。
81.3.切片：
82.将棉花茎尖样品托固定到样品托持承器上，调整好展片框和刀片的位置后进行切片。首先将切片厚度设置为60μm，快速切除掉包埋块和多余的组织，在切面接近需收集样品时，将切片厚度设置为10μm，切片同时用普通吸取切片，初步观察样本轮廓，判断是否开始收集样本。
83.4.制片：
84.将待收集的切片平展于速冻台上，调整切片的角度，将切片贴在组织优化玻片的捕获区内，将手指抵在玻片捕获区背面，使oct快速融化，以有利于切片粘附。
85.棉花茎尖切片的he染色成像如图2所示。由图2可以看出，取棉花茎尖直接包埋后切片，得到细胞结构清晰完整的组织切片，避免了细胞结构的损害和成分的流失，适合作为用于空间转录组学分析中的棉花幼茎冰冻切片方法。
86.实施例3
87.结合图3所示。
88.1.冰冻切片机预冷：
89.启动冰冻切片机(leica cm1950)，冷冻箱设定温度为-20℃，速冻台温度设定为-10℃，待仪器各部位达到设定温度后开始后续操作。
90.2.样品制备：
91.取新鲜棉花幼茎，用清水清洗干净之后用无尘纸吸干水分，保证组织表面无液体
残留，未粘附组织以外的杂质，用镊子置于培养皿中。将新鲜样本迅速放入液氮或液氮预冷的异戊烷中冰冻15min。在包埋盒上备注好样本名，将在冰上预冷后的oct注入包埋盒，加入量不超包埋盒1/3。确认组织切片方向，使用镊子将新鲜组织放入装有oct的包埋盒中，再用oct覆盖暴露的组织表面，确认在组织附近没有气泡。立即将包埋盒放在预冷的-20℃切片机机箱中冷冻30min，等到oct完全冻结后便可以进行切片。适当修剪包埋块的形状，去掉多余的oct，便于切片和黏连样品托。在样品托上添加oct包埋剂进行打底，随后将样品包埋块与样品拖上液态oct相黏连，然后将其转移至预冷到-20℃的速冻台上静止10约分钟，直至样品包埋块固定到样品托上，样品制备结束。
92.3.切片：
93.将样品托固定到样品托持承器上，调整好展片框和刀片的位置后进行切片。根据样本所需设置切片厚度并进行切片，初步收集切片，观察样本轮廓，判断是否开始收集样本。
94.4.制片：
95.将待收集的切片平展于速冻台上，调整切片的角度，将切片贴在组织优化玻片的捕获区内，将手指抵在玻片捕获区背面，使oct快速融化，以有利于切片粘附。
96.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
97.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
98.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。