一种与牙槽骨结合的牙种植体表面化学改性方法和应用与流程

1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种与牙槽骨结合的牙种植体表面化学改性方法和应用。


背景技术：

2.自教授于1952年提出了骨整合的概念，并于1964年开发出了第一颗钛种植体以来，钛及其合金凭借其优良的生物相容性、耐化学腐蚀性及综合力学性能逐渐成为骨科尤其是牙科中人体硬组织替代物和修复物的首选材料，但该材料仍存在植入体失效问题。长期的临床及研究发现，现阶段致使植入体失效的主要原因在于：植入体生物活性不够理想致使硬组织植入体的骨结合能力差，与周围组织结合不佳，植入体受力后断裂及脱落；植入体表面无抗菌性致使植入体相关细菌感染发生率高。因此，对钛合金植入材料进行表面改性，从而赋予其更好的骨结合性能同时缩短修复周期是目前生物材料领域内的一个研究热点
3.目前，临床上应用最广的技术有微弧氧化、喷砂酸蚀、双酸蚀、以及羟基磷灰石喷涂技术，由于微弧氧化技术对设备要求严格，主要掌握在nobel biocare等国外公司，价格居高不下；喷砂酸蚀、双重酸蚀技术应用广泛，但存在脱落、松动等风险；羟基磷灰石喷涂技术相对于以上三种改性技术而言，虽然价格低廉，但由于存在骨吸收、涂层结合力不强等问题应用受到限制。除上述应用较多的技术外，还有等离子喷涂等处理技术，但都没有从根本上解决植入体植入初期提高植入体与牙槽骨的结合问题，即骨结合性能没有得到提升。
4.因此本领域尚需提升钛植入体的细胞相容性及骨结合性能的处理方法。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种与牙槽骨结合的牙种植体表面化学改性方法，通过在牙种植体表面形成多级微孔结构后，采用3-氨丙基三乙氧基硅烷在其表面制备自组装层，自组装层上的氨基经由化学键结合，可以有效提升亲水性。
6.本发明的另一目的在于提供上述与牙槽骨结合的牙种植体表面化学改性方法在硬组织修复提高牙种植体与牙槽骨结合界面的结合速率中的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明提供的一种与牙槽骨结合的牙种植体表面化学改性方法，包括以下步骤：
9.(1)表面处理：以钛或钛合金作为与牙槽骨结合的牙种植体，对所述牙种植体表面依次通过打磨抛光、双重酸蚀、紫外光处理和碱液处理的表面处理工序，得到表面具有亲水性多级微孔层的牙种植体；
10.(2)化学改性：对3-氨丙基三乙氧基硅烷水凝胶化处理，再将水凝胶化的3-氨丙基三乙氧基硅烷旋涂于步骤(1)表面处理后的牙种植体表面，形成若干层3-氨丙基三乙氧基硅烷自组装层。
11.优选地，采用由粗到细60#、200#、600#、1000#和2000#的梯度砂纸对所述钛或钛合
金表面进行打磨抛光。
12.优选地，所述双重酸蚀的方法包括：所述打磨抛光后的钛或钛合金用丙酮、异丙醇、无水乙醇和去离子水依次超声清洗，置于50-60℃的氢氟酸/硝酸混合酸蚀液中浸泡1-5分钟，再置于90-100℃的盐酸/硫酸混合酸蚀液中浸泡50-80分钟，取出，用去离子水、无水乙醇和去离子水依次超声清洗，得到磨砂酸蚀后的钛或钛合金。
13.优选地，所述紫外光处理和碱液处理的方法为：磨砂酸蚀后的钛或钛合金置于紫外光源下紫外光处理60-90分钟，取出，浸泡至40-60℃的碱溶液中5-10分钟，取出用去离子水、无水乙醇和去离子水依次超声清洗，得到表面具有亲水性多级微孔层的钛或钛合金；其中：所述紫外光源采用波长为315-400nm的紫外光，且紫外光源距离钛或其合金的距离为5-15cm；所述碱溶液中氢氧化钠、氢氧化钾或其混合物的浓度为1-10mol/l，氯化钠的浓度为1-5mol/l，所述表面具有亲水性多级微孔层的钛或钛合金表面的亲水角＜20
°
，微孔分布在0.1-100μm范围内。
14.优选地，所述3-氨丙基三乙氧基硅烷水凝胶化处理的方法为：将3-氨丙基三乙氧基硅烷倒入40-50℃的95％乙醇溶液中，反应10-25分钟后，加入75％的乙醇溶液反应20-40分钟，此时混合液温度保持45-65℃，得到水凝胶化的3-氨丙基三乙氧基硅烷。
15.优选地，所述旋涂的方法为：步骤(1)表面处理后的牙种植体置于旋涂仪上，将水凝胶化的3-氨丙基三乙氧基硅烷以2500-4000转/分钟旋涂20-40秒铺满所述牙种植体上，所述旋涂仪再以4500-6500转/分钟旋涂10-30秒甩掉多余溶液。
16.优选地，步骤(2)中，在步骤(1)表面处理后的牙种植体表面形成1-6层所述3-氨丙基三乙氧基硅烷自组装层。
17.本发明还提供上述与牙槽骨结合的牙种植体表面化学改性方法在硬组织修复提高牙种植体与牙槽骨结合界面的结合速率中的应用。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.一、本发明采用氢氟酸/硝酸和盐酸/硫酸两种混合酸蚀液处理得到多级微孔结构，小的微孔结构尺度在0.1-15μm，大的微孔结构尺度在15-100μm，在医学上已经被证明非常有利于成骨细胞的初期粘附，后续的紫外光及碱液处理使得钛或其合金表面的亲水性和表面能得到有效提升，亲水性可以促进早期阶段的软组织或硬组织的结合，促进骨细胞的吸附、分化及增值，羟基的存在可以促进体液中钙离子和磷酸根在种植体表面的富集，促进骨的形成。
20.二、本发明中3-氨丙基三乙氧基硅烷水凝胶化后具有一定的聚合度，与表面具有亲水性多级微孔层的钛或钛合金带有的羟基发生反应形成自组装层，表面具有亲水性多级微孔层的钛或钛合金表面产生的羟基容易发生其他反应，实际使用中利用率低，但具有一定聚合度的3-氨丙基三乙氧基硅烷自组装层上的氨基经由化学键结合，化学键结合牢固，可以有效提升亲水性，同时氨基基团被证明能有效提升骨细胞的初期粘附及后续的增殖分化，因此该涂层可以长效提升骨结合性能。
21.三、本发明中与牙槽骨结合的牙种植体表面化学改性方法简便，原料便宜，来源易得，不涉及到昂贵的装备和其他严格限制的特殊环境，符合低成本和规模化生产的经济目标，可用于硬组织修复能够有效提高临床的成功率并且有效降低牙科手术中的脱落率。
附图说明
22.图1是实施例1中钛片表面形貌的扫描电镜照片(a)钛片(pureti)；(b)磨砂双重酸蚀钛片(sla)；(c)水凝胶化3-氨丙基三乙氧基硅烷层层自组装后的钛片(silane)。
23.图2是实施例1中经水凝胶化3-氨丙基三乙氧基硅烷层层自组装后的钛片x射线光电子能谱。
24.图3是实施例2钛片的细胞黏附免疫荧光图。
25.图4是实施例3钛片的细胞增殖图。
具体实施方式
26.下面通过具体实施例对本发明进行进一步阐述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
27.实施例所使用试剂纯度均不低于其分析纯试剂纯度指标。
28.实施例1
29.本实施例提供的与牙槽骨结合的牙种植体表面化学改性方法，步骤如下：
30.(1)材料准备：将直径为6mm、厚度为3mm的圆柱状纯钛片(pureti)用由粗到细的梯度粗糙砂纸打磨抛光到镜面光亮(60#、200#、600#、1000#、2000#)，之后用去离子水、无水乙醇、去离子水在超声清洗机中依次超声清洗10分钟。
31.(2)氢氟酸/硝酸混合酸蚀液的配制：移取2ml的40％氢氟酸及4ml的浓硝酸置于40ml的去离子水中，置于磁力搅拌机上冲分混合均匀。
32.(3)盐酸/硫酸混合酸蚀液的配制：移取1ml的浓盐酸及1ml的浓硫酸置于40ml的去离子水中，置于磁力搅拌机上冲分混合均匀。
33.(4)双重酸蚀：然后将步骤(1)中处理好的钛片置于55℃的氢氟酸/硝酸混合酸蚀液中浸泡2分钟，再将其置于90-100℃的盐酸/硫酸混合酸蚀液中浸泡60分钟，之后取出清洗(用去离子水、无水乙醇、去离子水依次超声清洗)，得到磨砂酸蚀后的钛片(sla)。
34.(5)碱溶液的配制：称取8克naoh粉末及11.7克nacl粉末置于200ml的去离子水中，置于磁力搅拌机上冲分搅拌溶解。
35.(5)紫外光处理及碱液处理：将步骤(4)处理所得钛片置于紫外光/臭氧仪器下紫外光臭氧处理60分钟后，取出浸泡至45℃的碱溶液中5分钟，之后取出清洗(用去离子水、无水乙醇、去离子水依次超声清洗10分钟)，得到紫外光/碱溶液处理钛(uv)，紫外光处理应选用315-400nm范围的紫外光处理，紫外光产生装置距离钛片距离在10cm。
36.(6)硅烷的水凝胶化：将3-氨丙基三乙氧基硅烷倒入45℃的95％乙醇溶液中，反应20分钟后再加入75％的乙醇溶液反应30分钟，此时混合液温度应保持在55℃，得到水凝胶化的3-氨丙基三乙氧基硅烷。
37.(7)硅烷的层层自组装：将步骤(5)中处理好的钛片置于旋涂仪上，用移液枪移取一定量的上述步骤(6)制备的水凝胶化的3-氨丙基三乙氧基硅烷，通过旋涂的方法完成3-氨丙基三乙氧基硅烷的自组装，旋涂仪的转速为转速1和转速2，通过转速1将各溶液铺满材料，再通过转速2甩掉多余溶液，其中转速1为3500转/分钟，时间为20秒；转速2为4500转/分钟，时间为15秒。
38.(8)后处理：将步骤(7)处理好的钛片用无水乙醇冲洗3次，然后置于55℃的真空烘
箱中真空干燥15分钟，置于密封袋中真空密封保存，得到经水凝胶化3-氨丙基三乙氧基硅烷层层自组装后的钛片(silane)，即经过齿科钛种植体/骨界面的化学改性方法改性得到的钛片。
39.如图1所示，观察各样品的表面形貌，纯钛(pure ti)表面相对光滑，上面有一些划痕；磨砂双重酸蚀钛(sla)是钛片经过打磨双重酸蚀处理后的表面形貌，呈多孔状结构；经水凝胶化3-氨丙基三乙氧基硅烷层层自组装后的钛片(silane)，也即经过上述化学改性方法得到的钛片表面形貌也呈多孔状结构，同时表面多孔结构的尺寸要略大于磨砂双重酸蚀钛.
40.钛或其合金的主要元素为ti、o及其他金属元素，3-氨丙基三乙氧基硅烷的分子式为c9h
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no3si，结构式为经水凝胶化后其中的组成元素仍为c、n、o、si，其中的c、n、si元素不属于钛片基材上的元素，如图2所示的x射线光电子能谱在层层自组装后的钛片上检测到上述元素，证明3-氨丙基三乙氧基硅烷经过层层自组装成功在钛片表面形成分子层。
41.实施例2
42.细胞粘附测试
43.(1)将消毒好的实施例1中silane作为实验组，pureti、sla及uv作为对照组，每组各取3片做平行样本，放入48孔板中，每孔1片。
44.(2)将第2-4代大鼠骨髓间充质干细胞(bmscs)以5
×
104/ml的细胞密度接种于钛片表面，置于37℃、5％co2的培养箱中培养。
45.(3)细胞接种2h、4h、12h和24h后，取出48孔板，去除原培养液，磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤。
46.(4)各孔加入4％多聚甲醛，室温下固定10min。
47.(5)去除孔内的多聚甲醛，pbs洗涤，含0.1％triton x-100的pbs室温下洗涤2-4次，每次约5分钟。
48.(6)用含有1-5％bsa和0.1％triton x-100的pbs按照1:40-1:200的比例稀释actin-tracker green，稀释后的溶液即为actin-tracker green染色工作液。
49.(7)各孔加入配置好的actin-tracker green染色工作液500μl，室温避光孵育20-60分钟。
50.(8)收回actin-tracker green染色工作液，pbs洗涤，加入dapi染色液，染色5min。
51.(9)去除dapi染色液，pbs洗涤，荧光显微镜下观察。
52.如图3所示，选用的细胞为大鼠的骨髓间充质干细胞，采用的免疫荧光染料为dapi及f-actin，选取时间点为2、4、12及24小时放大倍数200倍，图中可以看出纯钛(pureti)的钛片初期(2h和4h)黏附细胞数目较少，同时细胞形态较为蜷缩，12h以后才出现明显的细胞突触以形成有效的黏附，对于细胞的黏附效果不佳；而磨砂双重酸蚀钛(sla)相较于纯钛粘附的细胞数目在初期得到一定提升；紫外光/碱溶液处理钛(uv)的初期粘附细胞数目明显提升，且在4h时已能观察到少量细胞形成细胞突触；经水凝胶化3-氨丙基三乙氧基硅烷层层自组装后的钛片(silane)组初期细胞粘附数量多，同时在4h时已能观察到大量细胞形成
细胞突触，12h时细胞形态明显发生变化(细胞转变为梭状)，对于细胞的黏附效果显著提升。
53.实施例3
54.细胞活性与增殖检测
55.(一)cck-8检测：
56.(1)将消毒好的实施例1中的silane作为实验组，pureti、sla及uv作为对照组，每组各取3片做平行样本，放入48孔板中，每孔1片。
57.(2)将第2-4代大鼠骨髓间充质干细胞(bmscs)以5
×
104/ml的细胞密度接种于钛片表面，置于37℃、5％co2的培养箱中培养。
58.(3)按cck-8：完全培养基＝1：10的比例配制cck-8溶液。
59.(4)分别在、3、5、7d取出48孔板，去除原培养液，pbs冲洗。
60.(5)每孔加入配制好的cck-8溶液500μl，放入培养箱继续孵化2h。
61.(6)取出孔板，每孔吸取100μl，转入到96孔板，使用酶标仪检测od450nm。
62.(二)edu细胞增殖实验：
63.(1)将消毒好的实施例1中的silane作为实验组，pureti、sla及uv作为对照组，每组各取3片做平行样本，放入48孔板中，每孔1片。
64.(2)将第2-4代大鼠骨髓间充质干细胞(bmscs)以5
×
104/ml的细胞密度接种于钛片表面，置于37℃、5％co2的培养箱中培养。
65.(3)按edu-8：完全培养基＝1：500的比例配制edu工作液，37℃预热。
66.(4)分别在1、3、5、7d取出孔板，等体积加入预热的edu工作液，放回培养箱孵育2h。
67.(5)edu标记细胞完成后，去除培养液，加入4％多聚甲醛，室温下固定15min。
68.(6)去除固定液，含3％bsa的pbs洗涤3次，每次3min。
69.(7)去除洗涤液，含0.3％triton x-100的pbs，室温通透孵育10min。
70.(8)去除通透液，含3％bsa的pbs洗涤3次，每次3min。
71.(9)配制click反应液；去除洗涤液，每孔加入0.5ml click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品，室温避光孵育30min。
72.(10)去除click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3min。
73.(11)去除洗涤液，加入dapi染色液，染色5min。
74.(12)去除dapi染色液，pbs洗涤，荧光显微镜下观察。
75.如图4所示，选用的细胞为大鼠的骨髓间充质干细胞，选用的试剂为cck-8，选取的时间点为1、3、5及7天，图中可以看出经水凝胶化3-氨丙基三乙氧基硅烷层层自组装后的钛片(silane)组相较于其他组在初期细胞及后期细胞数量上都存在明显的优势。
76.上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。