一种现场快速检测食源性致病菌副溶血性弧菌的方法、试剂盒及其应用与流程

1.本发明涉及食源性致病菌检测技术领域，特别是涉及一种现场快速检测食源性致病菌副溶血性弧菌的方法、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.海鲜产品在世界各地广泛销售，在经济市场中发挥着重要作用。弧菌属细菌会污染海产品，具有潜在的致病性，从而对人类健康构成威胁，尤其副溶血性弧菌已成为全球海产品引起食物中毒的主要原因。目前，传统的食源性致病菌副溶血性弧菌检测技术主要包括微生物检测方法、分子生物学方法和免疫学方法。其中，微生物计数法需要完成制备培养基，接种平板和菌落计数等繁冗的工作，极其耗费人力。分子生物学方法虽然无需冗杂的增菌过程，但是为了增加灵敏度，富集作用往往也是不可缺少的。而免疫学方法需要熟练且专业的技术人员和昂贵的生产费用，难以满足现场快速鉴定的需求。因此，有必要建立快速简便的检测方法对食源性副溶血性弧菌进行早期检测。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种现场快速检测食源性致病菌副溶血性弧菌的方法，基于无细胞合成技术，可实现食源性致病菌副溶血性弧菌快速灵敏的现场检测。
4.为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
5.本发明提供了一种现场快速检测食源性致病菌副溶血性弧菌的方法，将待测样品溶液滴加到体外转录体系中，孵育后进行荧光检测；所述体外转录体系包括结合有适配体的双链dna，所述适配体控制双链dna下游荧光基因的表达。
6.优选的，所述适配体的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.优选的，所述待测样品溶液与体外转录体系的体积比为2:18。
8.优选的于，所述适配体通过碱基互补配对作用与双链dna进行结合。
9.更优选的，所述双链dna的核苷酸序列如seq id no.2所示。
10.优选的，所述体外转录体系还包括：双蒸水、缓冲液、100mm ntps、0.3u tipp、20mm荧光染料以及200u/μl t7 rna聚合酶。
11.本发明提供了一种现场快速检测食源性致病菌副溶血性弧菌的试剂盒，所述试剂盒中包括结合有适配体的双链dna，所述双链dna的下游含有荧光基团。
12.优选的，所述试剂盒还包括：双蒸水、缓冲液、ntps、tipp、荧光染料以及t7 rna聚合酶。
13.优选的，所述缓冲液包括：spermidine 20mm、tris-hcl 400mm、mgcl
2 80mm、nacl 200mm和dtt 100mm。
14.本发明还提供了上述的方法或上述的试剂盒在食品副溶血性弧菌检测中的应用。
15.本发明提供了一种现场快速检测食源性致病菌副溶血性弧菌的方法，以无细胞合
成技术为基础，制备简单、反应条件温和的体外转录体系，该体系以能够特异性识别副溶血性弧菌的适配体为控制元件，调控下游荧光基因的表达，产生绿色荧光。本发明所述方法具有制备简单、可快速现场检测、成本低、响应速度快的优势，利用适配体特异性识别副溶血性弧菌的特性，实现了对副溶血性弧菌的现场快速检测，具有灵敏度高和特异性强的特点。本发明体系简单，成分明确，在现场检测不会对环境造成二次污染，为现场检测食源性致病菌提供了一种新的方法。
附图说明
16.图1为模板质粒puc57图谱。
17.图2为pcr扩增产物纯化后测序结果图。
18.图3为nupck模拟适配体二级结构图。
19.图4为双链dna模板与适配体加热处理后凝胶电泳结果图，其中，跑道1为10μm的适配体对照，跑道2为与结合有适配体的双链dna中摩尔质量相同的适配体，跑道3、4为结合有适配体的双链dna，跑道5、6为0.5μm的双链dna和10μm的适配体混合没有经过加热过程对照，跑道7为10μm双链dna模板对照。
20.图5为反应前后荧光对比图，其中，1为阴性对照组，2和4为荧光染料背景色对照组，3为实验组。
具体实施方式
21.本发明提供了一种现场快速检测食源性致病菌副溶血性弧菌的方法，将待测样品溶液滴加到体外转录体系中，孵育后进行荧光检测；所述体外转录体系包括结合有适配体的双链dna，所述适配体控制双链dna下游荧光基因的表达。
22.本发明中，所述适配体是一段由21个碱基组成的核苷酸序列，所述适配体的核苷酸序列为：caacgaaacagtgactcgttg(seq id no.1)。本发明中，所述适配体既能够通过碱基互补配对作用与所述双链dna结合，又能够特异性识别并结合副溶血性弧菌。本发明基于所述适配体的互补dna序列和靶标之间对适配体结合位点的竞争，从而实现副溶血性弧菌的检测。具体的：当没有副溶血性弧菌时，所述适配体阻遏双链dna下游基因的表达，下游转录后能够与染料结合产生荧光的基因不被表达；当存在副溶血性弧菌时，与双链dna结合的适配体脱落，激活双链dna下游基因的转录，产生能够与染料结合的rna，产生荧光，实现食源性致病菌的检测。本发明对所述适配体的合成方法并没有特殊限定，本发明的具体实施例中，所述适配体的合成工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
23.本发明中，所述双链dna为307bp，其中含有适配体特异性结合的序列，所述双链dna的核苷酸序列为：gcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagataatacgactcactatagggagtcactgtttcccacatactctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtgtatgtgggtagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg(seq id no.2)。其中，划线部分为适配体特异性结合序列。本发明对所述双链dna的合成方法并没有特殊限定，本发明的具体实施例中，所述获得双链dna的载体构建工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
24.本发明中，所述体外转录体系还包括：双蒸水、缓冲液、ntps、tipp、荧光染料以及t7 rna聚合酶。所述缓冲液包括终浓度为20mm的spermidine、终浓度为400mm的tris-hcl、终浓度为80mm的mgcl2、终浓度为200mm的nacl和终浓度为100mm的dtt。
25.本发明将待测溶液滴加到体外转录体系中，孵育后进行荧光检测。本发明中，所述待测溶液与体外转录体系的体积比优选为2:18。本发明中，所述孵育的温度优选为35-40℃，更优选为37℃；所述孵育的时间优选为10-20min，更优选为15min。本发明中，所述荧光检测优选为紫外检测，在紫外条件下，如有肉眼可见的绿色荧光产生说明待检溶液中含有副溶血性弧菌。
26.本发明还提供了一种现场快速检测食源性致病菌副溶血性弧菌的试剂盒，所述试剂盒中包括结合有适配体的双链dna，所述双链dna的下游含有荧光基团。本发明中，所述试剂盒还包括：双蒸水、缓冲液、ntps、tipp、荧光染料以及t7 rna聚合酶。本发明中，所述荧光染料优选为dfhbi-1t，所述荧光染料的浓度优选为20mm。本发明中，所述ntps的浓度优选为100mm；所述tipp的浓度优选为0.3u；所述t7 rna聚合酶的浓度优选为200u/μl。
27.本发明还提供了上述的方法或上述的试剂盒在在食品副溶血性弧菌检测中的应用。本发明所述试剂盒体系简单、成分明确，检测的灵敏度高，特异性强，可用于现场检测，具有快速、成本低、响应速度快的优势。
28.本发明中，所用原料、试剂与设备均为已知产品，采用常规市售产品即可。
29.本发明中，所用的载体构建、提取及纯化等生物学方法，如无特殊说明，均采用本领域常规的技术手段即可。
30.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
31.实施例1
32.双链dna模板的制备
33.(1)载体质粒的选择：选取puc57质粒为目的基因的载体质粒，puc57质粒的图谱如图1所示；
34.(2)目的基因的合成与扩增：运用化学合成的方法通过脱保护—活化—偶合—封闭—氧化的循环步骤得到全长的目的基因。而后通过上下游引物对目的基因进行pcr扩增。
35.其中，引物序列为：
36.上游引物：5
’‑
gcggataacaatttcacacaggaaacagc-3’(seq id no.3)；
37.下游引物：5
’‑
caaaaaacccctcaagacccg-3’(seq id no.4)。
38.pcr扩增程序：设置为95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终止10min。
39.(3)基因连接：将质粒puc57和目的基因同时经xbal和bamhi双酶切，而后在t4dna连接酶作用下4℃连接过夜。
40.(4)将质粒转导入感受态细胞dh5α中进行保存。在得到甘油菌后利用质粒小提试剂盒(tiangen,dp103)提取得到质粒。
41.(5)使用高保真pcr试剂盒(biolabs,10104358)对dna进行pcr扩增，使用纯化试剂盒(qiagende,28104)对pcr产物进行纯化。纯化后使用nanodrop测量浓度，用双蒸水稀释至浓度为0.5μm于-20℃储存。
42.(6)将纯化的模板送样测序，测序工作交给生工生物工程(上海)股份有限公司完成，测序结果如图2所示。
43.实施例2
44.结合有适配体的双链dna的制备
45.利用selex技术体外筛选获得适配体，所述适配体二级结构通过nupck模拟获得，如图3所示。
46.在200μl离心管中按照体积比1:1加入0.5μm实施例1制备的双链dna模板和10μm的适配体，混匀。在95℃条件下加热8min，自然冷却，进行琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图4所示。使dna双链解开，适配体通过与其cdna的碱基互补作用结合到双链dna模板上，构成一条具有鼓包的双链dna，得到结合有适配体的双链dna。
47.通过图4可知，跑道3、4在结合有适配体的双链dna中，适配体对应位置条带明显比跑道1、2中适配体对照弱，说明通过加热的方式适配体与双链dna模板中的cdna结合，在没有目标物的情况下阻遏下游反应的进行。在95℃加热过程中双链dna的双链解开，自然冷却降温过程中适配体通过碱基互补与dna双链中的一段cdna结合，双链dna模板其他部位再次结合成双链，与适配体结合部位形成鼓包，阻遏转录进行，构成一条具有鼓包的双链dna。
48.实施例3
49.体外转录体系的建立
50.(1)缓冲液的制备：缓冲液成分及终浓度为：spermidine 20mm、ph 8.0的tris-hcl 400mm、mgcl
2 80mm、nacl 200mm、dtt 100mm；配制完成后冰箱4℃保存备用；
51.(2)体外转录体系的建立：在200μl离心管中依次加入双蒸水6.57μl、缓冲液2μl、100mm ntps(atp、utp、ctp、gtp)各0.57μl、0.3u tipp 0.15μl、20mm荧光染料dfhbi-1t 3μl、实施例3中结合有适配体的双链dna 4μl、200u/μl t7 rna聚合酶2μl，混合均匀后待用。
52.实施例4
53.在实施例3制备得到的体外转录体系中加入2μl水，作为阴性对照，37℃孵育15分钟，在紫外条件下进行荧光检测，得到图5(1)。在实施例3制备得到的体外转录体系中加入2μl副溶血性弧菌，作为实验组，37℃孵育15分钟后置于紫外条件下进行荧光检测，得到图5(3)。同时，取17μl双蒸水加3μl染料混合作为荧光染料背景色对照组，37℃孵育15分钟后置于紫外条件下进行荧光检测，得到图5(2)和图5(4)。
54.由图5可以看出，阴性对照组1在紫外下没有荧光产生，实验组在紫外灯下能够产生肉眼可见的荧光，即向反应体系中加入副溶血性弧菌后，在紫外灯照射下能够看到荧光产生。
55.由以上实施例可以看出，本发明所述方法以能够特异性识别副溶血性弧菌的适配体为控制元件，调控下游荧光基因的表达，产生绿色荧光，可以实现对副溶血性弧菌的检测。所述方法具有制备简单、可快速现场检测、成本低、响应速度快的优势，具有灵敏度高和特异性强的特点，实现了对副溶血性弧菌的现场快速检测。
56.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。