衍生自有孔虫的骨移植材料的制作方法

涉及一种衍生自有孔虫的骨移植材料。
背景技术：
通常，当骨组织因外伤、畸形或生理现象等而受损时，会进行引导骨再生术(GBR，guidedbonregeneration)，即，将骨移植材料填充至该部位，覆盖屏障膜以阻断软组织的介入并使新骨生成。用于修复这种骨缺损部位最常见的引导骨再生术方法有自体移植(autograft)，即部分截取其它部位的自体骨后移植；同种异体移植(allograft)，即对他人的骨进行化学处理后移植；异种移植(xenograft)，即对动物的骨进行化学处理后移植等。以通常用于截取部分自体骨后移植的自体移植术的自体骨移植材料为例，会移植自体海绵骨(ACB，AutogenousCancellousBone)，因而几乎没有免疫排斥反应和骨吸收，因此具有骨引导和骨诱导能力较好的优点；以用于同种异体移植术和异体移植术的同种骨移植材料和异体骨移植材料为例，会利用同种异体移植(allograft)，即利用其他人的骨而非移植者本人的骨，或者通过异体移植(xenograft)，即利用其它动物的骨，因此具有无需在移植者(graftee)本人的骨缺损部位以外的部位进行二次手术的优点，而这正是自体骨移植材料的缺点。同种异体骨，取自尸体或其他活体捐献者，会将移植材料冷冻或冷冻干燥、脱灰冷冻干燥并施加放射线照射从而去除抗原性后使用，虽然骨形成所需时间长且生成的骨量少，但是其具有随时使用所需的量且不造成附加性的手术部位的优点。这种同种异体骨的种类有冻结干燥骨中非脱灰形态(DFDBA，Demineralizedfreezedriedboneallografts)、非脱灰形态(FDBA，Freezedriedboneallografts)以及放射线照射海绵骨形态(ICB，Irradiatedcancellousbone)。异种骨是截取牛或猪等动物的骨后经过多种过程降低免疫反应来期待骨引导能力的移植材料，其具有无需造成附加性的手术部位的优点和可充分使用所需量的优点，但是由于吸收后置换所需的时间长，当前的趋势是相比骨诱导偏向于理解为骨传导的基础。这种异种骨的种类有Bio-Oss，ABM/P-15以及BioCeraTM等。合成骨是经人工合成而制造的骨而非实际骨，因此与其它骨移植材料相比，品质最低且骨形成所需的时间长，但具有价格低廉的优点，临床使用的合成骨有无孔羟磷灰石(non-poroushydroxyapatite，HAp)、轻磷灰石水泥(hydroxyapatitecement)、多孔羟基磷灰石(poroushydroxyapatite)、β磷酸三钙(betatricalciumphosphate)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，polymethlymethacrylate)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA，hydroxyethylmethacrylate)聚合物以及生物活性玻璃(bioactiveglass)。HA、PMMA以及HEMA聚合物是非吸收性，而磷酸三钙(tricalciumphosphate)和生物活性玻璃(bioactive)是吸收性，这种合成骨的种类有磷酸三钙、硬组织介质聚合体以及生物活性玻璃陶瓷等。另一方面，羟基磷灰石(HAp)已被广泛用作骨移植和牙科设备中的骨替代物。HAp是一种具有骨引导特性的生物相容性和生物活性材料，其化学组成与天然骨组织相似。HAp是一种磷酸钙生物陶瓷，可以将含有钙离子和磷酸根离子的化学物质作为原料来进行合成。已有关于通过水热反应从海藻中制备HAp陶瓷的几份报告。因此，需要研发一种具有更高的细胞增殖与粘附能力的材料，以用作骨移植材料。技术实现要素：技术问题一方面提供一种骨移植材料，其具有特有的结构，因而具有显著的细胞增殖、细胞粘附以及成骨细胞分化能力，并且包括能够支撑新形成的骨的结构。另一方面提供一种制备所述骨移植材料的方法。技术方案一方面提供一种骨移植材料，其包括羟基磷灰石，所述羟基磷灰石包括由隔墙区分的复数个腔室，所述隔墙包括多个孔。所述羟基磷灰石可以衍生自有孔虫(Foraminifera)(例如，衍生自有孔虫的外骨骼)。所述有孔虫可以是指有壳根足虫类的原生动物。所述有孔虫可以包括Globigerina属、Camerina属、Elphidium属、Myogipsina属以及Baculogypsina属。更具体地，所述Baculogypsina属可以是Baculogypsinasphaerulata，Baculogypsinabonarellii，Baculogypsinagallowayi，Baculogypsinalenticulate，Baculogypsinameneghinii，Baculogypsinasaoneki，或Baculogypsinasphaerica。本说明书中的术语“骨移植材料(bonegraft)”是可用于填补骨缺损、刺激骨形成、关节融合、关节制动以及预防脱位的材料，是指可用于骨移植术(bonegrafting)的材料。因此，在本说明书中，骨移植材料可以是用于治疗骨缺损的材料。在本说明书中，骨移植材料可以适用于例如，筛骨(ethmoid)、额骨(frontal)、鼻骨(nasal)、枕骨(occipital)、顶骨(parietal)、颞骨(temporal)、下颌骨(mandible)、上颌骨(maxilla)、颧骨(zygomatic)、颈椎(cervicalvertebra)、胸椎(thoracicvertebra)、腰椎(lumbarvertebra)、骶骨(sacrum)、肋骨(rib)、胸骨(sternum)、锁骨(clavicle)、肩胛骨(scapula)、肱骨(humerus)、桡骨(radius)、尺骨(ulna)、腕骨(carpalbones)、掌骨(metacarpalbones)、趾骨(phalanges)、髂骨(ilium)、坐骨(ischium)、耻骨(pubis)、股骨(femur)、胫骨(tibia)、腓骨(fibula)、髌骨(patella)、跟骨(calcaneus)、跗骨(tarsal)和跖骨(metatarsalbones)。另外，在本说明书中，骨移植材料可以用于牙科(牙科植入物)、整容外科(plasticsurgery))以及整形外科(Orthopedics)等。本说明书中的术语“成骨能力”是指通过成骨细胞(osteoblast)诱导或促进骨基质形成和骨再生(osteoanagensis)的功能，包括软骨性骨化、结缔组织性骨化以及转造性骨化。本说明书中的术语“骨引导能力”是指，吸引成骨细胞以诱导或促进成骨细胞的骨基质形成。本说明书中的术语“骨诱导能力”是指，仅使有助于骨组织再生的细胞和物质接近缺损部位，从而诱导再生为所需骨组织的功能。术语“施用的”、“导入的”以及“移植的”可以彼此互换使用并且可以是指，引起根据一具体实施方式的组合物向所需部位至少部分定位的方法，或者根据一具体实施方式的组合物通过途径向个体的配置。根据一具体实施方式的组合物的细胞或细胞成分的至少一部分可以通过将其传递至存活个体中所需位置的任意适当途径来施用。在一具体实施方式中，所述骨移植材料可以包括复数个羟基磷灰石颗粒。所述颗粒的大小可以是50至4000μm、50至3000μm、50至2000μm、80至2000μm、100至4000μm、100至2000μm、100至1500μm、100至1200μm、100至1000μm、100至700μm或120至600μm。在一具体实施方式中，所述腔室的直径可以是5至200μm、5至180μm、5至150μm、5至120μm、10至100μm、10至80μm、10至60μm或15至60μm。所述腔室的截面面积可以是椭圆形，所述直径可以是均指椭圆的短直径或长直径两种。在一具体实施方式中，所述孔的直径可以是0.05至5μm、0.05至4.5μm、0.05至4μm、0.08至3μm、0.08至2μm、0.1至3μm、0.1至2μm或0.2至2μm。在另一具体实施方式中，所述隔墙的厚度可以是1至50μm、1至45μm、1至40μm、2至40μm、4至40μm、4至30μm、5至30μm、5至20μm或5至15μm。在另一具体实施方式中，所述羟基磷灰石可以具有每1cm2表面20000至100000个、20000至80000个、25000至80000个、30000至80000个、30000至750000个、30000至70000个或40000至60000个均匀的腔室。在另一具体实施方式中，所述羟基磷灰石颗粒可以含有0.5至10重量％(atomic％)的镁离子，0.2至10重量％(atomic％)的硅离子，或0.1至5重量％(atomic％)的锶离子。在本说明书中，重量％是指重量百分比，通常表示为总重量的重量百分比。在另一具体实施方式中，所述羟基磷灰石可以通过对有孔虫的外骨骼进行水热反应来制备。本说明书中的术语“水热合成(hydrothermalsynthesis)”也被称作水热反应，意指物质在高温水或高温、高压水存在的情况下进行的合成反应。在根据本说明书的骨移植材料中，羟基磷灰石可以通过使预处理的有孔虫的外骨骼至少在30℃、50℃、80℃或高于或等于100℃下，例如，在30℃至600℃、80℃至600℃、100℃至600℃、100℃至500℃、100℃至400℃或100℃至300℃下，以2小时至40小时、2小时至30小时、10小时至40小时或12小时或36小时进行水热反应来制备。在另一具体实施方式中，在根据本说明书的骨移植材料中，羟基磷灰石可以通过对预处理的有孔虫外骨骼进行微波处理来制备。在一具体实施方式中，所述骨移植材料可以包括或不包括TCP(TricalciumPhosphate)。所述“不包括”是指“实际上不包括”，其中，“实际上”是指能够以不对骨移植材料的活性产生影响的量来包括。在另一具体实施方式中，所述骨移植材料可以是具有细胞增殖能力、细胞粘附能力或成骨细胞分化能力的材料。在一具体实施方式中，所述移植材料可以进一步包括细胞，例如，体细胞或干细胞。本说明书中的术语“干细胞”可以是指，具有分化为其它细胞的能力的未分化的细胞。所述干细胞可以是胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞或间充质干细胞。所述间充质干细胞可以是从各种组织、各种人中或各种年龄的人中分离的细胞。例如，所述间充质干细胞可以是衍生自脂肪组织、胎盘、脐带血、肌肉组织、角膜组织或骨髓组织的间充质干细胞。另外，例如，所述间充质干细胞可以是脂肪干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、神经干细胞、胎盘干细胞或脐带血干细胞。本说明书的骨移植材料可以进一步包括粘合剂(bindingagent)。在本说明书中，粘合剂可以是指物理性固定、结合或凝聚所述羟基磷灰石，以使将骨移植材料适用于骨缺损部位时，防止骨移植材料立即从骨缺损部位脱离的材料。粘合剂可以包括公开的生物相容性材料，例如，牙科树脂粘固剂(dentalresincement)，玻璃离子粘固剂(glassionomercement)，胶原蛋白胶(collagenbasedglues)，磷酸锌(zincphosphate)、磷酸镁(magnesiumphosphate)等磷酸盐水泥(phosphate-basedcements)，羧酸锌(zinccarboxylate)，纤维蛋白胶(fibringlues)、粘合蛋白质(mussel-derivedadhesiveproteins)等蛋白质粘合剂(protein-basedbinders)。在本说明书中，骨移植材料可以进一步包括添加剂。所述添加剂可以是为了防止骨缺损部位的感染，或者进一步提高骨移植材料的成骨能力、骨引导能力或骨诱导能力而添加的医学上可接受的附加成分。添加剂可以包括例如，抗病毒药物、抗菌剂、抗生素、抗癌剂和血管生成剂(angiogenicdrugs)等药物，多糖水溶液，氨基酸，肽，维生素，蛋白质合成的辅助因子，促生长素(somatotropin)等生长激素，内分泌组织碎片，胶原酶(collagenase)、肽酶(peptidases)、氧化酶(oxidases)等酶，软骨碎片(cartilagefragments)、软骨细胞(chondrocytes)和骨髓细胞(bonemarrowcells)等活细胞，免疫抑制剂，脂肪酸酯以及核酸，但不限于此，所属领域的技术人员可以根据骨缺损部位以及适用对象的状态，选择一种或多种合适的添加剂。本说明书中的骨移植材料可以按照常规方法，制成粉剂、悬浮液、乳剂、软膏剂或注射剂的形式适用于骨缺损部位或周边部位。在本说明书中，“施用计量”是指通过适用于需要的对象部位，足以诱导或促进骨形成或再生的量。根据本发明的骨移植材料的施用计量可以根据患者的体重、年龄、性别、健康状况以及骨损伤程度而不同，并且可以由所属领域的技术人员做适当选择。另外，本说明书提供一种组合物，其用于制备所述骨移植材料。根据本说明书的用于制备骨移植材料的组合物可以进一步包括选自由水、盐水、无菌水、任氏液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、褐藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、碳酸钙、糊精、丙二醇以及液体石蜡所组成的组中的一种或多种。另一方面，提供一种制备所述骨移植材料的方法。所述方法可以包括：对有孔虫进行预处理；使所述预处理的外骨骼在120至400℃下水热反应2至40小时，从而制备羟基磷灰石/或者微博处理所述预处理的外骨骼，从而制备羟基磷灰石；以及/或烧结所述羟基磷灰石。所述预处理步骤可以包括：洗涤有孔虫；以及/或将所述洗涤的有孔虫添加至含有能够提供磷酸的化合物的水溶液中。所述能够提供磷酸的化合物的示例可以包括(NH4)H2PO4、H3PO4、Na3PO4或Na2HPO4等。另外，所述通过水热反应来制备羟基磷灰石可以包括，至少在30℃、50℃、80℃或高于或等于100℃下，例如，在30℃至600℃、80℃至600℃、100℃至600℃、100℃至500℃、100℃至400℃或100℃至300℃下，以2小时至40小时、2小时至30小时、10小时至40小时或12小时或36小时进行水热反应。另外，所述通过微博处理来制备羟基磷灰石可以包括，用波长范围为300MHz至300GHz的微波以100至1500W的量来处理0.5分钟至48小时。另外，所述烧结的步骤可以包括，将制备的羟基磷灰石升温至200℃至1500℃；以及/或使其冷却。所述升温可以至少进行复数次或更多。例如，所述升温步骤可以包括，以1至20℃/min的速率升温至400至800℃后维持一定时间(例如，1小时至8小时)，然后重新以1至20℃/min的速率升温至600至1500℃。另外，所述冷却可以至少进行至常温。有益效果根据一方面的衍生自有孔虫的骨移植材料，具有显著的细胞增殖、细胞粘附以及成骨细胞分化能力，并且其包括能够支撑新形成的骨的结构，因此具有可以有效用作骨移植材料的效果。附图说明图1是示出根据一具体实施方式的羟基磷灰石颗粒结构的扫描电子显微镜图；a：1000×、10000×，b：100×、1000×、3000×。图2是示出根据一具体实施方式的羟基磷灰石颗粒的腔室以及孔的扫描电子显微镜图。图3是显示比较根据一具体实施方式的羟基磷灰石颗粒的XRD衍射分析结果与对照组HAp结果的图。图4是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的细胞毒性检测结果的图。图5是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的细胞增值检测结果的图。图6是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的细胞粘附以及浸润结果的扫描电子显微镜图。图7是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的ALP活性检测结果的图。图8是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的成骨细胞标记基因表达水平的图。图9是示出根据一具体实施方式的羟基磷灰石在体内移植8周时的微型CT结果的图(a)与对其进行量化的图(b)。图10是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的体内骨再生效果的H&E染色结果。图11是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的体内骨再生效果的戈德纳马森三色染色结果。具体实施方式下面，将通过实施例进一步详细描述本发明。但是，所述实施例仅用于示例性描述本发明，本发明的范围并不因其而受到限制。参照例1.细胞培养利用人类间充质干细胞(hMSC)评价了衍生字有孔虫的HAp的生物相容性。具体地，以5％的CO2以及37℃条件，在含有10％胎牛血清(FBS；Gibco-BRL)的α-MEM(Gibco-BRL，MD，Gaithersburg，MD)中培养细胞，并利用4至6阶段传代培养的hMSC进行了体外(invitro)实验。为诱导成骨细胞分化，在添加有骨形成刺激剂(0.1mM的地塞米松(dexamethasone)，0.1M的β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate)以及50μg/mL的抗坏血酸(ascorbicacid))的培养基中培养细胞。用于含有骨形成刺激剂的培养基的所有化合物使用了细胞培养等级的试剂(SigmaAldrich，St.Louis，MO，USA)。正常生长培养基和含有骨形成刺激剂的培养基在实验过程中每2天更换一次后使用。细胞培养实验以前，先用70％酒精将HAp颗粒灭菌30分钟，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次10分钟。灭菌后，将20mg无菌纯HAp和衍生自有孔虫的HAp颗粒放入48孔培养板中。接种细胞(5×104cell/well浓度)后培养(incubation)2小时，使初始细胞粘附于每个HAp颗粒上。将细胞附着的HAp颗粒转移至新的培养板的孔中，然后进行培养以用于体外(invitro)实验。参照例2.细胞增殖基于利用AqueousOnesolution(MTSassay，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的线粒体活性分析，评价了细胞增殖。如上所述，接种(seeding)hMSC并培养1、3、6、9以及12天。在预定的时间点，将50μL的试剂溶液与250μL的正常培养基混合后，添加至每个孔中。培养细胞4小时后取上清液，并使用ELISAplatereader(SpectraMAXM3；MolecularDevices，Sunnyvale，CA)检测了490nm下的吸光度。参照例3.细胞活力与细胞毒性通过利用和Viability/Cytotoxicity试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的荧光染色法，评价了细胞活力与细胞毒性。根据制备方案，用PBS缓冲液洗涤30分钟经细胞培养的HAp颗粒。然后，使用试剂盒的钙黄绿素乙酰氧基甲酯(CalceinAM，calceinacetoxymethylester)和溴乙啡锭二聚体1(EthD-1，ethidiumhomodimer-1)对细胞进行染色后，通过倒置荧光显微镜(DMILLEDFluo；LeicaMicrosystems，Wetzlar，Germany)进行观察。参照例4.细胞粘附与细胞浸润的体外评价培养细胞5天，以观察表面上的细胞粘附与向每个HAp颗粒的细胞浸润。用PBS缓冲液洗涤样品，并在2.5％的戊二醛(glutaraldehyde)溶液中以4℃固定2小时后，用0.1％的四氧化锇(osmiumtetroxide)溶液后固定(post-fixed)。然后，在gradedethanolseries(30、50、75、85、95、100％，各10分钟)中对样品进行脱水(dehydration)。然后，溅射镀金(sputter-coated)后用EM(EM-30)进行观察。用锋利的小刀(lancet)切开HAp颗粒露出截面后进行了SEM分析，以观察细胞浸润。参照例5.ALP(AlkalinePhosphatase)活性检测用ALP(AlkalinePhosphatase)活性分析评价了成骨细胞分化。将对硝基苯磷酸酯(p-NPP，p-nitrophenylphosphate)用作基质，进行了ALP活性分析。具体地，将hMSC接种(seeding)到颗粒上，然后在含有骨形成刺激剂的培养基中进行培养。培养细胞5天后，在冰箱(icebox)条件下，用1％的TritonX-100/PBS溶液超声波处理(sonication)粘附性细胞10分钟而使其溶解。在4℃下以12000rpm离心样品，以去除颗粒与碎屑。将上清液用于ALP活性分析以及蛋白质浓度分析。在本研究中，ALP活性被标准化(normalized)为总蛋白质含量。参照例6.实时聚合酶链反应为了检测在HAp颗粒上培养的hMSC的成骨细胞分化，利用定量实时聚合酶链反应(RPCR)分析了几种成骨标记基因，例如，ALP，collagentypeIα1(Col1αI)，osteocalcin(OCN)以及bonesialoprotein(BSP)。在含有骨形成刺激剂的培养基中培养7天后，从细胞中分离总mRNA，并用逆转录酶(Invitrogen)和寡核苷酸(dT)引物转录cDNA。通过针对TaqManUniversalPCRMastermix(AppliedBiosystem)与ALP(Hs01029144_m1)，Col1αI(Hs00164004_m1)，OCN(Hs01587814_g1)，BSP(Hs00173720_m1)，18S(Hsscience)的primersandTaqManprobesets来扩增cDNA。所有TaqManPCR均通过StepOnePlusRPCR系统(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)来进行，并将18SrRNA基因作为内标进行共扩增。参照例7.动物模型使用肌肉内剂量的氯胺酮(ketamine)(35mg/kg；Yuhan，首尔)以及甲苯噻嗪(xylazine)(5mg/kg；BayerKorea，首尔)麻醉了4只成年雄性(年龄>3个月)新西兰白兔(2.5-3.0kg)。然后，用2％利多卡因(lidocaine)溶液进行局部麻醉。切除组织后，使用外径为6mm的环钻(trephine)制造3个分离的圆形颅骨缺损。一个缺损用作对照组，另一个缺损用纯HAp颗粒填充，第三个缺损用衍生自有孔虫的HAp颗粒填充。移植8周后观察了治愈过程，并将缺损连同周围骨从宿主骨切开。在进一步分析之前，移出标本(specimens)并在4℃下置于固定溶液(phosphatebuffered4％paraformaldehydesolution，pH7.2)中7天。参照例8.微型CT骨分析通过微型计算机断层扫描(Micro-CT)(Sky-Scan1172TM，Skyscan，Kontich，Belgium)，对新形成的骨进行了病理学评价。移植8周后，使用0.5-mm铝过滤器并通过设为60kV电压和167μA电流条件的X射线分析了样品。基于微型CT结果，通过基于3D软件(CTVol，Skyscan)的3D重建图像观察缺损的定性图像，并使用图像分析软件(CT-analyzerTM，Skyscan)按照以下公式计算了骨体积比(BV，bonevolume)。BV(％)＝(新骨体积)-(剩余移植材料体积)/总缺损体积参照例9.组织学分析移植8周后进行了组织学分析。针对大鼠(rat)颅骨的固定试片，用8％甲酸/8％HCl去除钙化合物，然后用分级酒精系列(gradedalcoholseries)(70-100％)进行脱水。最后将试片放入石蜡。使用rotarymicrotone(HM325TM；Microm，Walldorf，Germany)以5μm的分区进行切割。用苏木素-伊红染液(HE，hematoxylin-eosin)和戈德纳马森三色染色(Goldner'smassontrichromand)，从每个样品中心开始的5个分区进行染色。然后，随机选择样品并用显微镜(DMR，Leica，Nussloch，Germany)观察新骨形成。参照例10.统计分析数值表示为平均值±标准差(SD)，进行方差分析(one-wayanalysisofvariance,ANOVA)后，通过利用GraphPadPrismversion5.3的Dunnett'spost-hoctest进行了统计分析；P<0.05被认为具有统计学上的意义。实施例.羟基磷灰石颗粒的制备和分析1.利用有孔虫的羟基磷灰石(HAp)颗粒制备如下制备利用有孔虫的羟基磷灰石。首先，从市场购买有孔虫(Baculogypsinasphaerulata,Okinawa,Japan)。为去除残留污染物和有机成分，用4％高氯酸钠(NaClO4)煮沸样品后，用蒸馏水洗涤。具体地，将样品添加至磷酸二氢铵((NH4)H2PO4)水溶液后，使Ca：P的摩尔比变为10：6。然后，将样品置于衬有聚四氟乙烯(Teflon-lined)的不锈钢压力容器中，并在200℃下加热24小时。用沸水洗涤转化后的样品并在60℃下干燥。然后，用小刀(lancet)切碎HAp颗粒后，利用不锈钢筛分离出200至500μm范围的颗粒。然后，对颗粒进行烧结工艺并进行结晶。烧结(sintering)在电炉(MuffleFurnace,SH-FU-4MH)中进行，以5℃/min的升温速率升温至600℃后，在600℃下维持2小时。然后，再次以5℃/min的升温速率升温至800℃后，在800℃下维持4小时。然后，将温度降到室温进行烧结工艺。作为对照组，从DioImplantInc(釜山，韩国)获得并使用化学计量合成的HAp颗粒(纯HAp，粒径范围为200-500μm)。2.化学与形态特征为了分析通过所述实施例1.制备的衍生自有孔虫的HAp的组成，使用CuKα辐射进行了X射线衍射分析(XRD；D8，BrukerAXS，Karlsruhe，Germany)，并以扫描速率0.02°/分，50kV，10-80°范围的条件进行了分析。通过X射线荧光光谱(XRF，Bruker)评价样品的离子组成。在真空下使用扫描电子显微镜(SEM；EM-30，COXEM,大田，韩国)观察衍生自有孔虫的HAp颗粒的微观结构和表面形态。所述扫描电子显微镜的图像示于图1和图2，所述XRD衍射分析结果示于图3，样品的离子组成示于下表1。【表1】元素含量％镁(Mg)2.98％硅(Si)1.53～2.5％锶(Sr)0.52～1.11％图1是示出根据一具体实施方式的羟基磷灰石颗粒结构的扫描电子显微镜图。图2是示出根据一具体实施方式的羟基磷灰石颗粒的腔室以及孔的扫描电子显微镜图。图3是显示比较根据一具体实施方式的羟基磷灰石颗粒的XRD衍射分析结果与对照组HAp结果的图。如图1和图2所示，纯HAp颗粒的SEM图像显示出大部分为密集压缩的HAp块和非微米大小的多孔的表面形态。与此相反，根据一具体实施方式的羟基磷灰石具有由具有孔的隔墙区分的复数个腔室，并且具有内部由彼此连接的多个腔室划分的大孔(macro)结构。另外，可以看出孔均匀分布在颗粒表面。另外，没有显著的形态变化，并且这种形态学特征在转化为HAp的过程中得到维持。另外，如图2所示，每1cm2具有约53300个左右均匀的腔室数量，其大小为约50μm*25μm。另外，隔墙的孔的大小为～2μm。如图3所示，可以看出根据一具体实施方式的羟基磷灰石与市售纯Hap经水热反应后的峰型一致。这意味着有孔虫通过水热反应成功转化为HAp。实验例1.细胞毒性检测为了评价衍生自有孔虫的HAp颗粒的细胞毒性，如所述参照例所示，进行了存活/死亡染色分析，其结果示于图4。图4是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的细胞毒性检测结果的图。如图4所示，存活的hMSC会被染成绿色，颗粒上存在的大部分细胞被染为绿色，并且未观察到染为红色的死亡细胞。这种结果意味着衍生自有孔虫的Hap颗粒未显示出细胞毒性。实验例2.细胞增殖评价如所述参照例所示，通过基于MTS线粒体活性的分析(mitochondrialactivitybasedassay)，检测了衍生自有孔虫的Hap中的hMSC的细胞增殖。上述结果示于图5。图5是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的细胞增值检测结果的图。如图5所示，在纯HAp和衍生自有孔虫的Hap中，hMSCs细胞随着时间流逝均显示出良好的地生长。特别地，培养1天后，在衍生自有孔虫的Hap中培养的细胞光密度值(0.25±0.10)明显高于纯HAp中的光密度值(0.07±0.01)。这种结果意味着衍生自有孔虫的Hap相比于纯Hap，可能更有利于初期的细胞粘附。另外，在所有实验时间点，对衍生自有孔虫的Hap颗粒的hMSC光密度明显高于纯HAp的光密度。实验例3.观察细胞粘附与细胞浸润通过所述参照例所示的方法，在培养细胞第5天时利用SEM观察了hMSC对纯HAp颗粒和衍生自有孔虫的Hap颗粒的细胞粘附和浸润，其结果示于图6。图6是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的细胞粘附以及浸润结果的扫描电子显微镜图。如图6所示，hMSC仅在纯HAp表面少量粘附和生长。与此相反，相比于纯HAp，衍生自有孔虫的Hap的表面附着多数细胞。另外，还在衍生自有孔虫的Hap的腔室内观察到浸润和附着的hMSC。这种结果意味着根据一具体实施方式的羟基磷灰石的颗粒结构，提供更有利于细胞粘附的环境。实验例4.成骨细胞分化能力分析为了分析成骨细胞分化能力，如所述参照例所示进行了ALP活性和qRT-PCR，从而检测成骨细胞标记基因，例如ALP、ColIa1、OCN以及BSP。上述结果示于图7和图8。图7是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的ALP活性检测结果的图。图8是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的成骨细胞标记基因表达水平的图。如图7所示，在含有骨形成刺激剂的培养基中培养细胞时，ALP活性在衍生自有孔虫的Hap颗粒上检测为19.59±3.06nmol/mg的蛋白质，可以看出这是在纯HAp上培养的细胞(5.69±0.68nmol/mg的蛋白质)的约3.4倍。另外，如图8所示，衍生自有孔虫的Hap颗粒上的ALP、ColIa1、OCN以及BSP的mRNA表达水平，分别为纯HAp颗粒的约6.6倍、10.5倍、2.6倍以及16.5倍。这种结果意味着根据一具体实施方式的羟基磷灰石具有明显高于纯羟基磷灰石的成骨细胞分化能力。实验例5.体内骨再生能力分析为了分析通过所述实施例制备的衍生自有孔虫的Hap的体内骨再生能力，进行了微型CT以及组织学评价。具体地，如所述参照例所示，在移植8周后获得了三维微型CT图像并将其结果示于图9，移植8周后对骨缺损部位进行了H&E染色和戈德纳马森三色染色，其结果分别示于图10和图11。图9是示出根据一具体实施方式的羟基磷灰石在体内移植8周时的微型CT结果的图(a)与对其进行量化的图(b)。图10是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的体内骨再生效果的H&E染色结果。图11是显示根据一具体实施方式的羟基磷灰石的体内骨再生效果的戈德纳马森三色染色结果。如图9a所示，可以看出对照组(emptygroup，未移植)中的缺损部位边缘有新骨再生。但是，在移植纯HAp和衍生自有孔虫的HAp的组中，不仅在缺损的边缘区域，还在移植的HAp颗粒内部观察到新骨再生。特别地，在移植衍生自有孔虫的HAp的组中，新形成的骨覆盖了有孔虫缺损区域的表面。另外，如图9b所示，衍生自有孔虫的Hap(31.54±3.61％)的骨体积百分比显著高于对照组(emptygroup)(8.43±0.52％)和纯HAp(21.18±2.61％)的骨体积。另外，如图10所示，对照组(emptygroup，未移植)、移植纯HAp的组以及移植衍生自有孔虫的Hap的组，均在其缺损部位的边缘区域观察到新骨形成，并且移植的所有组均显示出新骨与缺损结合的倾向。特别地，在移植纯HAp和衍生自有孔虫的HAp的组中，观察到新骨在边缘缺损部位形成，并且由于在HAp颗粒的外表面上形成新骨，因而观察到与骨髓腔相似的形态(bonemarrowcavity-likemorphology)。可以看出成熟的新骨在移植有孔虫的组中明显更厚。另外，如图11所示，在移植纯HAp和衍生自有孔虫的HAp的组中，除周边部位之外，还在中心区域观察到新形成的骨。与此相反，在对照组(emptygroup，未移植)的中心区域仅观察到松散的结缔组织。另外，相比于其它组，可以看出在移植衍生自有孔虫的Hap的组中，显著形成大量的新骨。另外，可以看出仅在移植衍生自有孔虫的Hap的组中，形成与内生长(ingrowth)在多孔腔室里的组织相似的新骨。这种结果显示出衍生自有孔虫的Hap颗粒不仅刺激新骨形成，还在其腔室结构中支撑(support)新形成的骨的浸润。当前第1页12