鉴别地中海贫血αααanti4.2杂合型和HKαα杂合型的方法和试剂盒与流程

技术特征：
1.一种精准鉴别αα/αααanti4.2和αα/hkαα基因型扩增子文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：s1：第一轮pcr所述第一轮pcr过程中，使用第一引物、第二引物、和第三引物对目标序列进行pcr扩增，获得第一轮pcr扩增产物；其中，所述第一引物从5’端到3’端依次包括第一测序标签序列和目标序列特异性的正向引物序列；所述第二引物从5’端到3’端依次包括第二测序标签序列和目标序列特异性的反向引物序列；所述第三引物从5’端到3’端依次包括第一测序接头序列、样本标签序列、和第二测序标签序列；s2：第二轮pcr所述第二轮pcr过程中，使用第四引物和第五引物对所述第一轮pcr扩增产物进行pcr扩增，获得第二轮pcr扩增产物，经纯化后即得所述扩增子文库；其中，所述第四引物从5’端到3’端依次包括第二测序接头序列和第一测序标签序列；所述第五引物为第一测序接头序列。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s1中，对多个样本来源的目标序列进行pcr扩增，并且针对不同样本来源的所述第三引物的样本标签序列各不相同，从而实现根据不同的样本标签序列区别不同样本。3.一种判断αα/αααanti4.2和αα/hkαα基因型的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)构建x1/x2融合而成的anti4.2片段以及hba2和hba1基因扩增子文库，设计引物对，所述引物对包括特异性扩增x1/x2融合而成的anti4.2片段引物对；和扩增片段包含hba2基因chr16:223447位置和hba1基因chr6:16:227251-227258位置的引物对；使用所述引物对对样本核酸进行pcr扩增，获得x1/x2融合而成的anti4.2片段和hba2、hba1基因扩增子文库；(2)测序并根据测序hba2和hba1的reads比例以及是否含有anti4.2片段判断所述地中海贫血是αα/αααanti4.2还是αα/hkαα基因型。4.一种能精准鉴别αα/αααanti4.2和αα/hkαα基因型的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括seq id no.1-4所示的引物。5.根据权利要求4所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物还包括两种测序标签和两种测序接头以及样本标签。6.根据权利要求4或5所述的引物组合物，其特征在于，所述测序标签为第一和第二测序标签，分别连接于正向引物和反向引物的5’端，所述测序接头为第一和第二测序接头，且第一或第二测序接头连接样本标签和第一或第二测序标签，组成用于鉴别不同样本的引物，所述样本标签为能够鉴别不同样本的特异性核酸序列。7.权利要求4-6任一项所述引物组合物在制备地中海贫血αα/αααanti4.2和αα/hkαα基因型诊断试剂盒中的应用。8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求4-6任一项所述的引物组合物。9.一种利用权利要求4-8任一项所述引物组合物和/或所述试剂盒构建鉴别地中海贫
血αα/αααanti4.2和αα/hkαα基因型扩增子文库的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：s1：第一轮pcr所述第一轮pcr过程中，使用同权利要求4-8任一项所述引物组合物配制多重pcr反应体系，对目标序列进行pcr扩增，获得第一轮pcr扩增产物；s2：第二轮pcr所述第二轮pcr过程中，使用第四引物和第五引物对所述第一轮pcr扩增产物进行pcr扩增，获得第二轮pcr扩增产物，经纯化后即得所述扩增子文库，所述第四引物为第二测序接头和第一测序标签连接组成的引物，所述第五引物为第一测序接头。10.一种鉴别地中海贫血αα/αααanti4.2和αα/hkαα基因型的测序平台的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：1)针对x1/x2融合而成的anti4.2片段以及hba2和hba1设计如权利要求4-8任一项所述的引物；设计引物对f1-r1和引物对f2-r2；所述引物对f1-r1用于特异性扩增anti4.2片段上下游基因区段，所述引物对f1-r1中的正向引物f1和anti4.2片段上游基因区段匹配，所述引物对f1-r1中的反向引物r1和anti4.2片段下游基因区段匹配；所述引物对f2-r2用于特异性扩增hba2和hba1基因差异碱基上下游基因区段，所述引物对f2-r2中的正向引物f2和差异碱基上游基因区段匹配，所述引物对f2-r2中的反向引物r2和差异碱基下游基因区段匹配；2)样本dna提取将来自待测病患的血液、唾液或组织等用核酸自动提取仪提取dna，qubit flurometer 3.0定量，检测一个样本需要dna模板约10～30ng；3)多重pcr扩增获得x1/x2融合而成的anti4.2片段以及hba2和hba1的扩增子文库；4)文库定量，并且使用测序平台测序，对所得序列结果利用软件分析，所述分析原理如下：经pcr反应，根据正向引物f1和反向引物r1是否扩增出anti4.2片段，以及根据引物f2-r2扩增出hba2和hba1的reads比例，判断具体基因型；未扩增出anti4.2片段，且hba2和hba1的reads比例为2:2，判断基因型为αα/αα；扩增出anti4.2片段，且hba2和hba1的reads比例为2:2，判断基因型为αα/hkαα；扩增出anti4.2片段，且hba2和hba1的reads比例为3:2，判断基因型为αα/αααanti4.2。

技术总结
本发明提供了鉴别地中海贫血αααanti4.2杂合型和HKαα杂合型的方法和试剂盒，通过设计对HBA2和HBA1基因扩增效率一致的特异性引物，并与特异性检测X1/X2融合片段的引物组混合，对待测样本进行扩增，通过两轮多重PCR，能够快速准确鉴别αα/αααanti4.2和αα/HKαα基因型。该方法检测操作简便快捷，通量高成本低，很好地弥补现有技术缺点。很好地弥补现有技术缺点。很好地弥补现有技术缺点。


技术研发人员：雷湘华 叶苑青 郭永超 徐仲尧 王艳平 蔡锦刚
受保护的技术使用者：深圳联合医学科技有限公司
技术研发日：2021.12.29
技术公布日：2022/4/5